JoVE Logo
АВТОРЫ
СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

Войдите в систему

Для просмотра этого контента требуется подписка на Jove Войдите в систему или начните бесплатную пробную версию.

В этой статье

  • Резюме
  • Аннотация
  • Введение
  • протокол
  • Результаты
  • Обсуждение
  • Раскрытие информации
  • Благодарности
  • Материалы
  • Ссылки
  • Перепечатки и разрешения

Резюме

Первичные культуры микроглии обычно используются для оценки новых противовоспалительных молекул. Настоящий протокол описывает воспроизводимый и релевантный метод магнитной изоляции микроглии от новорожденных детенышей.

Аннотация

Микроглия, как макрофаги-резиденты мозга, имеют основополагающее значение для нескольких функций, включая реакцию на стресс окружающей среды и гомеостаз мозга. Микроглия может принимать большой спектр фенотипов активации. Кроме того, микроглия, которая поддерживает провоспалительный фенотип, связана как с нейроразвитием, так и с нейродегенеративными расстройствами. Исследования in vitro широко используются в исследованиях для оценки потенциальных терапевтических стратегий в конкретных типах клеток. В этом контексте изучение активации микроглии и нейровоспаления in vitro с использованием первичных культур микроглии более актуально, чем линии микроглиальных клеток или микроглии, полученные из стволовых клеток. Однако использование некоторых первичных культур может страдать от отсутствия воспроизводимости. Этот протокол предлагает воспроизводимый и релевантный метод магнитного выделения микроглии от новорожденных детенышей. Здесь демонстрируется активация микроглии с использованием нескольких стимулов через 4 ч и 24 ч путем количественного определения экспрессии мРНК и фагоцитарного анализа Cy3-шариков. Ожидается, что текущая работа обеспечит легко воспроизводимый метод выделения физиологически значимой микроглии от стадий развития несовершеннолетних.

Введение

Микроглии представляют собой резидентные макрофагоподобные клетки центральной нервной системы, полученные из эритропоэтических предшественников желточного мешка, которые мигрируют в нейроэпителий во время раннего эмбрионального развития1. Помимо своих иммунных функций, они также играют значительную роль во время нервного развития, особенно для синаптогенеза, гомеостаза нейронов и миелинизации2. Во взрослом возрасте микроглия развивает длительные клеточные процессы для непрерывного сканирования окружающей среды. В случае разрывов гомеостаза, таких как черепно-мозговая травма или заболевание головного мозга, микроглия может изменить свой морфологический вид, чтобы принять амебоидную форму, мигрировать в поврежденную область, увеличить и высвободить многие цитопротекторные или цитотоксические факторы. Микроглии имеют гетерогенные состояния активации в зависимости от стадии их развития и типа полученной травмы 3,4,5. В этом исследовании эти состояния активации широко классифицируются на три различных фенотипа: провоспалительные / фагоцитарные, противовоспалительные и иммунорегуляторные, имея в виду, что в действительности ситуация, вероятно, будет более сложной6.

Изучение in vivo активации микроглии и скрининг нейропротекторных стратегий на ранних стадиях развития мозга может быть сложной задачей из-за (1) хрупкости животных перед отъемом и (2) низкого количества клеток микроглии. Поэтому исследования in vitro на микроглии широко используются для токсичности 7,8,9, нейропротекторных стратегий 5,10,11,12,13,14 и ко-культур 15,16,17,18,19,20,21 . В исследованиях in vitro могут использоваться либо линии микроглиальных клеток, микроглия, полученная из стволовых клеток, либо первичная культура микроглии. Все эти подходы имеют свои преимущества и недостатки, а выбор зависит от исходного биологического вопроса. Преимуществами использования первичных культур микроглии являются однородный генетический фон, история без патогенов и контроль времени, когда микроглия стимулируется после смерти животных22.

На протяжении многих лет были разработаны различные методы (проточная цитометрия, встряхивание или магнитная маркировка) для культивирования первичной микроглии из грызунов, как новорожденных, так и взрослых 23,24,25,26,27,28,29. В настоящей работе выделение микроглии из детенышей новорожденных мышей выполняется с использованием ранее описанной технологии сортировки клеток с магнитной активацией с использованием покрытого микрогранулами антимышьего CD11b 25,27,29. CD11b представляет собой интегрин-рецептор, экспрессируемый на поверхности миелоидных клеток, включая микроглию. Когда в мозге нет воспалительных проблем, почти все клетки CD11b + являются микроглией30. По сравнению с другими ранее опубликованными методами 23,24,25,26,27,28,29, настоящий протокол уравновешивает немедленный анализ активации микроглии ex vivo и общую культуру первичной микроглии in vitro. Таким образом, микроглии (1) выделяют на послеродовой день (P)8 без удаления миелина, (2) культивируют без сыворотки и (3) подвергают воздействию siRNA, miRNA, фармакологических соединений и/или воспалительных стимулов только через 48 ч после выделения мозга. Каждый из этих трех аспектов делает текущий протокол актуальным и быстрым. Прежде всего, использование детской микроглии позволяет получать динамические и реакционноспособные жизнеспособные клетки в культуре, не требуя дополнительного этапа демиелинизации, который потенциально может модифицировать реактивность микроглии in vitro. Настоящий протокол направлен на то, чтобы максимально приблизиться к физиологической среде микроглии. Действительно, микроглия никогда не сталкивается с сывороткой, и этот протокол также не требует использования сыворотки. Более того, воздействие микроглии уже через 48 ч после посева предотвращает потерю ими физиологических способностей.

протокол

Протокол был одобрен, и все животные были обработаны в соответствии с институциональными руководящими принципами Национального института святого и научно-исследовательского исследования (Инсерм, Франция). Представлена магнитная изоляция микроглии из мозга 24 детенышей мышей OF1 (как самцов, так и самок) при Р8, разделенных на 6-луночную, 12-луночную или 96-луночную пластины. Экспериментальные работы выполнялись под капотом для поддержания стерильных условий.

1. Приготовление стерильных растворов для выделения и культивирования клеток

  1. Приготовьте 50 мл 1x сбалансированного солевого раствора Хэнкса (HBSS) без Ca2+ и Mg2+ (HBSS-/-) из коммерчески доступного 10-кратного раствора (см. Таблицу материалов).
  2. Готовят диссоциационную смесь в соответствии с композицией, представленной в Таблице 1 , используя коммерчески доступный набор для диссоциации тканей (см. Таблицу материалов).
  3. Приготовьте 200 мл 1x HBSS с Ca2+ и Mg2+ (HBSS+/+) из коммерчески доступного 10-кратного раствора.
  4. Приготовьте 200 мл 1x PBS + 0,5% BSA (называемый буфером сортировки ячеек).
  5. Готовят CD11b-микрошарики согласно таблице 2.
  6. Готовят 500 мл безымянной культуральной среды макрофагов (SFM) + 1% пенициллина-стрептомицина (P/S). Сделайте аликвоты из трубок по 50 мл и храните их при 4 °C. Это упоминается как среда микроглии позже в тексте.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Все изоляционные растворы должны быть свежеприготовлены в стерильных условиях в день эксперимента и храниться на льду. Культурная среда клеток микроглии может быть приготовлена, аликвотирована в пробирках по 50 мл и сохранена при 4 °C для будущего использования. Фильтрация не требуется.

2. Рассечение мозга

  1. Обезглавить голову щенка с помощью больших ножниц без предварительной общей анестезии.
  2. Вырежьте кожу от шеи до носа после сагиттального шва (15-20 мм) небольшими ножницами (рисунок 1А-С).
  3. Вставьте маленькие кончики ножниц в Foramen magnum параллельно черепу. Аккуратно вырежьте с каждой стороны до глаз (рисунок 1D,E).
  4. Разрезать между глазами маленькими ножницами, чтобы отделить череп и мозг от головы (рисунок 1F).
  5. Двумя щипцами схватите череп близко к обонятельным луковицам и осторожно порвите череп, следя за тем, чтобы не повредить нижележащий мозг (рисунок 1G-I).
  6. Удалите мозжечок и обонятельную луковицу лезвием бритвы и разрежьте мозг на две части (рисунок 1J).
  7. Поместите кусочки мозга в чашку Петри, содержащую 30-40 мл HBSS-/- (рисунок 1K).

3. Диссоциация мозга и магнитная микроглиальная изоляция

ПРИМЕЧАНИЕ: Все клеточные манипуляции и повторные суспензии должны выполняться с пипеткой 1000 мкл с большой осторожностью. Применение высокого механического воздействия может активировать или убить клетки микроглии.

  1. Переложить 12 кусочков мозга (~1,2 г) на диссоциационную трубку, содержащую диссоциационную смесь согласно таблице 1. Для 24 детенышей требовалось четыре С-трубки (рисунок 2A-B).
  2. Поместите C-трубки на диссоциатор (с режимом нагрева). Запустите оптимизированную программу NTDK в оборудовании в соответствии с инструкцией производителя (рисунок 2D).
  3. Центрифуга при 300 х г в течение 20 с (при 4 °C) для сбора всех клеток. Завершите механическую диссоциацию, трижды пипеткой вверх и вниз пипеткой объемом 1000 мкл (рисунок 2E).
  4. Переведите клетки в четыре трубки по 15 мл + сетчатые фильтры. Промыть ситечки 10 мл HBSS+/+ (рисунок 2F).
  5. Центрифугу при 300 х г в течение 10 мин (при 4 °С) и удаляют супернатант. Осторожно повторно суспендируйте гранулы с 10 мл HBSS+/+ (рисунок 2G).
  6. Центрифугу при 300 х г в течение 10 мин (при 4 °С) и удаляют супернатант. Осторожно повторно суспендируйте гранулу с 6 мл сортировочного буфера (этап 1.4) (рисунок 2H).
  7. Центрифугу при 300 х г в течение 10 мин (при 4 °С) и удаляют супернатант. Добавьте 200 мкл раствора CD11b-микрогранул (этап 1,5) на пробирку и осторожно повторно суспендируйте (рисунок 2I).
  8. Инкубировать тубы в течение 15-20 мин при 4 °C. Аккуратно повторно суспендировать гранулы с 6 мл сортировочного буфера (рисунок 2I-J).
  9. Центрифугу при 300 х г в течение 10 мин (при 4 °С) и удаляют супернатант. Аккуратно повторно суспендируйте гранулы с 8 мл сортировочного буфера (рисунок 2K).
  10. Следуйте программе POSSEL на сепараторе (см. Таблицу материалов), чтобы подготовить восемь столбцов. Перенесите ячейки 1 мл на 1 мл на колонку. Подождите, пока все ячейки пройдут, прежде чем добавлять еще один мл. Клетки Elute CD11b+ на стерильной элюционной пластине с 1 мл сортировочного буфера (рисунок 2л).
  11. Пул клеток CD11b+ в новой трубке объемом 50 мл (рисунок 2M).
  12. Центрифугу при 300 х г в течение 10 мин (при 4 °С) и удаляют супернатант. Осторожно повторно суспендируйте гранулу 10 мл холодной микроглиевой среды (шаг 1.6) (рисунок 2N).
  13. Подсчитайте ячейки CD11b+. При P8 человек должен получить ~ 650 000 клеток на мозг.
    ПРИМЕЧАНИЕ: В настоящем протоколе ячейки подсчитывались с помощью автоматизированного счетчика ячеек (см. Таблицу материалов).
  14. Повторно суспендируют клетки в холодной среде микроглии до конечной концентрации 650 000-700 000 клеток/мл и дозируют в пластинах клеточной культуры.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Плиты с 6 скважинами предназначены для Западного Блота (2 мл на скважину); 12-луночные пластины предназначены для анализа RT-qPCR (1 мл на скважину), а пластины из 96 скважин предназначены для фагоцитарного анализа (250 мкл на скважину); все три были использованы для этой работы. Однако в этой рукописи результаты анализа Вестерн Блот не показаны, но можно выполнить с этим протоколом.
  15. Поместите пластины при температуре 37 °C с 5% CO2 на ночь. Осторожно замените среду пипеткой объемом 1000 мкл с предварительно нагретой средой микроглии.
  16. Поместите пластины при температуре 37 °C с 5% CO2 на ночь перед стимуляцией.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Выделение микроглии от более чем 36 щенков и после Р9 не рекомендуется. Это увеличит риск загрязнения и накопления клеточного мусора для активации микроглии.

4. Клеточная стимуляция

  1. Готовят стимулирующие реагенты согласно таблице 3 с использованием коммерчески доступных реагентов (см. Таблицу материалов).
  2. Добавьте соответствующий объем в каждый хорошо стимулируемый.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Соответствующий объем зависит от концентрации стимула и размера скважины.
  3. Поместите пластины при температуре 37 °C с 5% CO2до конца стимуляции через 6 ч, 24 ч или 48 ч.
  4. Для анализа вестерн-блотт аспирировать супернатант и добавить 50 мкл буфера лизиса белка (см. Таблицу материалов) пипеткой. Используя наконечники, поцарапайте нижнюю часть пластины, чтобы отсоединить лизированные ячейки и перенести их в трубки объемом 1,5 мл. Хранить при температуре -80 °C.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Культуральные пластины могут храниться в течение многих лет при -80 °C, если супернатант аспирирован правильно.
  5. Для анализа RT-qPCR 6,31 аспирируют супернатант и хранят питательные пластины непосредственно при -80 °C до экстракции мРНК (этап 5).
  6. Фагоцитарный анализ см. в шаге 6.

5. Экстракция мРНК и анализ RT-qPCR

  1. Выполняйте экстракцию РНК, ОТ-ПЦР и ОТ-qPCR в соответствии с протоколом производителя (см. Таблицу материалов). Последовательности праймеров 5,6,31 приведены в таблице 4.
  2. Выполните анализ RT-qPCR, следуя ранее опубликованному отчету5.

6. Фагоцитарный анализ

  1. Стимулируйте клетки и выполняйте фагоцитарный анализ в течение последних 3 ч стимуляции. Например, для стимуляции через 6 ч начинают фагоцитарный анализ через 3 ч стимуляции; а для стимуляции в течение 12 ч начинают фагоцитарный анализ через 9 ч после начала стимуляции.
  2. Рассчитайте количество бусин, необходимое для приготовления, учитывая соотношение (1 ячейка: 50 бусин). Для одной скважины из 96-луночной плиты требуется 8,1 х 106 бусин. Приготовьте смесь бисера согласно таблице 5.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Тщательно вихрьте флакон с бусинами перед добавлением в смесь PBS/FBS.
  3. Инкубировать в течение 1 ч на водяной бане при 37 °С. Вихрь каждые 10 мин.
  4. Рассчитайте объем раствора для добавления в каждую скважину. Добавить раствор и инкубировать в течение 3 ч.
  5. Промыть скважины три раза с помощью 1x PBS. Считывание флуоресцентного излучения при 550 нм (длина волны излучения Cy3).

7. Контроль качества чистоты

  1. Оцените чистоту магнитной изоляции CD11b методом проточной цитометрии (FACS) (до и после сортировки клеток), а затем выполните RT-qPCR.
    1. Подсчитайте клетки и повторно суспендируйте в буфере FACS (PBS + 2 мМ ЭДТА + 0,5% бычьего сывороточного альбумина) с целью получения разведения 10 х 106 клеток/мл после стадии 3,5 и стадии 3,14.
    2. Через 15 мин обычного Блока Fc32,33 инкубируют клетки в течение 15 мин с помощью зонда жизнеспособности (FVS780) и флуорофор-конъюгированных антител против мышиных CD45, CD11b, CX3CR1, ACSA-2, O4 или соответствующих им контрольных изотипов32,33 в концентрации, рекомендованной производителями (см. Таблицу материалов).
    3. Промывайте ячейки с помощью буфера FACS, фиксируйте и пермеабилизируйте с помощью коммерчески доступного комплекта пермеабилизации (см. Таблицу материалов).
    4. Повторно проводят блокировку Fc на пермеабилизированных клетках, а затем инкубируют с флуорофор-конъюгированным антителом против NeuN (см. Таблицу материалов) или его контрольного изотипа в течение 15 мин.
    5. Выполните анализ FACS после промывки буфером FACS.
    6. После исключения дублетов и мертвых клеток на основе морфологических параметров и окрашивания FVS780 соответственно выбирают стратегию гатинга для поверхностной экспрессии CX3CR1 (микроглия), ACSA-2 (астроциты), O4 (олигодендроциты) и внутриклеточного присутствия NeuN (нейроны) для анализа процента положительных клеток.
  2. После шага 5 извлеките мРНК и выполните RT-qPCR для количественной оценки Itgam (CD11b), Cx3cr1, Olig2, Synaptophysin и Gfap mRNA . Нормализуйте Cq, используя мРНК Rpl13a в качестве репортера , и выполните относительную экспрессию мРНК Itgam .

Результаты

Микроглия - это резидентный макрофаг ЦНС, который активируется при воздействии экологических проблем (травма, токсичные молекулы, воспаление) 4,5,6,34 (Рисунок 3A). Исследования in vitro на микроглии обыч...

Обсуждение

В настоящей работе представлена первичная культура микроглиальных клеток с использованием магнитно отсортированных клеток CD11b+. В дополнение к функциональной оценке микроглии (RT-qPCR и фагоцитарные анализы) также определялась чистота микроглиальной культуры.

Классическ...

Раскрытие информации

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.

Благодарности

Рисунки были созданы с помощью BioRender. Исследования финансируются Inserm, Université de Paris, Horizon 2020 (PREMSTEM-874721), Fondation de France, Fondation ARSEP, Fondation pour la Recherche sur le Cerveau, Fondation Grace de Monaco и дополнительным грантом от Investissement d'Avenir -ANR-11-INBS-0011-NeurATRIS и Investissement d'Avenir -ANR-17-EURE-001-EUR G.E.N.E.

Материалы

NameCompanyCatalog NumberComments
Anti mouse ACSA-2 PE Vio 615Miltenyi Biotec130-116-246
Anti mouse CD11b BV421Sony Biotechnology1106255
Anti mouse CD45 BV510Sony Biotechnology1115690
Anti mouse CX3CR1 PE Cy7Sony Biotechnology1345075
Anti mouse NeuN PEMilli-MarkFCMAB317PE
anti mouse O4 Vio Bright B515Miltenyi Biotec130-120-016
BD Cytofix/Cytoperm permeabilization kitBD Biosciences554655
Bovine Serum AlbuminMiltenyi Biotec130-091-376
CD11b (Microglia) MicroBeads, h, mMiltenyi Biotec130-093-634
Confocal microscopeLeica TCS SP8
D-PBS (10x)Thermo Scientific14200067
EDTASigma-AldrichE1644
Falcon Cell culture 12-well plate, flat bottom + lidDutscher353043
Falcon Cell culture 96-well plate, flat bottom + lidDutscher353072
Falcon tubes 50 mLDutscher352098
Fc blocking reagent (Mouse CD16/32)BD Biosciences553142
Fluorescence microscopeNikon ECLIPSE TE300
gentleMACS C Tubes (4 x 25 tubes)Miltenyi Biotec130-096-334
gentleMACS Octo Dissociator with HeatersMiltenyi Biotec130-096-427
Hanks' Balanced Salt Solution (HBSS) +CaCl2 +MgCl2 10xThermo Scientific14065049
Hanks' Balanced Salt Solution (HBSS) -CaCl2 -MgCl2 10xThermo Scientific14185045
iQ SYBR Green SupermixBio-rad1725006CUST
Iscript c-DNA synthesisBio-rad1708890
Latex beads, amine-modified polystyrene, fluorescent redSigma-AldrichL2776-1mL
Lipopolysaccharides (LPS) from Escherichia coli O55:B5Sigma-AldrichL2880
Macrophage-SFM serum-free mediumThermo Scientific12065074
MACS BSA Stock SolutionMiltenyi Biotec130-091-376
MACS SmartStrainers (70 μm), 4 x 25 pcsMiltenyi Biotec130-110-916
Mouse IgG1 PEMilliporeMABC002H
Mouse IgG2a PE Cy7Sony Biotechnology2601265
Mouse IL1 betaMiltenyi Biotec130-101-684
Multi-24 Column BlocksMiltenyi Biotec130-095-691
MultiMACS Cell24 SeparatorMiltenyi Biotec
Neural Tissue Dissociation Kit - PapainMiltenyi Biotec130-092-628
Nucleocounter NC-200Chemometec
Nucleospin RNA Plus XSMacherey Nagel740990.5
Nun EZFlip Top Conical Centrifuge TubesThermo Scientific362694
OPTILUX Petri dish - 100 x 20 mmDutscher353003
Pénicilline-streptomycine (10 000 U/mL)Thermo Scientific15140122
Rat IgG2b, k BV421BD Biosciences562603
Rat IgG2b, k BV510Sony Biotechnology2603230
REA control (S) PE vio 615Miltenyi Biotec130-104-616
REA control (S) Vio Bright B515Miltenyi Biotec130-113-445
Recombinant Mouse IFN-gamma ProteinR&D System485-MI
Recombinant Mouse IL-10 ProteinR&D System417-ML
Recombinant Mouse IL-4 ProteinR&D System404-ML
RIPA BufferSigma-AldrichR0278
Viability probe (FVS780)BD Biosciences565388

Ссылки

  1. Kierdorf, K., et al. Microglia emerge from erythromyeloid precursors via Pu.1- and Irf8-dependent pathways. Nature Neuroscience. 16 (3), 273-280 (2013).
  2. Wright-Jin, E. C., Gutmann, D. H. Microglia as dynamic cellular mediators of brain function. Trends in Molecular Medicine. 25 (11), 967-979 (2019).
  3. Hellstrom Erkenstam, N., et al. Temporal characterization of microglia/macrophage phenotypes in a mouse model of neonatal hypoxic-ischemic brain injury. Frontiers in Cellular Neuroscience. 10, 286 (2016).
  4. Chhor, V., et al. Role of microglia in a mouse model of paediatric traumatic brain injury. Brain, Behavior, and Immunity. 63, 197-209 (2017).
  5. Van Steenwinckel, J., et al. Decreased microglial Wnt/beta-catenin signalling drives microglial pro-inflammatory activation in the developing brain. Brain. 142 (12), 3806-3833 (2019).
  6. Chhor, V., et al. Characterization of phenotype markers and neuronotoxic potential of polarised primary microglia in vitro. Brain, Behavior, and Immunity. 32, 70-85 (2013).
  7. Di Pietro, P., et al. Bisphenol A induces DNA damage in cells exerting immune surveillance functions at peripheral and central level. Chemosphere. 254, 126819 (2020).
  8. Roque, P. J., Dao, K., Costa, L. G. Microglia mediate diesel exhaust particle-induced cerebellar neuronal toxicity through neuroinflammatory mechanisms. Neurotoxicology. 56, 204-214 (2016).
  9. Yun, H. S., Oh, J., Lim, J. S., Kim, H. J., Kim, J. S. Anti-inflammatory effect of wasp venom in BV-2 microglial cells in comparison with bee venom. Insects. 12 (4), 297 (2021).
  10. Nair, S., et al. Lipopolysaccharide-induced alteration of mitochondrial morphology induces a metabolic shift in microglia modulating the inflammatory response in vitro and in vivo. Glia. 67 (6), 1047-1061 (2019).
  11. Fleiss, B., et al. The anti-inflammatory effects of the small molecule pifithrin-micro on BV2 microglia. Developmental Neuroscience. 37 (4-5), 363-375 (2015).
  12. Dean, J. M., et al. Microglial MyD88 signaling regulates acute neuronal toxicity of LPS-stimulated microglia in vitro. Brain, Behavior, and Immunity. 24 (5), 776-783 (2010).
  13. Tang, Y., Wolk, B., Nolan, R., Scott, C. E., Kendall, D. A. Characterization of subtype selective cannabinoid CB2 receptor agonists as potential anti-inflammatory agents. Pharmaceuticals (Basel). 14 (4), 378 (2021).
  14. Liu, C. P., et al. miR146a reduces depressive behavior by inhibiting microglial activation. Molecular Medicine Reports. 23 (6), 463 (2021).
  15. Aquino, G. V., Dabi, A., Odom, G. J., Zhang, F., Bruce, E. D. Evaluating the endothelial-microglial interaction and comprehensive inflammatory marker profiles under acute exposure to ultrafine diesel exhaust particles in vitro. Toxicology. 454, 152748 (2021).
  16. You, J. E., Jung, S. H., Kim, P. H. The effect of Annexin A1 as a potential new therapeutic target on neuronal damage by activated microglia. Molecules and Cells. 44 (4), 195-206 (2021).
  17. Xie, Z., et al. By regulating the NLRP3 inflammasome can reduce the release of inflammatory factors in the co-culture model of tuberculosis H37Ra strain and rat microglia. Frontiers in Cellular and Infection Microbiology. 11, 637769 (2021).
  18. Ogunrinade, F. A., et al. Zanthoxylum zanthoxyloides inhibits lipopolysaccharide- and synthetic hemozoin-induced neuroinflammation in BV-2 microglia: roles of NF-kappaB transcription factor and NLRP3 inflammasome activation. Journal of Pharmacy and Pharmacology. 73 (1), 118-134 (2021).
  19. Fernandez-Arjona, M. D. M., Leon-Rodriguez, A., Lopez-Avalos, M. D., Grondona, J. M. Microglia activated by microbial neuraminidase contributes to ependymal cell death. Fluids Barriers CNS. 18 (1), 15 (2021).
  20. Du, S., et al. Primary microglia isolation from postnatal mouse brains. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (168), e62237 (2021).
  21. Boccazzi, M., et al. The immune-inflammatory response of oligodendrocytes in a murine model of preterm white matter injury: the role of TLR3 activation. Cell Death & Disease. 12 (2), 166 (2021).
  22. Timmerman, R., Burm, S. M., Bajramovic, J. J. An overview of in vitro methods to study microglia. Frontiers in Cellular Neuroscience. 12, 242 (2018).
  23. Nikodemova, M., Watters, J. J. Efficient isolation of live microglia with preserved phenotypes from adult mouse brain. Journal of Neuroinflammation. 9, 147 (2012).
  24. Bennett, M. L., et al. New tools for studying microglia in the mouse and human CNS. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (12), 1738-1746 (2016).
  25. Bohlen, C. J., Bennett, F. C., Bennett, M. L. Isolation and culture of microglia. Current Protocols in Immunology. 125 (1), 70 (2019).
  26. Schroeter, C. B., et al. One brain-all cells: A comprehensive protocol to isolate all principal CNS-resident cell types from brain and spinal cord of adult healthy and EAE mice. Cells. 10 (3), 651 (2021).
  27. Harms, A. S., Tansey, M. G. Isolation of murine postnatal brain microglia for phenotypic characterization using magnetic cell separation technology. Methods in Molecular Biology. 1041, 33-39 (2013).
  28. Pan, J., Wan, J. Methodological comparison of FACS and MACS isolation of enriched microglia and astrocytes from mouse brain. Journal of Immunological Methods. 486, 112834 (2020).
  29. Montilla, A., Zabala, A., Matute, C., Domercq, M. Functional and metabolic characterization of microglia culture in a defined medium. Frontiers in Cellular Neuroscience. 14, 22 (2020).
  30. Krishnan, M. L., et al. Integrative genomics of microglia implicates DLG4 (PSD95) in the white matter development of preterm infants. Nature Communications. 8 (1), 428 (2017).
  31. Bokobza, C., et al. miR-146b protects the perinatal brain against microglia-induced hypomyelination. Annals of Neurology. 91 (1), 48-65 (2021).
  32. Villapol, S., et al. Early sex differences in the immune-inflammatory responses to neonatal ischemic stroke. International Journal of Molecular Sciences. 20 (15), 3809 (2019).
  33. Rosiewicz, K. S., et al. Comparison of RNA isolation procedures for analysis of adult murine brain and spinal cord astrocytes. Journal of Neuroscience Methods. 333, 108545 (2020).
  34. Fleiss, B., et al. Microglia-mediated neurodegeneration in perinatal brain injuries. Biomolecules. 11 (1), 99 (2021).
  35. Pawelec, P., Ziemka-Nalecz, M., Sypecka, J., Zalewska, T. The Impact of the CX3CL1/CX3CR1 axis in neurological disorders. Cells. 9 (10), 2277 (2020).
  36. Reynolds, R., Cenci di Bello, I., Dawson, M., Levine, J. The response of adult oligodendrocyte progenitors to demyelination in EAE. Progress in Brain Research. 132, 165-174 (2001).
  37. Duan, W., et al. Novel insights into NeuN: From neuronal marker to splicing regulator. Molecular Neurobiology. 53 (3), 1637-1647 (2016).
  38. Kantzer, C. G., et al. Anti-ACSA-2 defines a novel monoclonal antibody for prospective isolation of living neonatal and adult astrocytes. Glia. 65 (6), 990-1004 (2017).
  39. Lee, S., Lee, D. K. What is the proper way to apply the multiple comparison test. Korean Journal of Anesthesiology. 71 (5), 353-360 (2018).
  40. Chao, C. C., Hu, S., Molitor, T. W., Shaskan, E. G., Peterson, P. K. Activated microglia mediate neuronal cell injury via a nitric oxide mechanism. Journal of Immunology. 149 (8), 2736-2741 (1992).
  41. Boje, K. M., Arora, P. K. Microglial-produced nitric oxide and reactive nitrogen oxides mediate neuronal cell death. Brain Research. 587 (2), 250-256 (1992).
  42. Biber, K., Owens, T., Boddeke, E. What is microglia neurotoxicity (Not). Glia. 62 (6), 841-854 (2014).
  43. Biber, K., Neumann, H., Inoue, K., Boddeke, H. W. Neuronal 'On' and 'Off' signals control microglia. Trends in Neurosciences. 30 (11), 596-602 (2007).
  44. Ransohoff, R. M., Cardona, A. E. The myeloid cells of the central nervous system parenchyma. Nature. 468 (7321), 253-262 (2010).
  45. Boucsein, C., Kettenmann, H., Nolte, C. Electrophysiological properties of microglial cells in normal and pathologic rat brain slices. European Journal of Neuroscience. 12 (6), 2049-2058 (2000).
  46. Beutner, C., et al. Unique transcriptome signature of mouse microglia. Glia. 61 (9), 1429-1442 (2013).
  47. Schmid, C. D., et al. Differential gene expression in LPS/IFNgamma activated microglia and macrophages: in vitro versus in vivo. Journal of Neurochemistry. 109, 117-125 (2009).
  48. Srivastava, P. K., et al. A systems-level framework for drug discovery identifies Csf1R as an anti-epileptic drug target. Nature Communications. 9 (1), 3561 (2018).

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на использование текста или рисунков этого JoVE статьи

Запросить разрешение

Смотреть дополнительные статьи

185

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Конфиденциальность

Условия эксплуатации

Политика

СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

РЕКОМЕНДОВАТЬ БИБЛИОТЕКЕ

НОВОСТИ JoVE

Исследования

Образование

АВТОРЫ

Библиотекарь

О JoVE

Авторские права © 2025 MyJoVE Corporation. Все права защищены