일차 세포 배양을 위한 Neonate 마우스의 미세아교세포의 자기 분리

요약

1차 미세아교세포 배양은 일반적으로 새로운 항염증 분자를 평가하는 데 사용됩니다. 본 프로토콜은 신생아 새끼로부터 미세아교세포를 자기적으로 분리하는 재현 가능하고 관련성 있는 방법을 설명합니다.

초록

뇌에 상주하는 대식세포인 미세아교세포는 환경 스트레스에 대한 반응과 뇌 항상성을 포함한 여러 기능의 기본입니다. 미세아교세포는 광범위한 활성화 표현형을 채택할 수 있습니다. 또한, 전 염증성 표현형을지지하는 미세 아교 세포는 신경 발달 및 신경 퇴행성 장애와 관련이 있습니다. 시험관 내 연구는 특정 세포 유형에서 잠재적 인 치료 전략을 평가하기위한 연구에 널리 사용됩니다. 이러한 맥락에서 일차 소교세포 배양을 사용하여 시험관 내에서 미세아교세포 활성화 및 신경염증을 연구하는 것이 소교세포 세포주 또는 줄기세포 유래 미세아교세포보다 더 관련이 있습니다. 그러나 일부 1 차 배양의 사용은 재현성이 부족할 수 있습니다. 이 프로토콜은 신생아 새끼에서 미세아교세포를 자기적으로 분리하는 재현 가능하고 관련성 있는 방법을 제안합니다. mRNA 발현 정량화 및 Cy3-비드 식세포 분석에 의한 4시간 및 24시간 후 여러 자극을 사용한 미세아교세포 활성화가 여기에서 입증됩니다. 현재의 연구는 청소년 발달 단계에서 생리 학적으로 관련된 미세 아교 세포를 분리하기위한 쉽게 재현 가능한 기술을 제공 할 것으로 기대된다.

서문

미세아교세포는 초기 배^{아 발달 동안} 신경 상피로 이동하는 난황낭의 적혈구 생성 전구체에서 유래한 중추신경계에 상주하는 대식세포 유사 세포입니다1. 면역 기능 외에도 신경 발달 중, 특히 시냅스 형성, 신경 항상성 및 수초화²에 중요한 역할을합니다. 성인기에 미세아교세포는 환경을 지속적으로 스캔하기 위해 긴 세포 과정을 발달시킵니다. 뇌 손상이나 뇌 질환과 같은 항상성 파열의 경우, 미세 아교 세포는 형태 학적 모양을 변경하여 아메보이드 모양을 채택하고 손상된 부위로 이동하여 많은 세포 보호 또는 세포 독성 인자를 증가 및 방출 할 수 있습니다. 미세아교세포는 발달 단계와 ^3,4,5 지속되는 부상 유형에 따라 이질적인 활성화 상태를 갖습니다. 이 연구에서 이러한 활성화 상태는 크게 세 가지 표현형으로 분류됩니다 : 전 염증 / 식세포, 항 염증 및 면역 조절, 실제로는 상황이 더 복잡 할 가능성이 있음을 명심하십시오⁶.

생체 내 소교세포....

프로토콜

프로토콜은 승인되었고 모든 동물은 Institut National de la Santé et de la Recherche Scientifique (Inserm, France)의 기관 지침에 따라 처리되었습니다. 6웰, 12웰 또는 96웰 플레이트로 분할된 P8에서 24개의 OF1 마우스 새끼(수컷과 암컷 모두)의 뇌에서 미세아교세포의 자기 분리가 제시됩니다. 실험 작업은 멸균 상태를 유지하기 위해 후드 하에서 수행되었습니다.

1. 분리 및 세포 배양을 위한 멸균 용액의 제조

1. 시판되는 50x 용액에서^{Ca 2} + 및 Mg²⁺ (HBSS^-/-)가없는 1x 행크스 균형 소금 용액 (HBSS) 10mL를 준비하십시오 ( 재료 표 참조).
2. 시판되는 조직 해리 키트를 사용하여 표 1 에 제공된 조성에 따라 해리 혼합물을 제조한다( 재료 표 참조).
3. 시판되는 10x 용액에서^Ca2+ 및 Mg 2+(HBSS^+/+)가 포함된 1x HBSS^200mL를 준비합니다.
....

결과

미세아교세포는 환경적 문제(외상, 독성 분자, ^{염증)4,5,6,34}에 노출될 때 활성화되는 CNS 상주 대식세포입니다(그림 3A). 미세아교세포에 대한 시험관 내 연구는 일반적으로 이러한 환경적 문제와 관련된 세포 자율 메커니즘을 평가하고 약리학적 또는 유전적 조작 후 활성화.......

토론

현재 연구는 자기적으로 분류된 CD11b+ 세포를 사용하는 1차 소교세포 배양을 제시합니다. 소교세포 기능 평가(RT-qPCR 및 식세포 분석) 외에도 미세아교세포 배양 순도도 측정되었습니다.

고전적인 미세아교세포 세포 배양은 일반적으로 P1 또는 P2 설치류 신생아 뇌에서 생성되고 최소 10일 동안 성상교세포와 공동 배양됩니다. 그런 다음 미세아교세포를 오비탈 셰이커를 사용하?.......

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
Anti mouse ACSA-2 PE Vio 615	Miltenyi Biotec	130-116-246
Anti mouse CD11b BV421	Sony Biotechnology	1106255
Anti mouse CD45 BV510	Sony Biotechnology	1115690
Anti mouse CX3CR1 PE Cy7	Sony Biotechnology	1345075
Anti mouse NeuN PE	Milli-Mark	FCMAB317PE
anti mouse O4 Vio Bright B515	Miltenyi Biotec	130-120-016
BD Cytofix/Cytoperm permeabilization kit	BD Biosciences	554655
Bovine Serum Albumin	Miltenyi Biotec	130-091-376
CD11b (Microglia) MicroBeads, h, m	Miltenyi Biotec	130-093-634
Confocal microscope	Leica TCS SP8
D-PBS (10x)	Thermo Scientific	14200067
EDTA	Sigma-Aldrich	E1644
Falcon Cell culture 12-well plate, flat bottom + lid	Dutscher	353043
Falcon Cell culture 96-well plate, flat bottom + lid	Dutscher	353072
Falcon tubes 50 mL	Dutscher	352098
Fc blocking reagent (Mouse CD16/32)	BD Biosciences	553142
Fluorescence microscope	Nikon ECLIPSE TE300
gentleMACS C Tubes (4 x 25 tubes)	Miltenyi Biotec	130-096-334
gentleMACS Octo Dissociator with Heaters	Miltenyi Biotec	130-096-427
Hanks' Balanced Salt Solution (HBSS) +CaCl2 +MgCl2 10x	Thermo Scientific	14065049
Hanks' Balanced Salt Solution (HBSS) -CaCl2 -MgCl2 10x	Thermo Scientific	14185045
iQ SYBR Green Supermix	Bio-rad	1725006CUST
Iscript c-DNA synthesis	Bio-rad	1708890
Latex beads, amine-modified polystyrene, fluorescent red	Sigma-Aldrich	L2776-1mL
Lipopolysaccharides (LPS) from Escherichia coli O55:B5	Sigma-Aldrich	L2880
Macrophage-SFM serum-free medium	Thermo Scientific	12065074
MACS BSA Stock Solution	Miltenyi Biotec	130-091-376
MACS SmartStrainers (70 μm), 4 x 25 pcs	Miltenyi Biotec	130-110-916
Mouse IgG1 PE	Millipore	MABC002H
Mouse IgG2a PE Cy7	Sony Biotechnology	2601265
Mouse IL1 beta	Miltenyi Biotec	130-101-684
Multi-24 Column Blocks	Miltenyi Biotec	130-095-691
MultiMACS Cell24 Separator	Miltenyi Biotec
Neural Tissue Dissociation Kit - Papain	Miltenyi Biotec	130-092-628
Nucleocounter NC-200	Chemometec
Nucleospin RNA Plus XS	Macherey Nagel	740990.5
Nun EZFlip Top Conical Centrifuge Tubes	Thermo Scientific	362694
OPTILUX Petri dish - 100 x 20 mm	Dutscher	353003
Pénicilline-streptomycine (10 000 U/mL)	Thermo Scientific	15140122
Rat IgG2b, k BV421	BD Biosciences	562603
Rat IgG2b, k BV510	Sony Biotechnology	2603230
REA control (S) PE vio 615	Miltenyi Biotec	130-104-616
REA control (S) Vio Bright B515	Miltenyi Biotec	130-113-445
Recombinant Mouse IFN-gamma Protein	R&D System	485-MI
Recombinant Mouse IL-10 Protein	R&D System	417-ML
Recombinant Mouse IL-4 Protein	R&D System	404-ML
RIPA Buffer	Sigma-Aldrich	R0278
Viability probe (FVS780)	BD Biosciences	565388