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요약

1차 미세아교세포 배양은 일반적으로 새로운 항염증 분자를 평가하는 데 사용됩니다. 본 프로토콜은 신생아 새끼로부터 미세아교세포를 자기적으로 분리하는 재현 가능하고 관련성 있는 방법을 설명합니다.

초록

뇌에 상주하는 대식세포인 미세아교세포는 환경 스트레스에 대한 반응과 뇌 항상성을 포함한 여러 기능의 기본입니다. 미세아교세포는 광범위한 활성화 표현형을 채택할 수 있습니다. 또한, 전 염증성 표현형을지지하는 미세 아교 세포는 신경 발달 및 신경 퇴행성 장애와 관련이 있습니다. 시험관 내 연구는 특정 세포 유형에서 잠재적 인 치료 전략을 평가하기위한 연구에 널리 사용됩니다. 이러한 맥락에서 일차 소교세포 배양을 사용하여 시험관 내에서 미세아교세포 활성화 및 신경염증을 연구하는 것이 소교세포 세포주 또는 줄기세포 유래 미세아교세포보다 더 관련이 있습니다. 그러나 일부 1 차 배양의 사용은 재현성이 부족할 수 있습니다. 이 프로토콜은 신생아 새끼에서 미세아교세포를 자기적으로 분리하는 재현 가능하고 관련성 있는 방법을 제안합니다. mRNA 발현 정량화 및 Cy3-비드 식세포 분석에 의한 4시간 및 24시간 후 여러 자극을 사용한 미세아교세포 활성화가 여기에서 입증됩니다. 현재의 연구는 청소년 발달 단계에서 생리 학적으로 관련된 미세 아교 세포를 분리하기위한 쉽게 재현 가능한 기술을 제공 할 것으로 기대된다.

서문

미세아교세포는 초기 배아 발달 동안 신경 상피로 이동하는 난황낭의 적혈구 생성 전구체에서 유래한 중추신경계에 상주하는 대식세포 유사 세포입니다1. 면역 기능 외에도 신경 발달 중, 특히 시냅스 형성, 신경 항상성 및 수초화2에 중요한 역할을합니다. 성인기에 미세아교세포는 환경을 지속적으로 스캔하기 위해 긴 세포 과정을 발달시킵니다. 뇌 손상이나 뇌 질환과 같은 항상성 파열의 경우, 미세 아교 세포는 형태 학적 모양을 변경하여 아메보이드 모양을 채택하고 손상된 부위로 이동하여 많은 세포 보호 또는 세포 독성 인자를 증가 및 방출 할 수 있습니다. 미세아교세포는 발달 단계와 3,4,5 지속되는 부상 유형에 따라 이질적인 활성화 상태를 갖습니다. 이 연구에서 이러한 활성화 상태는 크게 세 가지 표현형으로 분류됩니다 : 전 염증 / 식세포, 항 염증 및 면역 조절, 실제로는 상황이 더 복잡 할 가능성이 있음을 명심하십시오6.

생체 내 소교세포 활성화를 연구하고 뇌 발달 초기 단계에서 신경 보호 전략을 스크리닝하는 것은 (1) 이유 전 동물의 취약성과 (2) 소교세포 수가 적기 때문에 어려울 수 있습니다. 따라서 미세아교세포에 대한 시험관 내 연구는 독성 7,8,9, 신경 보호 전략 5,10,11,12,13,14 및 공동 배양 15,16,17,18,19,20,21에 널리 사용됩니다. . 시험관 내 연구는 소교세포주, 줄기세포 유래 미세아교세포 또는 1차 미세아교세포 배양을 사용할 수 있습니다. 이러한 모든 접근법에는 장점과 단점이 있으며 선택은 초기 생물학적 질문에 달려 있습니다. 1차 미세아교세포 배양을 사용하는 이점은 균질한 유전적 배경, 병원체가 없는 이력 및 동물 사망 후 미세아교세포가 자극되는 시간의 제어입니다22.

수년에 걸쳐, 설치류, 신생아 및 성인 23,24,25,26,27,28,29 모두로부터 1 차 미세 아교 세포를 배양하기위한 다양한 방법 (유세포 분석, 진탕 또는 자기 표지)이 개발되었습니다. 본 연구에서, 마우스 신생아 새끼로부터의 미세아교세포 분리는 마이크로비드-코팅된 항-마우스 CD11b25,27,29를 사용하여 이전에 기술된 자기-활성화 세포 분류 기술을 사용하여 수행된다. CD11b는 미세아교세포를 포함한 골수성 세포의 표면에서 발현되는 인테그린 수용체이다. 뇌 내에 염증 문제가 없을 때 거의 모든 CD11b+ 세포는 미세아교세포30입니다. 이전에 발표된 다른 방법 23,24,25,26,27,28,29와 비교 하여, 본 프로토콜은 즉각적인 생체외 미세아교세포 활성화 분석과 일반적인 시험관 내 1차 미세아교세포 배양의 균형을 맞춘다. 따라서 미세아교세포는 (1) 미엘린 제거 없이 출생 후 (P)8에 분리되고, (2) 혈청 없이 배양되며, (3) 뇌 분리 후 48시간 만에 siRNA, miRNA, 약리학적 화합물 및/또는 염증 자극에 노출됩니다. 이 세 가지 측면 각각은 현재 프로토콜을 적절하고 빠르게 만듭니다. 우선, 소아 미세아교세포의 사용은 잠재적으로 시험관 내에서 미세아교세포 반응성을 수정할 수 있는 추가적인 탈수초 단계를 요구하지 않고 배양에서 역동적이고 반응성이 있는 생존 세포를 얻을 수 있게 한다. 본 프로토콜은 미세아교세포의 생리적 환경에 가능한 한 근접하는 것을 목표로 한다. 실제로, 미세 아교 세포는 혈청을 만나지 않으며,이 프로토콜은 혈청을 사용할 필요도 없습니다. 또한 배양 후 48 시간 만에 미세 아교 세포를 노출하면 생리 능력을 잃지 않습니다.

프로토콜

프로토콜은 승인되었고 모든 동물은 Institut National de la Santé et de la Recherche Scientifique (Inserm, France)의 기관 지침에 따라 처리되었습니다. 6웰, 12웰 또는 96웰 플레이트로 분할된 P8에서 24개의 OF1 마우스 새끼(수컷과 암컷 모두)의 뇌에서 미세아교세포의 자기 분리가 제시됩니다. 실험 작업은 멸균 상태를 유지하기 위해 후드 하에서 수행되었습니다.

1. 분리 및 세포 배양을 위한 멸균 용액의 제조

  1. 시판되는 50x 용액에서Ca 2 + 및 Mg2+ (HBSS-/-)가없는 1x 행크스 균형 소금 용액 (HBSS) 10mL를 준비하십시오 ( 재료 표 참조).
  2. 시판되는 조직 해리 키트를 사용하여 표 1 에 제공된 조성에 따라 해리 혼합물을 제조한다( 재료 표 참조).
  3. 시판되는 10x 용액에서Ca2+ 및 Mg 2+(HBSS+/+)가 포함된 1x HBSS200mL를 준비합니다.
  4. 200mL의 1x PBS + 0.5% BSA(세포 분류 완충액이라고 함)를 준비합니다.
  5. 표 2에 따라 CD11b-마이크로비드를 제조한다.
  6. 500mL의 대식세포 무혈청 배양액(SFM) + 1%의 페니실린-스트렙토마이신(P/S)을 준비합니다. 50mL 튜브의 분취량을 만들어 4°C에서 보관합니다. 이것은 본문의 뒷부분에서 미세아교세포 배지라고 합니다.
    알림: 모든 분리 용액은 실험 당일 멸균 조건에서 새로 준비하고 얼음 위에 보관해야 합니다. 미세아교세포 세포 배양 배지를 준비하고, 50mL 튜브에 분취하고, 향후 사용을 위해 4°C에서 보관할 수 있습니다. 여과가 필요하지 않습니다.

2. 뇌 해부

  1. 이전의 전신 마취없이 큰 가위를 사용하여 강아지의 머리를 참수하십시오.
  2. 작은 가위로 시상 봉합사 (15-20 mm) 후 목에서 코까지 피부를 자릅니다 (그림 1A-C).
  3. 두개골과 평행 한 구멍 매그넘 안에 작은 가위 끝을 삽입하십시오. 양쪽에서 눈까지 조심스럽게 자릅니다(그림 1D, E).
  4. 작은 가위로 눈 사이를 잘라 머리에서 두개골과 뇌를 분리합니다 (그림 1F).
  5. 두 개의 집게로 두개골을 후각 구에 가깝게 잡고 밑에있는 뇌를 손상시키지 않도록주의하면서 두개골을 조심스럽게 찢습니다 (그림 1G-I).
  6. 면도날로 소뇌와 후각 전구를 제거하고 뇌를 두 조각으로 자릅니다 (그림 1J).
  7. 뇌 조각을 30-40mL의 HBSS-/- 가 들어있는 페트리 접시에 넣습니다 (그림 1K).

3. 뇌 해리 및 자기 미세 아교 세포 분리

참고: 모든 세포 조작 및 재현탁은 1,000μL 피펫으로 매우 주의해서 수행해야 합니다. 높은 기계적 작용을 적용하면 미세아교세포 세포가 활성화되거나 사멸될 수 있습니다.

  1. 표 1에 따라 해리 혼합물이 포함된 해리 튜브당 12개의 뇌 조각(~1.2g)을 옮깁니다. 24마리의 새끼에게는 4개의 C-튜브가 필요했습니다(그림 2A-B).
  2. C-튜브를 해리 장치에 놓습니다(가열 모드 사용). 제조업체의 지침에 따라 장비에서 최적화된 NTDK 프로그램을 시작합니다(그림 2D).
  3. 300 x g 에서 20 s (4 °C에서) 원심 분리하여 모든 세포를 수집한다. 1,000μL 피펫으로 위아래로 3회 피펫팅하여 기계적 해리를 완료합니다(그림 2E).
  4. 세포를 4개의 15mL 튜브 + 스트레이너로 옮깁니다. 10mL의 HBSS+/+ 로 여과기를 헹굽니다(그림 2F).
  5. 300 x g 에서 10분 동안 (4°C에서) 원심분리하고 상청액을 제거한다. 10mL의 HBSS+/+ 로 펠릿을 조심스럽게 재현탁합니다(그림 2G).
  6. 300 x g 에서 10분 동안 (4°C에서) 원심분리하고 상청액을 제거한다. 6mL의 분류 완충액으로 펠릿을 조심스럽게 재현탁합니다(단계 1.4)(그림 2H).
  7. 300 x g 에서 10분 동안 (4°C에서) 원심분리하고 상청액을 제거한다. 튜브당 200μL의 CD11b-마이크로비드 용액(단계 1.5)을 추가하고 조심스럽게 재현탁합니다(그림 2I).
  8. 튜브를 4 ° C에서 15-20 분 동안 배양합니다. 6mL의 분류 완충액으로 펠릿을 조심스럽게 재현탁합니다(그림 2I-J).
  9. 300 x g 에서 10분 동안 (4°C에서) 원심분리하고 상청액을 제거한다. 8mL의 분류 완충액으로 펠릿을 조심스럽게 재현탁합니다(그림 2K).
  10. 분리기의 POSSEL 프로그램 ( 재료 표 참조)에 따라 8 개의 열을 준비하십시오. 컬럼에서 세포 1mL x 1mL를 옮깁니다. 다른 mL를 추가하기 전에 모든 세포가 통과 할 때까지 기다리십시오. 1mL의 분류 완충액으로 멸균 용출 플레이트에서 CD11b+ 세포를 용리합니다(그림 2L).
  11. CD11b+ 세포를 새로운 50mL 튜브에 풀링합니다(그림 2M).
  12. 300 x g 에서 10분 동안 (4°C에서) 원심분리하고 상청액을 제거한다. 10mL의 차가운 미세아교세포 배지(단계 1.6)로 펠릿을 조심스럽게 재현탁합니다(그림 2N).
  13. CD11b+ 세포를 세십시오. P8에서는 뇌 당 ~ 650,000 개의 세포를 얻어야합니다.
    참고: 본 프로토콜에서, 세포는 자동화된 세포 계수기를 사용하여 계수되었다( 재료 표 참조).
  14. 차가운 미세아교세포 배지에 세포를 650,000-700,000 cells/mL의 최종 농도로 재현탁시키고 세포 배양 플레이트에 분주합니다.
    참고: 6웰 플레이트는 웨스턴 블롯용입니다(웰당 2mL). 12웰 플레이트는 RT-qPCR 분석용(웰당 1mL)용이고 96웰 플레이트는 식세포 분석용(웰당 250μL)용입니다. 세 가지 모두이 작업에 사용되었습니다. 그러나이 원고에서는 웨스턴 블롯 분석 결과가 표시되지 않지만이 프로토콜로 수행 할 수 있습니다.
  15. 플레이트를 37°C에서 5%CO2로 밤새 놓는다. 예열된 미세아교세포 배지가 있는 1,000μL 피펫으로 배지를 조심스럽게 교체합니다.
  16. 플레이트를 자극 전에 밤새 5%CO2로 37°C에 둔다.
    알림: 36마리 이상의 새끼와 P9 이후에 미세아교세포를 분리하는 것은 권장하지 않습니다. 이것은 미세 아교 세포를 활성화하기 위해 세포 파편의 오염 및 축적 위험을 증가시킵니다.

4. 세포 자극

  1. 시판되는 시약을 사용하여 표 3 에 따라 자극 시약을 준비한다( 재료표 참조).
  2. 각 자극 우물에 적절한 양을 추가하십시오.
    알림: 적절한 부피는 자극의 농도와 우물의 크기에 따라 다릅니다.
  3. 플레이트를 6시간, 24시간 또는 48시간에 자극이 끝날 때까지 5%CO2로 37°C에 놓습니다.
  4. 웨스턴 블롯 분석을 위해 상청액을 흡인하고 피펫으로 50μL의 단백질 용해 완충액( 재료 표 참조)을 추가합니다. 팁을 사용하여 플레이트 바닥을 긁어 용해된 세포를 분리하고 1.5mL 튜브로 옮깁니다. -80 °C에서 보관하십시오.
    알림: 배양 플레이트는 상청액이 올바르게 흡인된 경우 -80°C에서 수년간 보관할 수 있습니다.
  5. RT-qPCR 분석 6,31의 경우, 상청액을 흡인하고 mRNA 추출 전까지 배양 플레이트를 -80°C에서 직접 보관한다(단계 5).
  6. 식세포 분석에 대해서는 6단계를 참조하십시오.

5. mRNA 추출 및 RT-qPCR 분석

  1. 제조업체의 프로토콜에 따라 RNA 추출, RT-PCR 및 RT-qPCR을 수행합니다(재료 표 참조). 프라이머 서열 5,6,31에 대해서는 표 4를 참조한다.
  2. 이전에 발표된 보고서5에 따라 RT-qPCR 분석을 수행합니다.

6. 식세포 분석

  1. 세포를 자극하고 자극의 마지막 3시간 동안 식세포 분석을 수행합니다. 예를 들어, 6 시간의 자극을 위해, 자극의 3 시간 후에 식세포 분석을 시작한다; 그리고 12 시간의 자극을 위해, 자극의 시작 9 시간 후에 식세포 분석을 시작하십시오.
  2. 비율을 고려하여 준비하는 데 필요한 비드 수를 계산합니다(1셀: 50개의 비드). 96웰 플레이트 중 웰 1개에는 8.1 x 106 개의 비드가 필요합니다. 표 5에 따라 비드 혼합물을 제조한다.
    알림: PBS/FBS 혼합물에 추가하기 전에 비드 스톡 바이알을 조심스럽게 소용돌이치십시오.
  3. 37°C의 수조에서 1시간 동안 배양합니다. 10 분마다 소용돌이.
  4. 각 웰에 추가할 용액 부피를 계산합니다. 용액을 넣고 3 시간 동안 배양한다.
  5. 1x PBS로 웰을 세 번 헹굽니다. 550nm(Cy3 방출 파장)에서 형광 방출을 읽습니다.

7. 순도 품질 관리

  1. 유동 세포분석(FACS)(세포 분류 전후)에 의한 CD11b 자기 분리의 순도를 평가한 다음, RT-qPCR을 수행한다.
    1. 세포를 계수하고 단계 3.5 및 단계 3.14 후에 10 x 106 cells/mL의 희석액을 얻기 위해 FACS 완충액(PBS + 2mM의 EDTA + 0.5%의 소 혈청 알부민)에 재현탁시킨다.
    2. 통상적인 Fc 차단 32,33의 15분 후, 세포를 생존성 프로브 (FVS780) 및 마우스 CD45, CD11b, CX3CR1, ACSA-2, O4 또는 이들의 상응하는 대조군 이소타입32,33에 대한 형광단-접합 항체와 함께 15분 동안 제조자에 의해 권장되는 농도로 배양한다 (재료 표 참조).
    3. 세포를 FACS 완충액으로 세척하고, 고정하고, 시판되는 투과화 키트로 투과화한다( 재료 표 참조).
    4. 투과화된 세포에서 Fc 차단을 다시 수행한 다음, NeuN( 재료 표 참조) 또는 그의 대조군 이소타입에 대해 형광단-접합된 항체와 함께 15분 동안 인큐베이션합니다.
    5. FACS 버퍼로 세척한 후 FACS 분석을 수행합니다.
    6. 형태학적 파라미터 및 FVS780 염색에 기초한 이중선 및 사멸 세포를 각각 배제한 후, 양성 세포의 백분율 분석을 위해 CX3CR1(미세아교세포), ACSA-2(성상교세포), O4(희소돌기아교세포) 및 NeuN(뉴런)의 세포 내 존재에 대한 게이팅 전략을 선택합니다.
  2. 단계 5에 이어 mRNA를 추출하고 RT-qPCR을 수행하여 잇감 (CD11b), Cx3cr1, Olig2, 시냅토피신 및 Gfap mRNA를 정량한다. Rpl13a mRNA를 리포터로 사용하여 Cq를 정규화하고, 잇감 mRNA에 대한 상대적 발현을 수행한다.

결과

미세아교세포는 환경적 문제(외상, 독성 분자, 염증)4,5,6,34에 노출될 때 활성화되는 CNS 상주 대식세포입니다(그림 3A). 미세아교세포에 대한 시험관 내 연구는 일반적으로 이러한 환경적 문제와 관련된 세포 자율 메커니즘을 평가하고 약리학적 또는 유전적 조작 후 활성화...

토론

현재 연구는 자기적으로 분류된 CD11b+ 세포를 사용하는 1차 소교세포 배양을 제시합니다. 소교세포 기능 평가(RT-qPCR 및 식세포 분석) 외에도 미세아교세포 배양 순도도 측정되었습니다.

고전적인 미세아교세포 세포 배양은 일반적으로 P1 또는 P2 설치류 신생아 뇌에서 생성되고 최소 10일 동안 성상교세포와 공동 배양됩니다. 그런 다음 미세아교세포를 오비탈 셰이커를 사용하?...

공개

저자는 이해 상충이 없음을 선언합니다.

감사의 말

피규어는 바이오렌더를 사용하여 생성되었습니다. 연구는 Inserm, Université de Paris, Horizon 2020 (PREMSTEM-874721), Fondation de France, Fondation de France, Fondation pour la Recherche sur le Cerveau, Fondation Grace de Monaco, Investissement d' Avenir -ANR-11-INBS-0011-NeurATRIS 및 Investissement d' Avenir -ANR-17-EURE-001-EUR G.E.N.E.의 추가 보조금을 지원합니다.

자료

NameCompanyCatalog NumberComments
Anti mouse ACSA-2 PE Vio 615Miltenyi Biotec130-116-246
Anti mouse CD11b BV421Sony Biotechnology1106255
Anti mouse CD45 BV510Sony Biotechnology1115690
Anti mouse CX3CR1 PE Cy7Sony Biotechnology1345075
Anti mouse NeuN PEMilli-MarkFCMAB317PE
anti mouse O4 Vio Bright B515Miltenyi Biotec130-120-016
BD Cytofix/Cytoperm permeabilization kitBD Biosciences554655
Bovine Serum AlbuminMiltenyi Biotec130-091-376
CD11b (Microglia) MicroBeads, h, mMiltenyi Biotec130-093-634
Confocal microscopeLeica TCS SP8
D-PBS (10x)Thermo Scientific14200067
EDTASigma-AldrichE1644
Falcon Cell culture 12-well plate, flat bottom + lidDutscher353043
Falcon Cell culture 96-well plate, flat bottom + lidDutscher353072
Falcon tubes 50 mLDutscher352098
Fc blocking reagent (Mouse CD16/32)BD Biosciences553142
Fluorescence microscopeNikon ECLIPSE TE300
gentleMACS C Tubes (4 x 25 tubes)Miltenyi Biotec130-096-334
gentleMACS Octo Dissociator with HeatersMiltenyi Biotec130-096-427
Hanks' Balanced Salt Solution (HBSS) +CaCl2 +MgCl2 10xThermo Scientific14065049
Hanks' Balanced Salt Solution (HBSS) -CaCl2 -MgCl2 10xThermo Scientific14185045
iQ SYBR Green SupermixBio-rad1725006CUST
Iscript c-DNA synthesisBio-rad1708890
Latex beads, amine-modified polystyrene, fluorescent redSigma-AldrichL2776-1mL
Lipopolysaccharides (LPS) from Escherichia coli O55:B5Sigma-AldrichL2880
Macrophage-SFM serum-free mediumThermo Scientific12065074
MACS BSA Stock SolutionMiltenyi Biotec130-091-376
MACS SmartStrainers (70 μm), 4 x 25 pcsMiltenyi Biotec130-110-916
Mouse IgG1 PEMilliporeMABC002H
Mouse IgG2a PE Cy7Sony Biotechnology2601265
Mouse IL1 betaMiltenyi Biotec130-101-684
Multi-24 Column BlocksMiltenyi Biotec130-095-691
MultiMACS Cell24 SeparatorMiltenyi Biotec
Neural Tissue Dissociation Kit - PapainMiltenyi Biotec130-092-628
Nucleocounter NC-200Chemometec
Nucleospin RNA Plus XSMacherey Nagel740990.5
Nun EZFlip Top Conical Centrifuge TubesThermo Scientific362694
OPTILUX Petri dish - 100 x 20 mmDutscher353003
Pénicilline-streptomycine (10 000 U/mL)Thermo Scientific15140122
Rat IgG2b, k BV421BD Biosciences562603
Rat IgG2b, k BV510Sony Biotechnology2603230
REA control (S) PE vio 615Miltenyi Biotec130-104-616
REA control (S) Vio Bright B515Miltenyi Biotec130-113-445
Recombinant Mouse IFN-gamma ProteinR&D System485-MI
Recombinant Mouse IL-10 ProteinR&D System417-ML
Recombinant Mouse IL-4 ProteinR&D System404-ML
RIPA BufferSigma-AldrichR0278
Viability probe (FVS780)BD Biosciences565388

참고문헌

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