小鼠大脑的自由漂浮免疫染色

摘要

该协议描述了一种用于小鼠脑组织学研究的有效且可重复的方法，包括灌注，脑切片，自由漂浮的免疫染色，组织安装和成像。

摘要

小鼠大脑的免疫组织化学染色是神经科学中常用的常规技术，用于研究能量代谢调节和其他神经生物学过程的潜在中枢机制。然而，脑组织学结果的质量、可靠性和可重复性可能因实验室而异。对于每个染色实验，有必要根据物种，组织，靶蛋白和试剂工作条件的差异来优化关键程序。本文详细介绍了可靠的工作流程，包括主动脉内灌注、脑切片、自由浮动免疫染色、组织安装和成像，该领域的研究人员可以轻松跟踪这些工作流程。

还讨论了如何修改这些程序以满足研究人员的个性化需求。为了说明该协议的可靠性和有效性，用生物素标记的紫藤凝集素（WFA）和精氨酸血管加压素（AVP）染色，并在小鼠大脑中用抗AVP抗体染色会阴神经网。最后，已经解决了整个过程的关键细节，以及该协议与其他协议相比的优势。综上所述，本文提出了一种用于小鼠脑组织自由漂浮免疫染色的优化方案。遵循该协议使初级和高级科学家更容易提高免疫染色研究的质量，可靠性和可重复性。

引言

肥胖和相关合并症的患病率已达到流行水平，造成巨大的社会经济负担^1，2。已经开发了各种小鼠模型，以更好地了解导致肥胖的生物过程^3，4。由于这些动物模型中的核心机制对于能量稳态的调节很重要，因此小鼠大脑的神经解剖学研究已成为该领域的必要技术。然而，由于各种原因（例如，抗体，组织，治疗，物种，研究目标），实验室甚至同一实验室内的研究人员之间的脑组织学技术的质量，可靠性和可重复性差异很大。因此，有必要为小鼠大脑的组织学研究建立一个通用方案，包括灌注，脑切片，自由漂浮的免疫染色，组织安装和成像。同时，初学者可以快速学习，掌握和调整此协议，以满足他们的个人需求。

免疫组织化学染色是一种成熟的方法，已被广泛用于可视化各种组织（例如，脑和外周^{组织）中的}特定细胞类型，mRNA和蛋白质5^，6。更具体地说，目的抗原可以通过特异性一抗和与酶（例如，显色性免疫组化）或荧光染料（荧光素异硫氰酸酯）相关联的相应二抗来标记⁶。作为这些技术实用性的一个例子，在弓形核中染色β内啡肽[由前阿片美皮质素（POMC）编码的肽]和c-fos（神经元活性的标志物）。背侧透明质核中色氨酸羟化酶2（5-羟色胺合成不可或缺的酶）的缺失被证明会降低弓形核中POMC神经元中的c-fos表达⁷。此外，通过原位杂交（RNAscope）绘制了维生素D受体mRNA在小鼠大脑中的分布^图谱8。本文提出了一种可靠而有效的方法，采用分步工作流程进行自由漂浮的免疫染色，旨在提高小鼠大脑组织学研究的质量和可重复性。

研究方案

本研究使用两性（8-16周龄）的C57BL / 6J小鼠。所有动物的护理和所有程序均由贝勒医学院的机构动物护理和使用委员会批准。

1. 灌注

注:步骤 1.1 - 1.6 在通风橱中执行。

1. 麻醉
   1. 将5mL异氟醚（见 材料表）倒入置于干燥器底部的纸巾上。将鼠标引入干燥器内的空孔屏障，并等待呼吸迹象消失。
      注意:没有呼吸，鼠标仍然有短时间的心跳，并且在心跳消失之前会灌注。
   2. 在继续之前，请确认脚趾捏合没有反射。
   3. 通过将销钉穿过每只脚，将鼠标固定在泡沫板上。确保将泡沫板放在托盘中以收集液体溢出物。
2. 露出心意
   1. 沿着胸部和腹部的中线做一个纵向的浅表切口，然后将皮肤移到一边，露出胸部和腹部的肌壁。接下来，在肌肉层做一个切口，露出肝脏和肠道。最后，用剪刀切开肋骨笼，打开胸部，露出心脏和肺部。使用止血镊子将胸腔拉到一边，以扩大工作区域。
3. 采集终末期血（可选）
   1. 将1 mL注射器（见 材料表）小心地插入心脏的右心房，直到尖端完全嵌入。保持注射器稳定，慢慢抽血，直到达到所需的体积。
      注意:注意不要穿透右心房;每只成年小鼠可采集300-400μL血液。可以使用凝块促进剂或抗凝剂等添加剂，具体取决于血液收集的目的。
4. 灌注套管的放置
   1. 对于初学者，用剪刀在心脏的左心室切一个小孔（<1毫米），并通过左心室插入钝导管（年轻小鼠为18G针头，老年小鼠为21G针头）插入升主动脉。或者，对于有经验的实验者，用钝套管直接穿透左心室，并小心地将其插入升主动脉。
   2. 在泡沫板上的套管和耦合管的连接处周围放置销钉，以防止在灌注过程中移动。或者，使用止血钳将套管固定到位。继续切开右心房，以允许血液从循环中流出。
      注:灌注套管和耦合管连接到灌注泵。
5. 盐水灌注
   1. 打开盐水压力开关，用40-60mL盐水（0.9%NaCl:25°C，pH 7.4）经心电图给小鼠。密切观察右心房的流出和肝脏的颜色。
      注意:使用自动灌注泵（见 材料表）在1-2分钟内冲洗血液。由于泵的压力范围为1-300 mmHg，因此可以相应地调节速度。如果生理盐水从鼻子漏出和/或肺部充气，请降低压力并调整套管。一旦流出物不再含有血液，大脑就会被生理盐水充分冲洗。同时，肝脏没有血液，变成棕灰色。
6. 福尔马林灌注
   1. 关闭盐水压力开关并打开福尔马林压力开关，用40 mL的10%中性缓冲福尔马林（10%NBF:25°C，pH 6.8-7.2，见 材料表）灌注小鼠。观察动物的四肢是否有震颤的证据。
      注意:输注10%NBF后也可能观察到尾部运动。注意:由于NBF是危险的，建议研究人员在整个过程中穿戴个人防护装备（例如，适当的呼吸器，面罩）。
7. 脑隔离⁹
   1. 用剪刀取下头部。沿着外皮做一个中间线切口，露出头骨。用剪刀修剪皮肤和肌肉附件。
   2. 在眶脊处做一个切口，然后将虹膜剪刀的尖锐端放入大孔中。沿着颅骨内表面推进剪刀，保持向上的压力以避免对大脑造成损害。小心地移除顶骨/额骨和脑膜。最后，轻轻地将大脑从打开的颅骨中取出。
8. 固定后
   1. 将大脑置于充满10 mL 5%NBF和15%蔗糖的15 mL管中，在4°C下固定过夜。
      注意:要制备10 mL的5%NBF和15%的蔗糖，将5 mL的10%NBF和5 mL的30%蔗糖混合（w / v，溶解在磷酸盐缓冲盐水（PBS）中，请参阅 材料表）。确保固定缓冲液的体积至少比样品本身大10倍。最初，大脑将漂浮在缓冲液中，并在过夜固定后沉入底部。
9. 脱水
   1. 将脑样品转移到充满10 mL 30%蔗糖的15 mL管中，在4°C下脱水直至下沉。

2. 冷冻切除术（冠状切片）

1. 制备
   1. 将干冰放在滑动切片机的高度调节板上，等待白色霜冻可见。在蔗糖溶液完全冷冻后，小心地将5mL 30%蔗糖铺在板的顶部，以形成一层固体碱。将所有大脑样本（一批最多5个大脑样本）水平放在蔗糖顶部的一行中，然后向每个大脑的底部加入0.5 mL的30%蔗糖。
      注意:大脑会立即粘在冷冻的蔗糖基部，并从底部到顶部逐渐冻结。在大脑的安装部分周围放置额外的蔗糖，以形成更坚固的切割基础。
2. 切片
   1. 冷冻5-10分钟后，当大脑变得坚硬和白色时，修剪大脑直到达到所需的层/区域。
      注意:调整板上的干冰量以控制温度。当冰晶出现在大脑表面时，温度太低。当大脑变得柔软并且不再变白时，温度太高。
   2. 从 修剪 模式切换到 进给 模式，并将脑组织切片至25μm厚度。准备一个装满1x PBS的48孔板，并为一个小鼠大脑标记五个孔。使用画笔从一个鼠标收集每个部分，并将其放入一个孔中。收集同一鼠标的后续部分，并将其放入第^二 个孔中。
   3. 重复2.2.2，直到达到^第5口井，将第6-10节放在^第1-5口井中，依此类推。同时对大脑的其余部分重复相同的程序。重复此步骤，直到一只小鼠的所有切片都按解剖学顺序收集到5个孔中。
      注意:在此过程之后，每只小鼠的脑切片被等分成5个系列，可用于多达5种不同的组织学研究。
3. 存储
   1. 使用画笔将每个孔中的切片转移到充满冷冻保护剂缓冲液（20%甘油，30%乙二醇和50%PBS）的1.5mL微管中，并将样品储存在-20°C。
      注意:这些切片储存在小管（1.5 mL）中可以节省冰箱中的物理空间，并且切片的完整性可以保存数月。

3. 自由漂浮的WFA染色和抗AVP免疫染色

1. 将细胞过滤器放入充满PBS的6孔细胞培养板的孔中，并使用画笔将一系列脑切片转移到细胞过滤器中。通过将细胞过滤器转移到另一个充满PBS的孔中来冲洗PBS中的切片。对于储存在冷冻保护剂缓冲液中的切片，在摇摇杯上冲洗6 x 10分钟，对于新鲜切割的部分，冲洗3 x 10分钟。
   注意:所有洗涤程序均在6孔细胞培养板中进行，每个孔内有细胞过滤器（见 材料表）。每个过滤器都保存着每只小鼠感兴趣的大脑部分。为了节省试剂，下面描述的所有孵育程序都在1.5mL微量离心管中进行。在洗涤和孵育程序之间，使用画笔在每个细胞过滤器和每个管子之间转移大脑切片。对于用PBS洗涤，每个孔12毫升就足够了。
2. 在PBT（2.5 mL Triton X-100溶解在1，000 mL PBS）缓冲液中制备1mL生物素标记的WFA（1:1，000）溶液。将大脑切片从细胞过滤器转移到管中，并在室温下在~50rpm的摇摆平台上孵育过夜。
3. 用PBS冲洗脑部3 x 10分钟，如3.1中所述。
4. 在1.5 mL管中制备1 mL链霉亲和素 - Dylight 488（1:500）PBT溶液。将大脑切片转移到管中，并在室温下以~50 rpm的摇摆平台上孵育2小时。
   注:用铝箔盖住板，以避免从此步骤向前看时暴露光线。
5. 用PBS冲洗脑部3 x 10分钟。在室温下将脑切片在封闭缓冲液（3%正常驴血清稀释在PBT中）中孵育2小时。
   注意:阻断血清的选择取决于产生二抗的种类。例如，如果二抗来自山羊，则应使用正常的山羊血清。
6. 将脑切片在室温下以~50rpm的摇摆平台上孵育一抗（兔抗AVP，1:500）过夜。
   注意:在封闭缓冲液中准备一抗和二抗。在中试研究中，需要优化浓度、孵育持续时间和孵育温度。
7. 用PBS冲洗脑部3 x 10分钟。将大脑切片在二抗（Alexa Flour 594驴抗兔IgG（H + L，1:500）中孵育，在~50 rpm的摇摆平台上室温2小时。用PBS冲洗脑部3 x 10分钟。

4. 安装

1. 将两个培养皿（直径为 150 mm）装入 100 mL，每个培养皿 1x PBS。将所有大脑切片从一个过滤器转移到第一个培养皿中，并按照神经解剖学顺序从尾部到喙部对齐大脑部分。
   注意:为避免混合来自不同动物的切片，请一次安装一个动物的一系列大脑切片。
2. 在第一个培养皿中对齐所有大脑部分后，将一个滑块浸入第二个培养皿中，一端用支架略微倾斜（见 图1 和 图2）。使用精细的画笔轻轻地将空气缓冲接口正下方的大脑部分放在倾斜的载玻片上。对另一个大脑部分重复相同的过程，并将其与第一部分并排安装。
3. 使用转移移液器缓慢而轻柔地取出缓冲液以降低其水平，直到两个大脑部分完全位于空气缓冲器接口上方。
   注意:注意尽量减少缓冲表面的干扰，否则大脑部分可能会飘走。干燥时，这一排大脑部分将牢固地粘附在幻灯片上。如有必要，轻轻调整载玻片上的部分，以确保当切片仍然潮湿时，组织中没有皱纹或褶皱。
4. 重复此过程，直到到达幻灯片的底部。继续重复，直到所有部分都安装到幻灯片上。

5. 盖玻片

1. 所有切片干燥后（室温下1-24小时），将80-100μL具有DAPI的抗褪色安装介质（见 材料表）放在载玻片上，然后轻轻地应用玻璃盖玻片覆盖样品。
   注意:小心而缓慢地使用玻璃盖玻片以避免气泡。
2. 将载玻片置于显微镜载玻片盒（见 材料表）中，并将其储存在4°C。
   注意:在1-3天内对所有切片进行成像，以避免荧光褪色和自发荧光的发展。

6. 成像

1. 打开扫描仪和计算机（请参见 材料表）。将载玻片与装载装置一起放置在载玻片支架中，然后将支架插入扫描仪中。
   注:扫描仪可同时扫描多个通道（例如，4'，6-二氨基-2-苯基吲哚（DAPI）、绿色和红色通道）。扫描仪仅以20倍的放大倍率扫描载玻片，当需要更高的放大倍率（例如，40倍）时，可以使用传统的荧光显微镜（见 材料表）。
2. 打开扫描仪的软件（请参见 材料表）。选择适当的存储位置和扫描配置文件。
3. 通过单击开始预览扫描按钮 开始预览扫描 。预览扫描后，打开 组织检测 向导并圈出感兴趣的区域以进行成像。
4. 单击 开始扫描 按钮，选择要映像的区域。等待计算机完成扫描。检查结果文件并导出图像。
   注:如果轮廓不适合载玻片，请通过重新对焦并更改曝光时间或光线强度进行调整，以使轮廓适应组织。有关更多技术详细信息，请参阅扫描仪的说明（材料表）。

结果

该协议的流程图如图 1所示。该实验室的冷冻切片程序如图 2A所示，其中同时切片了5个脑样本。图 2B显示了大脑切片的安装， 图2C显示了带有大脑切片的完全安装的载玻片。在 图3中，在Bregma -0.82 mm处观察到小鼠脑切片的代表性荧光免疫组织化学图像，在Bregma -0.82 mm处以较低和较高的?...

讨论

该协议为小鼠大脑的神经解剖学研究提供了一种既定的方法，包括灌注，组织切片，自由漂浮的免疫染色，组织安装和成像。但是，必须优化一些关键细节，这些细节对于获得一致和可靠的结果至关重要。

灌注质量对于成功染色至关重要。如果血液残留在大脑中，染色结果可能会受到影响，因为血细胞（例如红细胞）可以产生人工"阳性"染色¹⁰。我们推断存?...

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Alexa Flour 594 donkey anti-rabbit IgG (H+L)	Invitrogen	A21207
30% Sucrose	VWR	470302	30 g Sucrose dissoved into 100 mL of PBS
Neutral Buffered Formalin	VWR	16004-128	10%, 25 °C, pH 6.8-7.2
1 mL Sub-Q Syringe	BD	309597
48 Well Cell Culture Plate	Corning	3548
6 Well Cell Culture Plate	Corning	3516
Antifading mounting media with DAPI	Vector Laboratories	H-1200
Autoclavable plastic desiccator	Thermo Scientific Nalgene	5315-0150
AVP antibody	Phoenix Pharmaceuticals	H-065-07
Cell Strainer	Corning	431752
Cryoprotectant buffer	User preference	Not applicable	20% glycerol, 30% ethylene glycol, and 50% PBS
Isoflurane	Covetrus	11695-6777-2
Leica DFC310FX microscope	Leica	Not applicable
Microscope Slide Boxes (50-place)	VWR	Not applicable
PBT	User preference	Not applicable	2.5 mL of Triton X-100 dissolved into 1000 mL of PBS
Perfusion two automated Perfusion System	Leica	39471005
Phosphate-buffered saline (PBS) 20x	VWR	VWRVE703-1L	25 °C, pH 7.3-7.5, 1x composition:137 mM NaCl, 2.7 mM KCl, 9.8 mM Phosphate buffer
Slideing Microtome Microm HM450	ThermoFisher	Microm HM450
Sodium Chloride	RICCA Chemical	7220-32	0.9%, 25 °C, pH 7.4
Streptavidin Protein, DyLight 488	ThermoFisher	#21832
Triton X-100	Sigma-Aldrich	089k01921
WFA antibody	Sigma-Aldrich	L1516
Zeiss Axio Z1 Scanner	Zeiss	Not applicable
Zen 3.1 software			scanner software