Immunocoloration flottante libre du cerveau des souris

Résumé

Ce protocole décrit une approche efficace et reproductible pour les études histologiques du cerveau de souris, y compris la perfusion, la section du cerveau, l’immunocoloration flottante, le montage tissulaire et l’imagerie.

Résumé

La coloration immunohistochimique du cerveau des souris est une technique de routine couramment utilisée en neurosciences pour étudier les mécanismes centraux sous-jacents à la régulation du métabolisme énergétique et d’autres processus neurobiologiques. Cependant, la qualité, la fiabilité et la reproductibilité des résultats de l’histologie cérébrale peuvent varier d’un laboratoire à l’autre. Pour chaque expérience de coloration, il est nécessaire d’optimiser les procédures clés en fonction des différences d’espèces, de tissus, de protéines ciblées et des conditions de travail des réactifs. Cet article démontre un flux de travail fiable en détail, y compris la perfusion intra-aortique, la section du cerveau, l’immunocoloration flottante librement, le montage tissulaire et l’imagerie, qui peuvent être facilement suivis par les chercheurs dans ce domaine.

Il est également question de la façon de modifier ces procédures pour répondre aux besoins individuels des chercheurs. Pour illustrer la fiabilité et l’efficacité de ce protocole, les filets périneuronaux ont été colorés avec de la glycine florbunda agglutinine (WFA) marquée à la biotine et de la vasopressine d’arginine (AVP) avec un anticorps anti-AVP dans le cerveau de la souris. Enfin, les détails critiques pour l’ensemble de la procédure ont été abordés, et les avantages de ce protocole par rapport à ceux d’autres protocoles. Pris ensemble, cet article présente un protocole optimisé pour l’immunocoloration flottante du tissu cérébral de souris. Le respect de ce protocole facilite ce processus pour les scientifiques débutants et supérieurs afin d’améliorer la qualité, la fiabilité et la reproductibilité des études immunocolorantes.

Introduction

La prévalence de l’obésité et des comorbidités associées a atteint des niveaux épidémiques, ce qui a entraîné un énorme fardeau socioéconomique1,2. Divers modèles murins ont été développés pour mieux comprendre les processus biologiques responsables de l’obésité3,4. Parce que les mécanismes centraux sont importants pour la régulation de l’homéostasie énergétique dans ces modèles animaux, les études neuroanatomiques du cerveau des souris sont devenues une technique nécessaire dans ce domaine. Cependant, la qualité, la fiabilité et la reproductibilité des techniques d’histologie cérébrale varient considérablement d’un laboratoire à l’autre et même d’un laboratoire à l’autre pour diverses raisons (p. ex., anticorps, tissus, traitements, espèces, objectifs de recherche). Par conséquent, il est nécessaire d’établir un protocole général pour les études histologiques du cerveau de la souris, y compris la perfusion, la section du cerveau, l’immunocoloration flottante librement, le montage tissulaire et l’imagerie. Pendant ce temps, les débutants peuvent rapidement apprendre, maîtriser et ajuster ce protocole pour satisfaire leurs besoins individuels.

La coloration immunohistochimique est une méthode établie qui a été largement utilisée pour visualiser des types cellulaires, des ARNm et des protéines spécifiques dans une variété de tissus (par exemple, le cerveau et les tissus périphériques)^5,6. Plus précisément, un antigène d’intérêt peut être marqué par un anticorps primaire spécifique et un anticorps secondaire correspondant lié à une enzyme (p. ex. immunohistochimie chromogène) ou à un colorant fluorescent (isothiocyanate de fluorescéine)⁶. À titre d’exemple de l’utilité de ces techniques, β-endorphine [un peptide codé par la pro-opiomélanocortine (POMC)] et le c-fos (un marqueur de l’activité neuronale) ont été colorés dans le noyau arqué. Il a été démontré que la délétion de la tryptophane hydroxylase 2 (une enzyme faisant partie intégrante de la synthèse de la sérotonine) dans le noyau du raphé dorsal diminuait l’expression de c-fos dans les neurones POMC du noyau arqué7. De plus, la distribution de l’ARNm du récepteur de la vitamine D a été cartographiée dans le cerveau de la souris par hybridation in situ (ARN)⁸. Cet article présente une méthode fiable et efficace avec un flux de travail étape par étape pour l’immunocoloration flottante librement, visant à améliorer la qualité et la reproductibilité des études histologiques du cerveau de la souris.

Protocole

Des souris C57BL/6J des deux sexes (âgées de 8 à 16 semaines) ont été utilisées dans la présente étude. Les soins de tous les animaux et de toutes les procédures ont été approuvés par les comités institutionnels de soins et d’utilisation des animaux du Baylor College of Medicine.

1. Perfusion

REMARQUE: Les étapes 1.1 à 1.6 sont effectuées dans une hotte aspirante.

1. Anesthésie
   1. Verser 5 mL d’isoflurane (voir la Table des matériaux) sur une serviette en papier placée au fond d’un dessiccateur. Introduisez la souris sur la barrière trouée à l’intérieur du dessiccateur et attendez que les signes de respiration aient disparu.
      REMARQUE: Sans respiration, la souris a encore un rythme cardiaque pendant une courte période de temps, et il sera perfusé avant la disparition du rythme cardiaque.
   2. Avant de continuer, confirmez qu’il n’y a pas de réflexe à un pincement des orteils.
   3. Fixez la souris à une planche en mousse en enfonçant une épingle à travers chaque pied. Assurez-vous que le panneau de mousse est placé dans un plateau pour recueillir les débordements de liquide.
2. Exposer le cœur
   1. Faites une incision superficielle longitudinale le long de la ligne médiane sur le thorax et l’abdomen, puis déplacez la peau de côté pour exposer la paroi musculaire du thorax et de l’abdomen. Ensuite, faites une incision dans la couche musculaire pour exposer le foie et l’intestin. Enfin, coupez la cage thoracique avec des ciseaux pour ouvrir le thorax et exposer le cœur et les poumons. Utilisez des pinces hémostatiques pour tirer la cage thoracique de côté afin d’élargir la zone de travail.
3. Prélèvement de sang terminal (facultatif)
   1. Insérez soigneusement une seringue de 1 mL (voir le tableau des matériaux) dans l’oreillette droite du cœur jusqu’à ce que la pointe soit complètement encastrée. Maintenez la seringue stable et prélevez le sang lentement jusqu’à ce que le volume souhaité soit atteint.
      REMARQUE: Veillez à ne pas pénétrer au-delà de l’oreillette droite; La collecte de 300 à 400 μL de sang est réalisable par souris adulte. Des additifs tels qu’un accélérateur de caillots ou un anticoagulant peuvent être utilisés, selon le but de la collecte de sang.
4. Mise en place de la canule de perfusion
   1. Pour les débutants, coupez un petit trou (<1 mm) dans le ventricule gauche du cœur avec des ciseaux et insérez une canule émoussée (aiguille de 18 G pour les jeunes souris et aiguille de 21 G pour les souris âgées) à travers le ventricule gauche dans l’aorte ascendante. Alternativement, pour les expérimentateurs expérimentés, pénétrer le ventricule cardiaque gauche avec une canule émoussée directement et l’insérer dans l’aorte ascendante avec soin.
   2. Placez des broches autour de la conjonction de la canule et du tube couplé sur le panneau de mousse pour empêcher tout mouvement pendant la perfusion. Alternativement, utilisez des pinces hémostatiques pour fixer la canule en place. Procéder à la coupe de l’oreillette droite pour permettre l’écoulement du sang de la circulation.
      REMARQUE: La canule de perfusion et le tube couplé sont connectés à la pompe de perfusion.
5. Perfusion avec une solution saline
   1. Allumez le pressostat salin et perfuser la souris de manière transcardique avec 40 à 60 mL de solution saline (0,9 % de NaCl : 25 °C, pH 7,4). Observez de près l’écoulement de l’oreillette droite et la couleur du foie.
      REMARQUE: Une pompe de perfusion automatisée (voir le tableau des matériaux) est utilisée pour rincer le sang dans les 1-2 minutes. Comme la plage de pression de la pompe est de 1 à 300 mmHg, la vitesse peut être ajustée en conséquence. Si une solution saline fuit du nez et/ou si le poumon est gonflé, diminuez la pression et ajustez la canule. Une fois que l’écoulement ne contient plus de sang, le cerveau est suffisamment rincé avec une solution saline. Pendant ce temps, le foie est dépourvu de sang et devient de couleur gris brunâtre.
6. Perfusion au formol
   1. Éteignez le pressostat salin et allumez le pressostat à formol pour perfuser la souris avec 40 mL de formol tamponné neutre à 10 % (10 % NBF : 25 °C, pH 6,8-7,2, voir le tableau des matériaux). Observez les membres de l’animal pour détecter des signes de tremblements.
      REMARQUE: Un mouvement de la queue peut également être observé après une perfusion de 10% NBF. MISE EN GARDE : Comme le FBN est dangereux, il est suggéré que les chercheurs portent de l’équipement de protection individuelle (p. ex., un respirateur approprié, un écran facial) tout au long de la procédure.
7. Isolement ^cérébral9
   1. Utilisez des ciseaux pour retirer la tête. Faites une incision de la ligne médiane le long du tégument pour exposer le crâne. Coupez la peau et l’attache musculaire avec des ciseaux.
   2. Faites une coupe à la crête orbitale, puis placez l’extrémité pointue des ciseaux à iris dans le foramen magnum. Avancez les ciseaux le long de la surface interne du crâne, en maintenant la pression vers le haut pour éviter d’endommager le cerveau. Retirez soigneusement les os pariétaux/frontaux et les méninges. Enfin, retirez doucement le cerveau du crâne ouvert.
8. Post-fixation
   1. Placez le cerveau dans un tube de 15 mL rempli de 10 mL de 5 % de FBN et de 15 % de saccharose pour une fixation pendant la nuit à 4 °C.
      REMARQUE : Pour préparer 10 mL de NBBF à 5 % et 15 % de saccharose, mélanger 5 mL de FBN à 10 % et 5 mL de saccharose à 30 % (p/v, dissous dans une solution saline tamponnée au phosphate (PBS), voir le Tableau des matériaux). Assurez-vous que le volume du tampon fixateur est au moins 10 fois plus grand que l’échantillon lui-même. Initialement, le cerveau flottera dans le tampon et coulera au fond après une fixation pendant la nuit.
9. Déshydratation
   1. Transférer l’échantillon de cerveau dans un tube de 15 mL rempli de 10 mL de saccharose à 30 % pour la déshydratation à 4 °C jusqu’à ce qu’il coule.

2. Cryosection (sections coronales)

1. Préparation
   1. Placez de la glace carbonique sur la plaque de réglage de la hauteur d’un microtome coulissant et attendez que le gel blanc soit visible. Étaler soigneusement 5 mL de saccharose à 30% sur le dessus de la plaque pour former une couche de base solide après la congélation complète de la solution de saccharose. Placez tous les échantillons de cerveau (jusqu’à 5 échantillons de cerveau dans un lot) horizontalement dans une ligne au-dessus du saccharose, puis ajoutez 0,5 mL de saccharose à 30% au fond de chaque cerveau.
      REMARQUE: Le cerveau adhère immédiatement à la base de saccharose congelée et gèle progressivement de bas en haut. Placez du saccharose supplémentaire autour de la partie montée du cerveau pour former une base plus robuste pour la coupe.
2. Sectionnement
   1. Après 5 à 10 minutes de congélation, lorsque le cerveau est devenu dur et blanc, coupez le cerveau jusqu’à ce que la couche / région souhaitée soit atteinte.
      REMARQUE: Ajustez la quantité de glace carbonique sur la plaque pour contrôler la température. La température est trop basse lorsque des cristaux de glace apparaissent à la surface du cerveau. La température est trop élevée lorsque le cerveau devient mou et n’est plus blanc.
   2. Passez du mode Trim au mode Feed et coupez le tissu cérébral à 25 μm d’épaisseur. Préparez une plaque de 48 puits remplie de 1x PBS et marquez cinq puits pour un cerveau de souris. Utilisez un pinceau pour collecter chaque section d’une souris et placez-la dans un puits. Collectez la section suivante de la même souris et placez-la dans le ^2ème puits.
   3. Répétez 2.2.2 jusqu’à ce que le ^5ème puits soit atteint, en plaçant les sections 6-10 dans le ^{1er-5ème puits} et ainsi de suite. Répétez la même procédure pour le reste du cerveau simultanément. Répétez jusqu’à ce que toutes les sections d’une souris soient rassemblées dans les 5 puits dans l’ordre anatomique.
      REMARQUE: Suite à cette procédure, les sections cérébrales de chaque souris sont divisées en 5 séries, qui peuvent être utilisées pour jusqu’à 5 études histologiques différentes.
3. Stockage
   1. Utilisez un pinceau pour transférer les sections de chaque puits dans un microtube de 1,5 mL rempli de tampon cryoprotecteur (20 % de glycérol, 30 % d’éthylène glycol et 50 % de PBS), et conservez les échantillons à -20 °C.
      REMARQUE: Ces sections stockées dans de petits tubes (1,5 mL) peuvent économiser de l’espace physique dans le congélateur et l’intégrité des sections peut être préservée pendant plusieurs mois.

3. Coloration WFA flottante libre et immunocoloration anti-AVP

1. Placez une passoire cellulaire dans un puits d’une plaque de culture cellulaire de 6 puits remplie de PBS et utilisez un pinceau pour transférer une série de sections du cerveau dans la passoire cellulaire. Rincez les sections dans PBS en transférant la passoire cellulaire dans un autre puits rempli de PBS. Rincer pendant 6 x 10 min sur un agitateur pour les sections stockées dans un tampon cryoprotecteur et 3 x 10 min pour les sections fraîchement coupées.
   REMARQUE: Toutes les procédures de lavage sont effectuées dans une plaque de culture cellulaire à 6 puits avec une passoire cellulaire à l’intérieur de chaque puits (voir le tableau des matériaux). Chaque passoire contient les sections cérébrales d’intérêt de chaque souris. Pour économiser les réactifs, toutes les procédures d’incubation décrites ci-dessous sont effectuées dans un tube de microcentrifugation de 1,5 mL. Entre les procédures de lavage et d’incubation, utilisez un pinceau pour transférer les sections du cerveau entre chaque passoire cellulaire et chaque tube. Pour le lavage au PBS, 12 mL sont suffisants pour chaque puits.
2. Préparer 1 mL de solution WFA marquée à la biotine (1:1 000) dans un tampon PBT (2,5 mL de Triton X-100 dissous dans 1 000 mL de PBS) dans un tube de 1,5 mL. Transférez des sections de cerveau de la crépine cellulaire au tube et incubez à température ambiante sur une plate-forme à bascule ~ 50 tr / min pendant la nuit.
3. Rincez les sections du cerveau avec du PBS pendant 3 x 10 min comme décrit au point 3.1.
4. Préparer 1 mL de streptavidine-Dylight 488 (1:500) solution dans du PBT dans un tube de 1,5 mL. Transférer des sections cérébrales dans le tube et incuber à température ambiante pendant 2 h sur une plate-forme à bascule à ~ 50 tr / min.
   REMARQUE: Couvrez la plaque avec du papier d’aluminium pour éviter l’exposition à la lumière de cette étape.
5. Rincez les sections du cerveau avec du PBS pendant 3 x 10 min. Incuber les sections du cerveau dans un tampon bloquant (3% de sérum d’âne normal dilué dans du PBT) pendant 2 h à température ambiante.
   REMARQUE: Le choix du sérum bloquant est déterminé par l’espèce à partir de laquelle l’anticorps secondaire est généré. Par exemple, si l’anticorps secondaire provient d’une chèvre, du sérum de chèvre normal doit être utilisé.
6. Incuber les sections du cerveau dans un anticorps primaire (anti-AVP de lapin, 1:500) à température ambiante sur une plate-forme à bascule à ~ 50 tr / min pendant la nuit.
   REMARQUE: Préparer les anticorps primaires et secondaires dans le tampon bloquant. La concentration, la durée de l’incubation et la température d’incubation doivent être optimisées dans les études pilotes.
7. Rincez les sections du cerveau avec du PBS pendant 3 x 10 min. Incuber les sections cérébrales dans un anticorps secondaire (Alexa Flour 594 donkey anti-rabbit IgG (H+L), 1:500) à température ambiante pendant 2 h sur une plate-forme à bascule à ~50 tr/min. Rincez les sections du cerveau avec du PBS pendant 3 x 10 min.

4. Montage

1. Remplissez deux boîtes de Petri (d’un diamètre de 150 mm) avec 100 mL de 1x PBS chacune. Transférez toutes les sections du cerveau d’une passoire dans le premier plat et alignez les sections du cerveau dans l’ordre neuroanatomique du caudal au rostral.
   REMARQUE: Pour éviter de mélanger des sections de différents animaux, montez une série de sections de cerveau d’un animal à la fois.
2. Une fois que toutes les sections du cerveau sont alignées dans le premier plat, immergez une glissière dans le deuxième plat avec une extrémité légèrement inclinée avec un support (voir Figure 1 et Figure 2). Utilisez un pinceau fin pour placer doucement une section du cerveau juste en dessous de l’interface air-tampon sur la glissière inclinée. Répétez la même procédure avec une autre section du cerveau et montez-la côte à côte avec la première section.
3. Utilisez une pipette de transfert pour retirer lentement et doucement le tampon afin d’abaisser son niveau jusqu’à ce que les deux sections du cerveau soient entièrement au-dessus de l’interface air-tampon.
   REMARQUE: Prenez soin de minimiser la perturbation de la surface tampon, sinon les sections du cerveau peuvent flotter. Une fois sèche, cette rangée de sections du cerveau adhère fermement à la glissière. Si nécessaire, ajustez doucement les sections sur la glissière pour vous assurer qu’il n’y a pas de rides ou de plis dans le tissu lorsque les sections sont encore humides.
4. Répétez ce processus jusqu’à ce que le bas de la diapositive soit atteint. Continuez à répéter jusqu’à ce que toutes les sections soient montées sur la ou les diapositives.

5. Découpage des couvertures

1. Une fois que toutes les sections ont séché (1-24 h à température ambiante), placez 80-100 μL de support de montage anti-décoloration avec DAPI (voir la table des matériaux) sur la diapositive et appliquez doucement un couvercle en verre pour couvrir les échantillons.
   REMARQUE: Appliquez le couvercle en verre avec précaution et lentement pour éviter les bulles.
2. Placez les lames dans une boîte à lames de microscope (voir la table des matériaux) et rangez-les à 4 °C.
   REMARQUE: Imagez toutes les sections dans les 1-3 jours pour éviter la décoloration de la fluorescence et le développement de l’autofluorescence.

6. Imagerie

1. Allumez le scanner et l’ordinateur (voir Tableau des matériaux). Placez les glissières dans le support de diapositive avec le dispositif de chargement et insérez le support dans le scanner.
   REMARQUE: Le scanner permet de numériser plusieurs canaux (par exemple, 4′,6-diamidino-2-phénylindole (DAPI), canaux verts et rouges) simultanément. Le scanner ne scanne les diapositives qu’avec un grossissement de 20x, et un microscope fluorescent traditionnel (voir Tableau des matériaux) peut être utilisé lorsqu’un grossissement plus élevé (par exemple, 40x) est nécessaire.
2. Ouvrez le logiciel du scanner (voir la table des matériaux). Choisissez l’emplacement de stockage et le profil d’analyse appropriés.
3. Démarrez l’analyse d’aperçu en cliquant sur le bouton Démarrer l’analyse d’aperçu . Après l’analyse d’aperçu, ouvrez l’assistant de détection de tissus et encerclez les régions d’intérêt pour l’imagerie.
4. Cliquez sur le bouton Démarrer l’analyse après avoir choisi les régions pour l’imagerie. Attendez que la machine termine la numérisation. Vérifiez le fichier de résultats et exportez les images.
   REMARQUE: Si le profil ne convient pas à la diapositive, ajustez en recentrant et en modifiant le temps d’exposition ou la force de la lumière pour adapter le profil aux tissus. Reportez-vous aux instructions du scanner pour plus de détails techniques (Tableau des matériaux).

Résultats

L’organigramme de ce protocole est brièvement illustré à la figure 1. La procédure de cryosection de ce laboratoire est illustrée à la figure 2A, dans laquelle 5 échantillons de cerveau ont été sectionnés simultanément. Le montage des sections cérébrales est illustré à la figure 2B, et une diapositive entièrement montée avec des sections cérébrales est illustrée à la figure 2C. Da...

Discussion

Ce protocole fournit une méthode établie pour les études neuroanatomiques du cerveau de la souris, y compris la perfusion, la section des tissus, l’immunocoloration flottante libre, le montage tissulaire et l’imagerie. Cependant, quelques détails clés essentiels pour des résultats cohérents et fiables doivent être optimisés.

La qualité de la perfusion est essentielle pour une coloration réussie. Les résultats de la coloration peuvent être affectés si le sang reste dans le cer...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
Alexa Flour 594 donkey anti-rabbit IgG (H+L)	Invitrogen	A21207
30% Sucrose	VWR	470302	30 g Sucrose dissoved into 100 mL of PBS
Neutral Buffered Formalin	VWR	16004-128	10%, 25 °C, pH 6.8-7.2
1 mL Sub-Q Syringe	BD	309597
48 Well Cell Culture Plate	Corning	3548
6 Well Cell Culture Plate	Corning	3516
Antifading mounting media with DAPI	Vector Laboratories	H-1200
Autoclavable plastic desiccator	Thermo Scientific Nalgene	5315-0150
AVP antibody	Phoenix Pharmaceuticals	H-065-07
Cell Strainer	Corning	431752
Cryoprotectant buffer	User preference	Not applicable	20% glycerol, 30% ethylene glycol, and 50% PBS
Isoflurane	Covetrus	11695-6777-2
Leica DFC310FX microscope	Leica	Not applicable
Microscope Slide Boxes (50-place)	VWR	Not applicable
PBT	User preference	Not applicable	2.5 mL of Triton X-100 dissolved into 1000 mL of PBS
Perfusion two automated Perfusion System	Leica	39471005
Phosphate-buffered saline (PBS) 20x	VWR	VWRVE703-1L	25 °C, pH 7.3-7.5, 1x composition:137 mM NaCl, 2.7 mM KCl, 9.8 mM Phosphate buffer
Slideing Microtome Microm HM450	ThermoFisher	Microm HM450
Sodium Chloride	RICCA Chemical	7220-32	0.9%, 25 °C, pH 7.4
Streptavidin Protein, DyLight 488	ThermoFisher	#21832
Triton X-100	Sigma-Aldrich	089k01921
WFA antibody	Sigma-Aldrich	L1516
Zeiss Axio Z1 Scanner	Zeiss	Not applicable
Zen 3.1 software			scanner software