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In diesem Artikel

  • Zusammenfassung
  • Zusammenfassung
  • Einleitung
  • Protokoll
  • Ergebnisse
  • Diskussion
  • Offenlegungen
  • Danksagungen
  • Materialien
  • Referenzen
  • Nachdrucke und Genehmigungen

Zusammenfassung

Primäre Mikrogliakulturen werden häufig verwendet, um neue entzündungshemmende Moleküle zu bewerten. Das vorliegende Protokoll beschreibt eine reproduzierbare und relevante Methode zur magnetischen Isolierung von Mikroglia aus neugeborenen Welpen.

Zusammenfassung

Mikroglia, als hirnresidente Makrophagen, sind grundlegend für mehrere Funktionen, einschließlich der Reaktion auf Umweltstress und Gehirnhomöostase. Mikroglia können ein großes Spektrum von Aktivierungsphänotypen annehmen. Darüber hinaus sind Mikroglia, die den proinflammatorischen Phänotyp unterstützen, sowohl mit neurologischen Entwicklungsstörungen als auch mit neurodegenerativen Störungen assoziiert. In-vitro-Studien werden häufig in der Forschung eingesetzt, um mögliche therapeutische Strategien in bestimmten Zelltypen zu bewerten. In diesem Zusammenhang ist die Untersuchung der Mikrogliaaktivierung und Neuroinflammation in vitro unter Verwendung primärer Mikrogliakulturen relevanter als Mikrogliazelllinien oder Stammzell-abgeleitete Mikroglia. Die Verwendung einiger Primärkulturen könnte jedoch unter mangelnder Reproduzierbarkeit leiden. Dieses Protokoll schlägt eine reproduzierbare und relevante Methode zur magnetischen Isolierung von Mikroglia aus neugeborenen Welpen vor. Mikroglia-Aktivierung mit mehreren Stimuli nach 4 h und 24 h durch mRNA-Expressionsquantifizierung und einen Cy3-Bead Phagozyten-Assay wird hier demonstriert. Die aktuellen Arbeiten sollen eine leicht reproduzierbare Technik zur Isolierung physiologisch relevanter Mikroglia aus juvenilen Entwicklungsstadien liefern.

Einleitung

Mikroglia sind die im zentralen Nervensystem ansässigen Makrophagen-ähnlichen Zellen, die von erythropoetischen Vorläufern des Dottersacks abstammen, die während der frühen Embryonalentwicklung in das Neuroepithel wandern1. Neben ihren Immunitätsfunktionen spielen sie auch eine wichtige Rolle während der Neuroentwicklung, insbesondere bei der Synaptogenese, neuronalen Homöostase und Myelinisierung2. Im Erwachsenenalter entwickeln Mikroglia lange zelluläre Prozesse, um die Umgebung kontinuierlich zu scannen. Im Falle von Homöostaserupturen wie Hirnverletzungen oder Gehirnerkrankungen können Mikroglia ihr morphologisches Aussehen verändern, um eine amöboide Form anzunehmen, in den verletzten Bereich zu wandern, viele zytoprotektive oder zytotoxische Faktoren zu erhöhen und freizusetzen. Mikroglia haben heterogene Aktivierungszustände, abhängig von ihrem Entwicklungsstadium und der Art der erlittenen Verletzung 3,4,5. In dieser Studie werden diese Aktivierungszustände grob in drei verschiedene Phänotypen eingeteilt: entzündungsfördernd/phagozytisch, entzündungshemmend und immunregulatorisch, wobei zu berücksichtigen ist, dass die Situation in Wirklichkeit wahrscheinlich komplexer ist6.

Die Untersuchung der In-vivo-Mikrogliaaktivierung und das Screening auf neuroprotektive Strategien in frühen Stadien der Gehirnentwicklung kann aufgrund (1) der Zerbrechlichkeit der Tiere vor dem Absetzen und (2) der geringen Anzahl von Mikrogliazellen eine Herausforderung darstellen. Daher werden In-vitro-Studien an Mikroglia häufig für Toxizität 7,8,9, neuroprotektive Strategien5,10,11,12,13,14 und Kokulturen 15,16,17,18,19,20,21 verwendet. . In-vitro-Studien können entweder Mikroglia-Zelllinien, Stammzell-abgeleitete Mikroglia oder primäre Mikroglia-Kultur verwenden. Alle diese Ansätze haben Vor- und Nachteile, und die Wahl hängt von der anfänglichen biologischen Frage ab. Die Vorteile der Verwendung primärer Mikrogliakulturen sind der homogene genetische Hintergrund, die pathogenfreie Geschichte und die Kontrolle des Zeitpunkts, zu dem die Mikroglia nach dem Tiertod stimuliert werden22.

Im Laufe der Jahre wurden verschiedene Methoden (Durchflusszytometrie, Schütteln oder magnetische Markierung) entwickelt, um primäre Mikroglia von Nagetieren zu kultivieren, sowohl Neugeborenen als auch Erwachsenen 23,24,25,26,27,28,29. In der vorliegenden Arbeit wird die Mikroglia-Isolierung von Maus-Neugeborenen-Welpen unter Verwendung der zuvor beschriebenen magnetisch aktivierten Zellsortiertechnologie unter Verwendung von mikroperlenbeschichtetem Anti-Maus-CD11b25,27,29 durchgeführt. CD11b ist ein Integrinrezeptor, der an der Oberfläche myeloischer Zellen, einschließlich Mikroglia, exprimiert wird. Wenn es keine entzündliche Herausforderung im Gehirn gibt, sind fast alle CD11b + -Zellen Mikroglia30. Im Vergleich zu anderen zuvor veröffentlichten Methoden 23,24,25,26,27,28,29 gleicht das vorliegende Protokoll sofortige Ex-vivo-Mikroglia-Aktivierungsanalysen und gängige primäre In-vitro-Mikrogliakulturen aus. So werden Mikroglia (1) am postnatalen Tag (P)8 ohne Myelinentfernung isoliert, (2) ohne Serum kultiviert und (3) erst 48 h nach der Gehirnisolierung entweder siRNA, miRNA, pharmakologischen Verbindungen und/oder entzündlichen Reizen ausgesetzt. Jeder dieser drei Aspekte macht das aktuelle Protokoll relevant und schnell. Erstens ermöglicht die Verwendung von pädiatrischen Mikroglia die Gewinnung dynamischer und reaktiver lebensfähiger Zellen in Kultur, ohne dass ein zusätzlicher Demyelinisierungsschritt erforderlich ist, der möglicherweise die Mikroglia-Reaktivität in vitro verändern könnte. Das vorliegende Protokoll zielt darauf ab, der physiologischen Umgebung von Mikroglia so nahe wie möglich zu kommen. Tatsächlich treffen Mikroglia nie auf Serum, und dieses Protokoll erfordert auch nicht die Verwendung von Serum. Darüber hinaus verhindert die Freilegung von Mikroglia bereits 48 Stunden nach der Kultur, dass sie ihre physiologischen Fähigkeiten verlieren.

Protokoll

Das Protokoll wurde genehmigt und alle Tiere wurden gemäß den institutionellen Richtlinien des Institut National de la Santé et de la Recherche Scientifique (Inserm, Frankreich) behandelt. Die magnetische Isolierung von Mikroglia aus den Gehirnen von 24 OF1-Mauswelpen (sowohl männlich als auch weiblich) bei P8, unterteilt in 6-Well-, 12-Well- oder 96-Well-Platten, wird vorgestellt. Die experimentelle Arbeit wurde unter einer Haube durchgeführt, um sterile Bedingungen aufrechtzuerhalten.

1. Herstellung steriler Lösungen für Isolierung und Zellkultur

  1. Bereiten Sie 50 ml 1x Hanks' Balanced Salt Solution (HBSS) ohne Ca 2+ und Mg2+ (HBSS-/-) aus der handelsüblichen 10x-Lösung her (siehe Materialtabelle).
  2. Dissoziationsgemisch gemäß der in Tabelle 1 angegebenen Zusammensetzung unter Verwendung eines handelsüblichen Gewebedissoziationskits herzustellen (siehe Materialtabelle).
  3. 200 ml 1x HBSS mit Ca 2+ und Mg2+ (HBSS+/+) aus der handelsüblichen 10x Lösung herstellen.
  4. Bereiten Sie 200 ml 1x PBS + 0,5% BSA (als Zellsortierpuffer bezeichnet) vor.
  5. CD11b-Mikroperlen gemäß Tabelle 2 herstellen.
  6. Bereiten Sie 500 ml Makrophagen-serumfreies Kulturmedium (SFM) + 1% Penicillin-Streptomycin (P / S) vor. Machen Sie Aliquots von 50-ml-Röhrchen und lagern Sie sie bei 4 °C. Dies wird später im Text als Mikroglia-Medium bezeichnet.
    HINWEIS: Alle Isolierlösungen müssen am Versuchstag unter sterilen Bedingungen frisch zubereitet und auf Eis gehalten werden. Mikroglia-Zellkulturmedium kann hergestellt, in 50-ml-Röhrchen aliquotiert und für die zukünftige Verwendung bei 4 °C aufbewahrt werden. Eine Filtration ist nicht erforderlich.

2. Dissektion des Gehirns

  1. Enthaupten Sie den Kopf des Welpen mit einer großen Schere ohne vorherige Vollnarkose.
  2. Schneiden Sie die Haut vom Hals bis zur Nase nach der sagittalen Naht (15-20 mm) mit einer kleinen Schere ab (Abbildung 1A-C).
  3. Führen Sie eine kleine Scherenspitze in das Foramen magnum parallel zum Schädel ein. Von jeder Seite vorsichtig zu den Augen schneiden (Abbildung 1D,E).
  4. Mit einer kleinen Schere zwischen die Augen schneiden, um den Schädel und das Gehirn vom Kopf zu lösen (Abbildung 1F).
  5. Fassen Sie den Schädel mit zwei Pinzetten in die Nähe der Riechkolben und reißen Sie den Schädel vorsichtig auf, wobei Sie darauf achten, das darunter liegende Gehirn nicht zu beschädigen (Abbildung 1G-I).
  6. Entfernen Sie Kleinhirn und Geruchskolben mit einer Rasierklinge und schneiden Sie das Gehirn in zwei Stücke (Abbildung 1J).
  7. Legen Sie die Gehirnstücke in eine Petrischale mit 30-40 ml HBSS-/- (Abbildung 1K).

3. Hirndissoziation und magnetische Mikrogliaisolation

HINWEIS: Alle Zellmanipulationen und Resuspensionen müssen mit einer 1.000 μL Pipette mit großer Vorsicht durchgeführt werden. Die Anwendung einer hohen mechanischen Wirkung kann Mikrogliazellen aktivieren oder abtöten.

  1. Transfer 12 Hirnstücke (~1,2 g) pro Dissoziationsröhrchen mit Dissoziationsgemisch gemäß Tabelle 1. Für 24 Welpen wurden vier C-Tubes benötigt (Abbildung 2A-B).
  2. Platzieren Sie C-Tubes auf dem Dissoziator (mit dem Heizmodus). Starten Sie das optimierte NTDK-Programm im Gerät gemäß den Anweisungen des Herstellers (Abbildung 2D).
  3. Zentrifugieren Sie bei 300 x g für 20 s (bei 4 °C), um alle Zellen zu sammeln. Schließen Sie die mechanische Dissoziation ab, indem Sie mit einer 1.000-μl-Pipette dreimal nach oben und unten pipettieren (Abbildung 2E).
  4. Übertragen Sie die Zellen in vier 15-ml-Röhrchen + Siebe. Spülen Sie die Siebe mit 10 ml HBSS+/+ (Abbildung 2F).
  5. Bei 300 x g 10 min (bei 4 °C) zentrifugieren und den Überstand entfernen. Resuspendieren Sie das Pellet vorsichtig mit 10 ml HBSS+/+ (Abbildung 2G).
  6. Bei 300 x g 10 min (bei 4 °C) zentrifugieren und den Überstand entfernen. Resuspendieren Sie das Pellet vorsichtig mit 6 ml Sortierpuffer (Schritt 1.4) (Abbildung 2H).
  7. Bei 300 x g 10 min (bei 4 °C) zentrifugieren und den Überstand entfernen. 200 μL CD11b-Mikroperlenlösung (Schritt 1.5) pro Röhrchen zugeben und vorsichtig resuspendieren (Abbildung 2I).
  8. Die Röhrchen 15-20 min bei 4 °C inkubieren. Resuspendieren Sie das Pellet vorsichtig mit 6 ml Sortierpuffer (Abbildung 2I-J).
  9. Bei 300 x g 10 min (bei 4 °C) zentrifugieren und den Überstand entfernen. Resuspendieren Sie das Pellet vorsichtig mit 8 ml Sortierpuffer (Abbildung 2K).
  10. Folgen Sie dem POSSEL-Programm auf dem Separator (siehe Materialtabelle), um acht Spalten vorzubereiten. Transferzellen 1 ml x 1 ml auf der Säule. Warten Sie, bis alle Zellen durchgegangen sind, bevor Sie eine weitere ml hinzufügen. Elue CD11b+ Zellen auf steriler Elutionsplatte mit 1 mL Sortierpuffer (Abbildung 2L).
  11. Pool CD11b+-Zellen in einem neuen 50-ml-Röhrchen (Abbildung 2M).
  12. Bei 300 x g 10 min (bei 4 °C) zentrifugieren und den Überstand entfernen. Resuspendieren Sie das Pellet vorsichtig mit 10 ml kaltem Mikrogliamedium (Schritt 1.6) (Abbildung 2N).
  13. Zählen Sie die CD11b+-Zellen. Bei P8 sollte man ~650.000 Zellen pro Gehirn erhalten.
    HINWEIS: Im vorliegenden Protokoll wurden die Zellen mit einem automatisierten Zellzähler gezählt (siehe Materialtabelle).
  14. Resuspendieren Sie die Zellen in kaltem Mikrogliamedium auf eine Endkonzentration von 650.000-700.000 Zellen/ml und dosieren Sie sie in Zellkulturplatten.
    HINWEIS: Die 6-Well-Platten sind für Western Blot (2 ml pro Well); die 12-Well-Platten sind für die RT-qPCR-Analyse (1 ml pro Well) und die 96-Well-Platten für den phagozytischen Assay (250 μL pro Well); Alle drei wurden für diese Arbeit verwendet. In diesem Manuskript sind die Ergebnisse der Western-Blot-Analyse jedoch nicht dargestellt, aber es ist möglich, mit diesem Protokoll durchzuführen.
  15. Stellen Sie die Platten über Nacht bei 37 °C mit 5% CO2. Wechseln Sie das Medium vorsichtig mit einer 1.000 μL Pipette mit vorgewärmtem Mikrogliamedium.
  16. Stellen Sie die Platten vor der Stimulation über Nacht bei 37 °C mit 5% CO2 auf.
    HINWEIS: Die Isolierung von Mikroglia von mehr als 36 Welpen und nach P9 wird nicht empfohlen. Dies erhöht das Risiko einer Kontamination und Ansammlung von Zelltrümmern, um Mikroglia zu aktivieren.

4. Zellstimulationen

  1. Herstellung von Stimulationsreagenzien gemäß Tabelle 3 unter Verwendung der handelsüblichen Reagenzien (siehe Materialtabelle).
  2. Fügen Sie das entsprechende Volumen in jedem stimulierten Brunnen hinzu.
    HINWEIS: Das geeignete Volumen hängt von der Konzentration des Stimulus und der Größe des Brunnens ab.
  3. Die Platten werden bei 37 °C mit 5%CO2bis zum Ende der Stimulation um 6 h, 24 h oder 48 h platziert.
  4. Für die Western-Blot-Analyse aspirieren Sie den Überstand und fügen 50 μL Proteinlysepuffer (siehe Materialtabelle) mit einer Pipette hinzu. Kratzen Sie mit Spitzen den Boden der Platte, um die lysierten Zellen zu lösen, und übertragen Sie sie in 1,5-ml-Röhrchen. Bei -80 °C lagern.
    HINWEIS: Die Kulturplatten können jahrelang bei -80 °C gelagert werden, wenn der Überstand korrekt angesaugt ist.
  5. Für die RT-qPCR-Analyse 6,31 aspirieren Sie den Überstand und lagern die Kulturplatten direkt bei -80 °C bis zur mRNA-Extraktion (Schritt 5).
  6. Für den phagozytischen Assay siehe Schritt 6.

5. mRNA-Extraktion und RT-qPCR-Analyse

  1. Führen Sie RNA-Extraktion, RT-PCR und RT-qPCR gemäß dem Protokoll des Herstellers durch (siehe Materialtabelle). Die Primersequenzen 5,6,31 finden Sie in Tabelle 4.
  2. Führen Sie eine RT-qPCR-Analyse durch, indem Sie dem zuvor veröffentlichten Bericht5 folgen.

6. Phagozytärer Assay

  1. Stimulieren Sie die Zellen und führen Sie während der letzten 3 Stunden der Stimulation einen phagozytischen Test durch. Zum Beispiel, für Stimulation von 6 h, starten Sie den phagozytischen Assay nach 3 h Stimulation; und für eine Stimulation von 12 h beginnen Sie den phagozytischen Assay 9 h nach Beginn der Stimulation.
  2. Berechnen Sie die Anzahl der Perlen, die für die Vorbereitung benötigt werden, unter Berücksichtigung des Verhältnisses (1 Zelle: 50 Perlen). Für eine Vertiefung der 96-Well-Platte werden 8,1 x 106 Perlen benötigt. Bereiten Sie die Perlenmischung gemäß Tabelle 5 vor.
    HINWEIS: Wirbeln Sie die Durchstechflasche mit den Perlen vorsichtig durch, bevor Sie sie der PBS / FBS-Mischung hinzufügen.
  3. 1 h in einem Wasserbad bei 37 °C inkubieren. Wirbel alle 10 min.
  4. Berechnen Sie das Lösungsvolumen, das jeder Vertiefung hinzugefügt werden soll. Fügen Sie die Lösung hinzu und inkubieren Sie für 3 h.
  5. Spülen Sie die Vertiefungen dreimal mit 1x PBS aus. Lesen Sie die Fluoreszenzemission bei 550 nm (Cy3-Emissionswellenlänge).

7. Qualitätskontrolle der Reinheit

  1. Bewerten Sie die Reinheit der magnetischen CD11b-Isolierung durch Durchflusszytometrie (FACS) (vor und nach der Zellsortierung) und führen Sie dann die RT-qPCR durch.
    1. Die Zellen werden gezählt und im FACS-Puffer (PBS + 2 mM EDTA + 0,5 % Rinderserumalbumin) resuspendiert, um nach Schritt 3.5 und Schritt 3.14 eine Verdünnung von 10 x 106 Zellen/ml zu erhalten.
    2. Nach 15 min der konventionellen Fc-Blockierung 32,33 werden die Zellen für 15 min mit einer Lebensfähigkeitssonde (FVS780) und fluorophorkonjugierten Antikörpern gegen Maus-CD45, CD11b, CX3CR1, ACSA-2, O4 oder die entsprechenden Kontrollisotypen 32,33 in der vom Hersteller empfohlenen Konzentration inkubiert (siehe Materialtabelle).
    3. Waschen Sie die Zellen mit FACS-Puffer, fixieren und permeabilisieren Sie sie mit einem handelsüblichen Permeabilisierungskit (siehe Materialtabelle).
    4. Führen Sie eine erneute Fc-Blockierung an den permeabilisierten Zellen durch und inkubieren Sie dann 15 min lang mit fluorophorkonjugierten Antikörpern gegen NeuN (siehe Materialtabelle) oder dessen Kontrollisotyp.
    5. Führen Sie die FACS-Analyse nach dem Waschen mit dem FACS-Puffer durch.
    6. Nach dem Ausschluss der Dubletten und der toten Zellen basierend auf morphologischen Parametern bzw. FVS780-Färbung wählen Sie die Gating-Strategie für die Oberflächenexpression von CX3CR1 (Mikroglia), ACSA-2 (Astrozyten), O4 (Oligodendrozyten) und intrazelluläres Vorhandensein von NeuN (Neuronen) für die Analyse des Prozentsatzes positiver Zellen.
  2. Nach Schritt 5 extrahieren Sie mRNA und führen RT-qPCR durch, um Itgam (CD11b), Cx3cr1, Olig2, Synaptophysin und Gfap mRNA zu quantifizieren. Normalisieren Sie Cq mit Rpl13a mRNA als Reporter und führen Sie eine relative Expression zu Itgam mRNA durch.

Ergebnisse

Mikroglia ist der ZNS-residente Makrophag, der aktiviert wird, wenn er Umweltproblemen (Trauma, toxische Moleküle, Entzündungen) ausgesetzt ist4,5,6,34 (Abbildung 3A). In-vitro-Studien an Mikroglia werden häufig verwendet, um zellautonome Mechanismen im Zusammenhang mit diesen Umweltherausforderungen zu bewerten und den Aktivierungszustand nach pharmako...

Diskussion

Die aktuelle Arbeit präsentiert eine primäre Mikrogliazellkultur mit magnetisch sortierten CD11b+-Zellen. Neben der mikroglialen Funktionsbewertung (RT-qPCR und phagozytäre Assays) wurde auch die Reinheit der Mikrogliakultur bestimmt.

Klassische Mikroglia-Zellkulturen werden üblicherweise aus P1- oder P2-Nagetier-Neugeborenengehirn und Co-Kultur mit Astrozyten für mindestens 10 Tage erzeugt. Mikroglia werden dann mechanisch mit einem Orbitalschüttler getrennt. Die Methode zur Isolierung ...

Offenlegungen

Die Autoren erklären keine Interessenkonflikte.

Danksagungen

Die Figuren wurden mit BioRender erstellt. Die Forschung wird von Inserm, Université de Paris, Horizon 2020 (PREMSTEM-874721), Fondation de France, Fondation ARSEP, Fondation pour la Recherche sur le Cerveau, Fondation Grace de Monaco und einem zusätzlichen Zuschuss von Investissement d'Avenir -ANR-11-INBS-0011-NeurATRIS und Investissement d'Avenir -ANR-17-EURE-001-EUR G.E.N.E. finanziert.

Materialien

NameCompanyCatalog NumberComments
Anti mouse ACSA-2 PE Vio 615Miltenyi Biotec130-116-246
Anti mouse CD11b BV421Sony Biotechnology1106255
Anti mouse CD45 BV510Sony Biotechnology1115690
Anti mouse CX3CR1 PE Cy7Sony Biotechnology1345075
Anti mouse NeuN PEMilli-MarkFCMAB317PE
anti mouse O4 Vio Bright B515Miltenyi Biotec130-120-016
BD Cytofix/Cytoperm permeabilization kitBD Biosciences554655
Bovine Serum AlbuminMiltenyi Biotec130-091-376
CD11b (Microglia) MicroBeads, h, mMiltenyi Biotec130-093-634
Confocal microscopeLeica TCS SP8
D-PBS (10x)Thermo Scientific14200067
EDTASigma-AldrichE1644
Falcon Cell culture 12-well plate, flat bottom + lidDutscher353043
Falcon Cell culture 96-well plate, flat bottom + lidDutscher353072
Falcon tubes 50 mLDutscher352098
Fc blocking reagent (Mouse CD16/32)BD Biosciences553142
Fluorescence microscopeNikon ECLIPSE TE300
gentleMACS C Tubes (4 x 25 tubes)Miltenyi Biotec130-096-334
gentleMACS Octo Dissociator with HeatersMiltenyi Biotec130-096-427
Hanks' Balanced Salt Solution (HBSS) +CaCl2 +MgCl2 10xThermo Scientific14065049
Hanks' Balanced Salt Solution (HBSS) -CaCl2 -MgCl2 10xThermo Scientific14185045
iQ SYBR Green SupermixBio-rad1725006CUST
Iscript c-DNA synthesisBio-rad1708890
Latex beads, amine-modified polystyrene, fluorescent redSigma-AldrichL2776-1mL
Lipopolysaccharides (LPS) from Escherichia coli O55:B5Sigma-AldrichL2880
Macrophage-SFM serum-free mediumThermo Scientific12065074
MACS BSA Stock SolutionMiltenyi Biotec130-091-376
MACS SmartStrainers (70 μm), 4 x 25 pcsMiltenyi Biotec130-110-916
Mouse IgG1 PEMilliporeMABC002H
Mouse IgG2a PE Cy7Sony Biotechnology2601265
Mouse IL1 betaMiltenyi Biotec130-101-684
Multi-24 Column BlocksMiltenyi Biotec130-095-691
MultiMACS Cell24 SeparatorMiltenyi Biotec
Neural Tissue Dissociation Kit - PapainMiltenyi Biotec130-092-628
Nucleocounter NC-200Chemometec
Nucleospin RNA Plus XSMacherey Nagel740990.5
Nun EZFlip Top Conical Centrifuge TubesThermo Scientific362694
OPTILUX Petri dish - 100 x 20 mmDutscher353003
Pénicilline-streptomycine (10 000 U/mL)Thermo Scientific15140122
Rat IgG2b, k BV421BD Biosciences562603
Rat IgG2b, k BV510Sony Biotechnology2603230
REA control (S) PE vio 615Miltenyi Biotec130-104-616
REA control (S) Vio Bright B515Miltenyi Biotec130-113-445
Recombinant Mouse IFN-gamma ProteinR&D System485-MI
Recombinant Mouse IL-10 ProteinR&D System417-ML
Recombinant Mouse IL-4 ProteinR&D System404-ML
RIPA BufferSigma-AldrichR0278
Viability probe (FVS780)BD Biosciences565388

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