JoVE Logo
Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • النتائج
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

تستخدم مزارع الخلايا الدبقية الصغيرة الأولية بشكل شائع لتقييم الجزيئات الجديدة المضادة للالتهابات. يصف البروتوكول الحالي طريقة قابلة للتكرار وذات صلة لعزل الخلايا الدبقية الصغيرة مغناطيسيا عن صغار حديثي الولادة.

Abstract

تعتبر الخلايا الدبقية الصغيرة ، باعتبارها بلاعم مقيمة في الدماغ ، أساسية للعديد من الوظائف ، بما في ذلك الاستجابة للإجهاد البيئي وتوازن الدماغ. يمكن أن تتبنى الخلايا الدبقية الصغيرة مجموعة كبيرة من الأنماط الظاهرية للتنشيط. علاوة على ذلك ، ترتبط الخلايا الدبقية الصغيرة التي تؤيد النمط الظاهري المؤيد للالتهابات بكل من اضطرابات النمو العصبي والاضطرابات التنكسية العصبية. تستخدم الدراسات في المختبر على نطاق واسع في البحث لتقييم الاستراتيجيات العلاجية المحتملة في أنواع معينة من الخلايا. في هذا السياق ، تعد دراسة تنشيط الخلايا الدبقية الصغيرة والالتهاب العصبي في المختبر باستخدام مزارع الخلايا الدبقية الصغيرة الأولية أكثر أهمية من خطوط الخلايا الدبقية الصغيرة أو الخلايا الدبقية الصغيرة المشتقة من الخلايا الجذعية. ومع ذلك ، قد يعاني استخدام بعض الثقافات الأولية من نقص التكاثر. يقترح هذا البروتوكول طريقة قابلة للتكرار وذات صلة لعزل الخلايا الدبقية الصغيرة مغناطيسيا عن صغار حديثي الولادة. يتم هنا توضيح التنشيط الدبقي الصغير باستخدام العديد من المحفزات بعد 4 ساعات و 24 ساعة عن طريق القياس الكمي لتعبير mRNA ومقايسة البلعمة Cy3-bead. من المتوقع أن يوفر العمل الحالي تقنية قابلة للتكرار بسهولة لعزل الخلايا الدبقية الصغيرة ذات الصلة من الناحية الفسيولوجية عن مراحل نمو الأحداث.

Introduction

الخلايا الدبقية الصغيرة هي الخلايا الشبيهة بالبلاعم المقيمة في الجهاز العصبي المركزي المشتقة من السلائف الكريات الحمر لكيس الصفار التي تهاجر إلى الظهارة العصبية أثناء التطور الجنيني المبكر1. بصرف النظر عن وظائف المناعة ، فإنها تلعب أيضا دورا مهما أثناء النمو العصبي ، خاصة في تكوين المشابك ، والتوازن العصبي ، والميالين2. في مرحلة البلوغ ، تطور الخلايا الدبقية الصغيرة عمليات خلوية طويلة لمسح البيئة بشكل مستمر. في حالة تمزق التوازن مثل إصابة الدماغ أو أمراض الدماغ ، يمكن للخلايا الدبقية الصغيرة تغيير مظهرها المورفولوجي لتبني شكل أميبي ، والهجرة إلى المنطقة المصابة ، وزيادة وإطلاق العديد من العوامل الواقية للخلايا أو السامة للخلايا. الخلايا الدبقية الصغيرة لها حالات تنشيط غير متجانسة اعتمادا على مرحلة نموها ونوع الإصابة التي لحقتبها 3،4،5. في هذه الدراسة ، يتم تصنيف حالات التنشيط هذه على نطاق واسع إلى ثلاثة أنماط ظاهرية مختلفة: مؤيدة للالتهابات / البلعمة ، ومضادة للالتهابات ، ومنظمة مناعية ، مع الأخذ في الاعتبار أنه في الواقع ، من المرجح أن يكون الوضع أكثر تعقيدا6.

يمكن أن تكون الدراسة في الجسم الحي لتنشيط الخلايا الدبقية الصغيرة وفحص استراتيجيات الحماية العصبية في المراحل المبكرة من نمو الدماغ صعبة بسبب (1) هشاشة الحيوانات قبل الفطام و (2) انخفاض عدد الخلايا الدبقية الصغيرة. لذلك تستخدم الدراسات في المختبر على الخلايا الدبقية الصغيرة على نطاق واسع للسمية7،8،9 ، واستراتيجيات الحماية العصبية5،10،11،12،13،14 ، والثقافات المشتركة15،16،17،18،19،20،21 . يمكن أن تستخدم الدراسات في المختبر إما خطوط الخلايا الدبقية الصغيرة أو الخلايا الدبقية الصغيرة المشتقة من الخلايا الجذعية أو ثقافة الخلايا الدبقية الصغيرة الأولية. كل هذه الأساليب لها مزايا وعيوب ، ويعتمد الاختيار على السؤال البيولوجي الأولي. فوائد استخدام مزارع الخلايا الدبقية الصغيرة الأولية هي الخلفية الوراثية المتجانسة ، والتاريخ الخالي من مسببات الأمراض ، والتحكم في الوقت الذي يتم فيه تحفيز الخلايا الدبقية الصغيرة بعد موت الحيوان22.

على مر السنين، تم تطوير طرق مختلفة (قياس التدفق الخلوي، أو الاهتزاز، أو وضع العلامات المغناطيسية) لزراعة الخلايا الدبقية الصغيرة الأولية من القوارض، سواء حديثي الولادة أو البالغين 23،24،25،26،27،28،29. في العمل الحالي، يتم عزل الخلايا الدبقية الصغيرة من صغار الفئران حديثي الولادة باستخدام تقنية فرز الخلايا المنشطة مغناطيسيا الموصوفة سابقا باستخدام CD11b25،27،29 المضاد للفأر المغلف بالميكروبيدات. CD11b هو مستقبل إنتغرين يتم التعبير عنه على سطح الخلايا النخاعية ، بما في ذلك الخلايا الدبقية الصغيرة. عندما لا يكون هناك تحد التهابي داخل الدماغ ، فإن جميع خلايا CD11b + تقريبا هي الخلايا الدبقية الصغيرة30. بالمقارنة مع الطرق الأخرى المنشورة سابقا 23،24،25،26،27،28،29 ، يوازن البروتوكول الحالي بين تحليلات التنشيط الفوري للخلايا الدبقية الصغيرة خارج الجسم الحي وزراعة الخلايا الدبقية الصغيرة الأولية الشائعة في المختبر. وبالتالي ، فإن الخلايا الدبقية الصغيرة (1) معزولة في يوم ما بعد الولادة (P) 8 دون إزالة المايلين ، (2) مستنبتة بدون مصل ، و (3) تتعرض إما ل siRNA و miRNA و / أو مركب دوائي و / أو محفزات التهابية بعد 48 ساعة فقط من عزل الدماغ. كل جانب من هذه الجوانب الثلاثة يجعل البروتوكول الحالي مناسبا وسريعا. بادئ ذي بدء ، يسمح استخدام الخلايا الدبقية الصغيرة لدى الأطفال بالحصول على خلايا ديناميكية وتفاعلية قابلة للحياة في الثقافة دون الحاجة إلى خطوة إضافية لإزالة الميالين يمكن أن تعدل تفاعل الخلايا الدبقية الصغيرة في المختبر. يهدف البروتوكول الحالي إلى الاقتراب قدر الإمكان من البيئة الفسيولوجية للخلايا الدبقية الصغيرة. في الواقع ، لا تواجه الخلايا الدبقية الصغيرة مصلا أبدا ، ولا يتطلب هذا البروتوكول استخدام المصل أيضا. علاوة على ذلك ، فإن تعريض الخلايا الدبقية الصغيرة في وقت مبكر من 48 ساعة بعد الثقافة يمنعهم من فقدان كلياتهم الفسيولوجية.

Protocol

تمت الموافقة على البروتوكول ، وتم التعامل مع جميع الحيوانات وفقا للمبادئ التوجيهية المؤسسية للمعهد الوطني للصحة والبحوث العلمية (Inserm ، فرنسا). يتم تقديم العزل المغناطيسي للخلايا الدبقية الصغيرة من أدمغة 24 من جراء الفئران OF1 (ذكورا وإناثا) في P8 ، مقسمة إلى 6 آبار أو 12 بئرا أو 96 بئرا. تم تنفيذ العمل التجريبي تحت غطاء محرك السيارة للحفاظ على ظروف معقمة.

1. إعداد حلول معقمة للعزل وزراعة الخلايا

  1. قم بإعداد 50 مل من محلول الملح المتوازن 1x Hanks (HBSS) بدون Ca 2+ و Mg2+ (HBSS-/-) من محلول 10x المتاح تجاريا (انظر جدول المواد).
  2. تحضير خليط التفكك وفقا للتركيب الوارد في الجدول 1 باستخدام مجموعة تفكك الأنسجة المتاحة تجاريا (انظر جدول المواد).
  3. قم بإعداد 200 مل من 1x HBSS مع Ca 2+ و Mg2+ (HBSS +/+) من حل 10x المتاح تجاريا.
  4. قم بإعداد 200 مل من 1x PBS + 0.5٪ BSA (يشار إليه باسم المخزن المؤقت لفرز الخلايا).
  5. تحضير ميكروبيدات CD11b وفقا للجدول 2.
  6. تحضير 500 مل من وسط الاستزراع الخالي من البلاعم في المصل (SFM) + 1٪ من البنسلين الستربتومايسين (P / S). اصنع حصصا من أنابيب سعة 50 مل وقم بتخزينها في 4 درجات مئوية. يشار إلى هذا باسم وسط الخلايا الدبقية الصغيرة لاحقا في النص.
    ملاحظة: يجب تحضير جميع محاليل العزل طازجة في ظل ظروف معقمة في يوم التجربة وحفظها على الجليد. يمكن تحضير وسط زراعة الخلايا الدبقية الصغيرة ، واقتباسه في أنابيب سعة 50 مل ، والاحتفاظ به عند 4 درجات مئوية للاستخدام في المستقبل. ليست هناك حاجة للترشيح.

2. تشريح الدماغ

  1. قطع رأس الجرو باستخدام مقص كبير دون تخدير عام سابق.
  2. قطع الجلد من الرقبة إلى الأنف بعد الخيط السهمي (15-20 مم) بمقص صغير (الشكل 1A-C).
  3. أدخل أطراف مقص صغيرة داخل الثقبة العظمى الموازية للجمجمة. قطع من كل جانب بعناية إلى العينين (الشكل 1D ، E).
  4. قطع بين العينين بمقص صغير لفصل الجمجمة والدماغ عن الرأس (الشكل 1F).
  5. باستخدام ملقطين ، أمسك الجمجمة بالقرب من المصابيح الشمية وقم بتمزيق الجمجمة بعناية ، مع الحرص على عدم إتلاف الدماغ الأساسي (الشكل 1G-I).
  6. قم بإزالة المخيخ والبصلة الشمية بشفرة حلاقة وقطع الدماغ إلى قطعتين (الشكل 1J).
  7. ضع قطع الدماغ في طبق بتري يحتوي على 30-40 مل من HBSS-/- (الشكل 1K).

3. تفكك الدماغ وعزل الخلايا الدبقية الصغيرة المغناطيسية

ملاحظة: يجب إجراء جميع عمليات التلاعب بالخلايا وتعليقها باستخدام ماصة سعة 1000 ميكرولتر بحذر شديد. قد يؤدي تطبيق إجراء ميكانيكي عالي إلى تنشيط أو قتل الخلايا الدبقية الصغيرة.

  1. نقل 12 قطعة دماغية (~ 1.2 جم) لكل أنبوب تفكك يحتوي على خليط تفكك وفقا للجدول 1. بالنسبة ل 24 جروا ، كانت هناك حاجة إلى أربعة أنابيب C (الشكل 2 أ - ب).
  2. ضع C-Tubes على جهاز الانفصال (مع وضع التسخين). ابدأ برنامج NTDK المحسن في الجهاز وفقا لتعليمات الشركة المصنعة (الشكل 2D).
  3. جهاز طرد مركزي عند 300 × جم لمدة 20 ثانية (عند 4 درجات مئوية) لجمع كل الخلايا. أكمل التفكك الميكانيكي عن طريق السحب ثلاث مرات لأعلى ولأسفل باستخدام ماصة 1000 ميكرولتر (الشكل 2E).
  4. نقل الخلايا إلى أربعة أنابيب 15 مل + مصافي. اشطف المصافي ب 10 مل من HBSS +/+ (الشكل 2F).
  5. جهاز طرد مركزي عند 300 × جم لمدة 10 دقائق (عند 4 درجات مئوية) وإزالة المادة الطافية. أعد تعليق الحبيبات بعناية باستخدام 10 مل من HBSS +/+ (الشكل 2G).
  6. جهاز طرد مركزي عند 300 × جم لمدة 10 دقائق (عند 4 درجات مئوية) وإزالة المادة الطافية. أعد تعليق الحبيبات بعناية باستخدام 6 مل من مخزن الفرز المؤقت (الخطوة 1.4) (الشكل 2H).
  7. جهاز طرد مركزي عند 300 × جم لمدة 10 دقائق (عند 4 درجات مئوية) وإزالة المادة الطافية. أضف 200 ميكرولتر من محلول ميكروبيدات CD11b (الخطوة 1.5) لكل أنبوب وأعد تعليقه بعناية (الشكل 2I).
  8. احتضان الأنابيب لمدة 15-20 دقيقة عند 4 درجات مئوية. أعد تعليق الحبيبات بعناية باستخدام 6 مل من مخزن الفرز المؤقت (الشكل 2I-J).
  9. جهاز طرد مركزي عند 300 × جم لمدة 10 دقائق (عند 4 درجات مئوية) وإزالة المادة الطافية. أعد تعليق الحبيبات بعناية باستخدام 8 مل من مخزن الفرز المؤقت (الشكل 2K).
  10. اتبع برنامج POSSEL على الفاصل (انظر جدول المواد) لإعداد ثمانية أعمدة. نقل الخلايا 1 مل في 1 مل على العمود. انتظر حتى تمر جميع الخلايا قبل إضافة مل آخر. خلايا Elute CD11b + على لوحة شطف معقمة مع 1 مل من مخزن الفرز المؤقت (الشكل 2L).
  11. تجمع خلايا CD11b + في أنبوب جديد سعة 50 مل (الشكل 2M).
  12. جهاز طرد مركزي عند 300 × جم لمدة 10 دقائق (عند 4 درجات مئوية) وإزالة المادة الطافية. أعد تعليق الحبيبات بعناية باستخدام 10 مل من وسط الخلايا الدبقية الصغيرة الباردة (الخطوة 1.6) (الشكل 2N).
  13. عد خلايا CD11b +. في P8 ، يجب على المرء الحصول على ~ 650,000 خلية لكل دماغ.
    ملاحظة: في البروتوكول الحالي، تم عد الخلايا باستخدام عداد خلايا آلي (انظر جدول المواد).
  14. أعد تعليق الخلايا في وسط الخلايا الدبقية الصغيرة الباردة إلى التركيز النهائي من 650,000-700,000 خلية / مل واستغني عنها في ألواح زراعة الخلايا.
    ملاحظة: الألواح المكونة من 6 آبار مخصصة للبقع الغربية (2 مل لكل بئر) ؛ الألواح المكونة من 12 بئرا مخصصة لتحليل RT-qPCR (1 مل لكل بئر) ، والألواح المكونة من 96 بئرا مخصصة للمقايسة البلعمية (250 ميكرولتر لكل بئر) ؛ تم استخدام الثلاثة لهذا العمل. ومع ذلك ، في هذه المخطوطة ، لا يتم عرض نتائج تحليل Western Blot ، ولكن من الممكن تنفيذ هذا البروتوكول.
  15. ضع الألواح عند 37 درجة مئوية مع 5٪ CO2 طوال الليل. قم بتغيير الوسط بعناية باستخدام ماصة 1000 ميكرولتر مع وسط الخلايا الدبقية الصغيرة المسخن مسبقا.
  16. ضع الألواح عند 37 درجة مئوية مع 5٪ CO2 طوال الليل قبل التحفيز.
    ملاحظة: لا ينصح بعزل الخلايا الدبقية الصغيرة من أكثر من 36 جروا وبعد P9. هذا سيزيد من خطر التلوث وتراكم حطام الخلايا لتنشيط الخلايا الدبقية الصغيرة.

4. تحفيز الخلايا

  1. إعداد كواشف التحفيز وفقا للجدول 3 باستخدام الكواشف المتاحة تجاريا (انظر جدول المواد).
  2. أضف الحجم المناسب في كل بئر محفز.
    ملاحظة: يعتمد الحجم المناسب على تركيز التحفيز وحجم البئر.
  3. ضع الألواح عند 37 درجة مئوية مع 5٪ CO2حتى نهاية التحفيز عند 6 ساعات أو 24 ساعة أو 48 ساعة.
  4. لتحليل اللطخة الغربية ، استنشاق المادة الطافية وإضافة 50 ميكرولتر من محلول تحلل البروتين (انظر جدول المواد) باستخدام ماصة. باستخدام النصائح ، خدش الجزء السفلي من اللوحة لفصل الخلايا المحللة ونقلها إلى أنابيب سعة 1.5 مل. يحفظ في درجة حرارة -80 درجة مئوية.
    ملاحظة: يمكن تخزين ألواح الاستزراع لسنوات عند -80 درجة مئوية إذا تم استنشاق المادة الطافية بشكل صحيح.
  5. لتحليل RT-qPCR6،31 ، قم بشفط المادة الطافية وتخزين ألواح الاستزراع مباشرة عند -80 درجة مئوية حتى استخراج mRNA (الخطوة 5).
  6. للاطلاع على فحص الخلايا البلعمية، يرجى الاطلاع على الخطوة 6.

5. استخراج mRNA وتحليل RT-qPCR

  1. قم بإجراء استخراج الحمض النووي الريبي و RT-PCR و RT-qPCR باتباع بروتوكول الشركة المصنعة (انظر جدول المواد). راجع الجدول 4 للحصول على تسلسلات التمهيدي5،6،31.
  2. قم بإجراء تحليل RT-qPCR باتباع التقرير المنشور مسبقا5.

6. مقايسة البلعمة

  1. تحفيز الخلايا وإجراء فحص البلعمة خلال آخر 3 ساعات من التحفيز. على سبيل المثال ، لتحفيز 6 ساعات ، ابدأ الفحص البلعمي بعد 3 ساعات من التحفيز ؛ ولتحفيز 12 ساعة ، ابدأ الفحص البلعمي بعد 9 ساعات من بداية التحفيز.
  2. احسب عدد الخرز اللازم للتحضير مع مراعاة النسبة (1 خلية: 50 حبة). بالنسبة لبئر واحد من لوحة 96 بئرا ، يلزم وجود خرز 8.1 × 106 . تحضير خليط الخرز وفقا للجدول 5.
    ملاحظة: دوامة بعناية قارورة مخزون الخرز قبل إضافتها إلى خليط PBS / FBS.
  3. احتضان لمدة 1 ساعة في حمام مائي عند 37 درجة مئوية. دوامة كل 10 دقائق.
  4. احسب حجم المحلول لإضافته إلى كل بئر. أضف المحلول واحتضانه لمدة 3 ساعات.
  5. شطف الآبار ثلاث مرات مع 1x PBS. اقرأ انبعاث التألق عند 550 نانومتر (الطول الموجي لانبعاث Cy3).

7. مراقبة جودة النقاء

  1. تقييم نقاء العزل المغناطيسي CD11b عن طريق قياس التدفق الخلوي (FACS) (قبل وبعد فرز الخلايا) ، ثم إجراء RT-qPCR.
    1. عد الخلايا وأعد تعليقها في المخزن المؤقت FACS (PBS + 2 mM من EDTA + 0.5٪ من ألبومين مصل البقري) من أجل الحصول على تخفيف 10 × 106 خلايا / مل بعد الخطوة 3.5 والخطوة 3.14.
    2. بعد 15 دقيقة من حجب Fc التقليدي 32,33 ، احتضان الخلايا لمدة 15 دقيقة باستخدام مسبار الصلاحية (FVS780) والأجسام المضادة المترافقة بالفلوروفور ضد الماوس CD45 و CD11b و CX3CR1 و ACSA-2 و O4 أو أنماط التحكم المقابلةلها 32,33 بالتركيز الموصى به من قبل الشركات المصنعة (انظر جدول المواد).
    3. اغسل الخلايا باستخدام مخزن FACS المؤقت ، وقم بإصلاحها ، ونفاذها باستخدام مجموعة النفاذية المتاحة تجاريا (انظر جدول المواد).
    4. قم بإجراء حجب Fc مرة أخرى على الخلايا المخترقة ، ثم احتضان الجسم المضاد المترافق بالفلوروفور ضد NeuN (انظر جدول المواد) أو النمط المتماثل للتحكم لمدة 15 دقيقة.
    5. قم بإجراء تحليل FACS بعد الغسيل باستخدام المخزن المؤقت لنظام FACS.
    6. بعد استبعاد الثنائيات والخلايا الميتة بناء على المعلمات المورفولوجية وتلطيخ FVS780 ، على التوالي ، حدد استراتيجية البوابة للتعبير السطحي ل CX3CR1 (الخلايا الدبقية الصغيرة) ، ACSA-2 (الخلايا النجمية) ، O4 (oligodendrocytes) ، والوجود داخل الخلايا من NeuN (الخلايا العصبية) لتحليل النسبة المئوية للخلايا الإيجابية.
  2. باتباع الخطوة 5 ، قم باستخراج mRNA وإجراء RT-qPCR لتحديد Itgam (CD11b) و Cx3cr1 و Olig2 و Synaptophysin و Gfap mRNA. تطبيع Cq باستخدام Rpl13a mRNA كمراسل ، وإجراء تعبير نسبي ل Itgam mRNA.

النتائج

الخلايا الدبقية الصغيرة هي البلاعم المقيمة في الجهاز العصبي المركزي والتي يتم تنشيطها عند تعرضها لتحديات بيئية (صدمة ، جزيئات سامة ، التهاب) 4،5،6،34 (الشكل 3 أ). تستخدم الدراسات في المختبر حول الخلاي?...

Discussion

يقدم العمل الحالي ثقافة الخلايا الدبقية الصغيرة الأولية باستخدام خلايا CD11b + المصنفة مغناطيسيا. بالإضافة إلى التقييم الوظيفي الدبقي الصغير (RT-qPCR والمقايسات البلعمية) ، تم أيضا تحديد نقاء ثقافة الخلايا الدبقية الصغيرة.

عادة ما يتم إنشاء مزارع الخلايا الدبقية الصغيرة الكلاس?...

Disclosures

يعلن المؤلفون عدم وجود تضارب في المصالح.

Acknowledgements

تم إنشاء الأشكال باستخدام BioRender. يتم تمويل البحث من قبل Inserm ، جامعة باريس ، Horizon 2020 (PREMSTEM-874721) ، مؤسسة فرنسا ، مؤسسة ARSEP ، مؤسسة البحوث حول سيرفو ، مؤسسة نعمة موناكو ، ومنحة إضافية من Investissement d'Avenir -ANR-11-INBS-0011-NeurATRIS and Investissement d'Avenir -ANR-17-EURE-001-EUR G.E.N.E.

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
Anti mouse ACSA-2 PE Vio 615Miltenyi Biotec130-116-246
Anti mouse CD11b BV421Sony Biotechnology1106255
Anti mouse CD45 BV510Sony Biotechnology1115690
Anti mouse CX3CR1 PE Cy7Sony Biotechnology1345075
Anti mouse NeuN PEMilli-MarkFCMAB317PE
anti mouse O4 Vio Bright B515Miltenyi Biotec130-120-016
BD Cytofix/Cytoperm permeabilization kitBD Biosciences554655
Bovine Serum AlbuminMiltenyi Biotec130-091-376
CD11b (Microglia) MicroBeads, h, mMiltenyi Biotec130-093-634
Confocal microscopeLeica TCS SP8
D-PBS (10x)Thermo Scientific14200067
EDTASigma-AldrichE1644
Falcon Cell culture 12-well plate, flat bottom + lidDutscher353043
Falcon Cell culture 96-well plate, flat bottom + lidDutscher353072
Falcon tubes 50 mLDutscher352098
Fc blocking reagent (Mouse CD16/32)BD Biosciences553142
Fluorescence microscopeNikon ECLIPSE TE300
gentleMACS C Tubes (4 x 25 tubes)Miltenyi Biotec130-096-334
gentleMACS Octo Dissociator with HeatersMiltenyi Biotec130-096-427
Hanks' Balanced Salt Solution (HBSS) +CaCl2 +MgCl2 10xThermo Scientific14065049
Hanks' Balanced Salt Solution (HBSS) -CaCl2 -MgCl2 10xThermo Scientific14185045
iQ SYBR Green SupermixBio-rad1725006CUST
Iscript c-DNA synthesisBio-rad1708890
Latex beads, amine-modified polystyrene, fluorescent redSigma-AldrichL2776-1mL
Lipopolysaccharides (LPS) from Escherichia coli O55:B5Sigma-AldrichL2880
Macrophage-SFM serum-free mediumThermo Scientific12065074
MACS BSA Stock SolutionMiltenyi Biotec130-091-376
MACS SmartStrainers (70 μm), 4 x 25 pcsMiltenyi Biotec130-110-916
Mouse IgG1 PEMilliporeMABC002H
Mouse IgG2a PE Cy7Sony Biotechnology2601265
Mouse IL1 betaMiltenyi Biotec130-101-684
Multi-24 Column BlocksMiltenyi Biotec130-095-691
MultiMACS Cell24 SeparatorMiltenyi Biotec
Neural Tissue Dissociation Kit - PapainMiltenyi Biotec130-092-628
Nucleocounter NC-200Chemometec
Nucleospin RNA Plus XSMacherey Nagel740990.5
Nun EZFlip Top Conical Centrifuge TubesThermo Scientific362694
OPTILUX Petri dish - 100 x 20 mmDutscher353003
Pénicilline-streptomycine (10 000 U/mL)Thermo Scientific15140122
Rat IgG2b, k BV421BD Biosciences562603
Rat IgG2b, k BV510Sony Biotechnology2603230
REA control (S) PE vio 615Miltenyi Biotec130-104-616
REA control (S) Vio Bright B515Miltenyi Biotec130-113-445
Recombinant Mouse IFN-gamma ProteinR&D System485-MI
Recombinant Mouse IL-10 ProteinR&D System417-ML
Recombinant Mouse IL-4 ProteinR&D System404-ML
RIPA BufferSigma-AldrichR0278
Viability probe (FVS780)BD Biosciences565388

References

  1. Kierdorf, K., et al. Microglia emerge from erythromyeloid precursors via Pu.1- and Irf8-dependent pathways. Nature Neuroscience. 16 (3), 273-280 (2013).
  2. Wright-Jin, E. C., Gutmann, D. H. Microglia as dynamic cellular mediators of brain function. Trends in Molecular Medicine. 25 (11), 967-979 (2019).
  3. Hellstrom Erkenstam, N., et al. Temporal characterization of microglia/macrophage phenotypes in a mouse model of neonatal hypoxic-ischemic brain injury. Frontiers in Cellular Neuroscience. 10, 286 (2016).
  4. Chhor, V., et al. Role of microglia in a mouse model of paediatric traumatic brain injury. Brain, Behavior, and Immunity. 63, 197-209 (2017).
  5. Van Steenwinckel, J., et al. Decreased microglial Wnt/beta-catenin signalling drives microglial pro-inflammatory activation in the developing brain. Brain. 142 (12), 3806-3833 (2019).
  6. Chhor, V., et al. Characterization of phenotype markers and neuronotoxic potential of polarised primary microglia in vitro. Brain, Behavior, and Immunity. 32, 70-85 (2013).
  7. Di Pietro, P., et al. Bisphenol A induces DNA damage in cells exerting immune surveillance functions at peripheral and central level. Chemosphere. 254, 126819 (2020).
  8. Roque, P. J., Dao, K., Costa, L. G. Microglia mediate diesel exhaust particle-induced cerebellar neuronal toxicity through neuroinflammatory mechanisms. Neurotoxicology. 56, 204-214 (2016).
  9. Yun, H. S., Oh, J., Lim, J. S., Kim, H. J., Kim, J. S. Anti-inflammatory effect of wasp venom in BV-2 microglial cells in comparison with bee venom. Insects. 12 (4), 297 (2021).
  10. Nair, S., et al. Lipopolysaccharide-induced alteration of mitochondrial morphology induces a metabolic shift in microglia modulating the inflammatory response in vitro and in vivo. Glia. 67 (6), 1047-1061 (2019).
  11. Fleiss, B., et al. The anti-inflammatory effects of the small molecule pifithrin-micro on BV2 microglia. Developmental Neuroscience. 37 (4-5), 363-375 (2015).
  12. Dean, J. M., et al. Microglial MyD88 signaling regulates acute neuronal toxicity of LPS-stimulated microglia in vitro. Brain, Behavior, and Immunity. 24 (5), 776-783 (2010).
  13. Tang, Y., Wolk, B., Nolan, R., Scott, C. E., Kendall, D. A. Characterization of subtype selective cannabinoid CB2 receptor agonists as potential anti-inflammatory agents. Pharmaceuticals (Basel). 14 (4), 378 (2021).
  14. Liu, C. P., et al. miR146a reduces depressive behavior by inhibiting microglial activation. Molecular Medicine Reports. 23 (6), 463 (2021).
  15. Aquino, G. V., Dabi, A., Odom, G. J., Zhang, F., Bruce, E. D. Evaluating the endothelial-microglial interaction and comprehensive inflammatory marker profiles under acute exposure to ultrafine diesel exhaust particles in vitro. Toxicology. 454, 152748 (2021).
  16. You, J. E., Jung, S. H., Kim, P. H. The effect of Annexin A1 as a potential new therapeutic target on neuronal damage by activated microglia. Molecules and Cells. 44 (4), 195-206 (2021).
  17. Xie, Z., et al. By regulating the NLRP3 inflammasome can reduce the release of inflammatory factors in the co-culture model of tuberculosis H37Ra strain and rat microglia. Frontiers in Cellular and Infection Microbiology. 11, 637769 (2021).
  18. Ogunrinade, F. A., et al. Zanthoxylum zanthoxyloides inhibits lipopolysaccharide- and synthetic hemozoin-induced neuroinflammation in BV-2 microglia: roles of NF-kappaB transcription factor and NLRP3 inflammasome activation. Journal of Pharmacy and Pharmacology. 73 (1), 118-134 (2021).
  19. Fernandez-Arjona, M. D. M., Leon-Rodriguez, A., Lopez-Avalos, M. D., Grondona, J. M. Microglia activated by microbial neuraminidase contributes to ependymal cell death. Fluids Barriers CNS. 18 (1), 15 (2021).
  20. Du, S., et al. Primary microglia isolation from postnatal mouse brains. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (168), e62237 (2021).
  21. Boccazzi, M., et al. The immune-inflammatory response of oligodendrocytes in a murine model of preterm white matter injury: the role of TLR3 activation. Cell Death & Disease. 12 (2), 166 (2021).
  22. Timmerman, R., Burm, S. M., Bajramovic, J. J. An overview of in vitro methods to study microglia. Frontiers in Cellular Neuroscience. 12, 242 (2018).
  23. Nikodemova, M., Watters, J. J. Efficient isolation of live microglia with preserved phenotypes from adult mouse brain. Journal of Neuroinflammation. 9, 147 (2012).
  24. Bennett, M. L., et al. New tools for studying microglia in the mouse and human CNS. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (12), 1738-1746 (2016).
  25. Bohlen, C. J., Bennett, F. C., Bennett, M. L. Isolation and culture of microglia. Current Protocols in Immunology. 125 (1), 70 (2019).
  26. Schroeter, C. B., et al. One brain-all cells: A comprehensive protocol to isolate all principal CNS-resident cell types from brain and spinal cord of adult healthy and EAE mice. Cells. 10 (3), 651 (2021).
  27. Harms, A. S., Tansey, M. G. Isolation of murine postnatal brain microglia for phenotypic characterization using magnetic cell separation technology. Methods in Molecular Biology. 1041, 33-39 (2013).
  28. Pan, J., Wan, J. Methodological comparison of FACS and MACS isolation of enriched microglia and astrocytes from mouse brain. Journal of Immunological Methods. 486, 112834 (2020).
  29. Montilla, A., Zabala, A., Matute, C., Domercq, M. Functional and metabolic characterization of microglia culture in a defined medium. Frontiers in Cellular Neuroscience. 14, 22 (2020).
  30. Krishnan, M. L., et al. Integrative genomics of microglia implicates DLG4 (PSD95) in the white matter development of preterm infants. Nature Communications. 8 (1), 428 (2017).
  31. Bokobza, C., et al. miR-146b protects the perinatal brain against microglia-induced hypomyelination. Annals of Neurology. 91 (1), 48-65 (2021).
  32. Villapol, S., et al. Early sex differences in the immune-inflammatory responses to neonatal ischemic stroke. International Journal of Molecular Sciences. 20 (15), 3809 (2019).
  33. Rosiewicz, K. S., et al. Comparison of RNA isolation procedures for analysis of adult murine brain and spinal cord astrocytes. Journal of Neuroscience Methods. 333, 108545 (2020).
  34. Fleiss, B., et al. Microglia-mediated neurodegeneration in perinatal brain injuries. Biomolecules. 11 (1), 99 (2021).
  35. Pawelec, P., Ziemka-Nalecz, M., Sypecka, J., Zalewska, T. The Impact of the CX3CL1/CX3CR1 axis in neurological disorders. Cells. 9 (10), 2277 (2020).
  36. Reynolds, R., Cenci di Bello, I., Dawson, M., Levine, J. The response of adult oligodendrocyte progenitors to demyelination in EAE. Progress in Brain Research. 132, 165-174 (2001).
  37. Duan, W., et al. Novel insights into NeuN: From neuronal marker to splicing regulator. Molecular Neurobiology. 53 (3), 1637-1647 (2016).
  38. Kantzer, C. G., et al. Anti-ACSA-2 defines a novel monoclonal antibody for prospective isolation of living neonatal and adult astrocytes. Glia. 65 (6), 990-1004 (2017).
  39. Lee, S., Lee, D. K. What is the proper way to apply the multiple comparison test. Korean Journal of Anesthesiology. 71 (5), 353-360 (2018).
  40. Chao, C. C., Hu, S., Molitor, T. W., Shaskan, E. G., Peterson, P. K. Activated microglia mediate neuronal cell injury via a nitric oxide mechanism. Journal of Immunology. 149 (8), 2736-2741 (1992).
  41. Boje, K. M., Arora, P. K. Microglial-produced nitric oxide and reactive nitrogen oxides mediate neuronal cell death. Brain Research. 587 (2), 250-256 (1992).
  42. Biber, K., Owens, T., Boddeke, E. What is microglia neurotoxicity (Not). Glia. 62 (6), 841-854 (2014).
  43. Biber, K., Neumann, H., Inoue, K., Boddeke, H. W. Neuronal 'On' and 'Off' signals control microglia. Trends in Neurosciences. 30 (11), 596-602 (2007).
  44. Ransohoff, R. M., Cardona, A. E. The myeloid cells of the central nervous system parenchyma. Nature. 468 (7321), 253-262 (2010).
  45. Boucsein, C., Kettenmann, H., Nolte, C. Electrophysiological properties of microglial cells in normal and pathologic rat brain slices. European Journal of Neuroscience. 12 (6), 2049-2058 (2000).
  46. Beutner, C., et al. Unique transcriptome signature of mouse microglia. Glia. 61 (9), 1429-1442 (2013).
  47. Schmid, C. D., et al. Differential gene expression in LPS/IFNgamma activated microglia and macrophages: in vitro versus in vivo. Journal of Neurochemistry. 109, 117-125 (2009).
  48. Srivastava, P. K., et al. A systems-level framework for drug discovery identifies Csf1R as an anti-epileptic drug target. Nature Communications. 9 (1), 3561 (2018).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

185

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved