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Neste Artigo

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Resumo

Culturas primárias de micróglias são comumente usadas para avaliar novas moléculas anti-inflamatórias. O presente protocolo descreve um método reprodutível e relevante para isolar magneticamente a micróglia de filhotes recém-nascidos.

Resumo

A micróglia, como macrófagos residentes no cérebro, são fundamentais para várias funções, incluindo a resposta ao estresse ambiental e a homeostase cerebral. A micróglia pode adotar um grande espectro de fenótipos de ativação. Além disso, a micróglia que endossa o fenótipo pró-inflamatório está associada a distúrbios neurodesenvolvimentais e neurodegenerativos. Estudos in vitro são amplamente utilizados em pesquisas para avaliar potenciais estratégias terapêuticas em tipos específicos de células. Neste contexto, estudar a ativação microglial e a neuroinflamação in vitro usando culturas microgliais primárias é mais relevante do que as linhagens celulares microgliais ou a microglia derivada de células-tronco. No entanto, o uso de algumas culturas primárias pode sofrer de falta de reprodutibilidade. Este protocolo propõe um método reprodutível e relevante de isolar magneticamente a micróglia de filhotes recém-nascidos. A ativação microglial utilizando vários estímulos após 4 h e 24 h por quantificação da expressão de mRNA e um ensaio fagocítico de esferas Cy3 é demonstrado aqui. Espera-se que o presente trabalho forneça uma técnica facilmente reprodutível para isolar micróglias fisiologicamente relevantes dos estágios de desenvolvimento juvenis.

Introdução

Microglia são as células semelhantes a macrófagos residentes no sistema nervoso central derivadas de precursores eritropoiéticos do saco vitelino que migram para o neuroepitélio durante o desenvolvimento embrionário inicial1. Além de suas funções de imunidade, eles também desempenham um papel significativo durante o neurodesenvolvimento, particularmente para sinaptogênese, homeostase neuronal e mielinização2. Na idade adulta, a micróglia desenvolve longos processos celulares para escanear o ambiente continuamente. Em caso de rupturas de homeostase, como lesão cerebral ou doença cerebral, a micróglia pode alterar sua aparência morfológica para adotar uma forma de ameboide, migrar para a área lesada, aumentar e liberar muitos fatores citoprotetores ou citotóxicos. As micróglias apresentam estados de ativação heterogêneos dependendo do seu estágio de desenvolvimento e do tipo de lesão sofrida 3,4,5. Neste estudo, esses estados de ativação são amplamente classificados em três fenótipos diferentes: pró-inflamatório/fagocítico, anti-inflamatório e imunorregulador, tendo em vista que, na realidade, a situação provavelmente será mais complexa6.

Estudar a ativação microglial in vivo e a triagem de estratégias neuroprotetoras nos estágios iniciais do desenvolvimento cerebral podem ser desafiadores devido (1) à fragilidade dos animais antes do desmame e (2) ao baixo número de células microgliais. Portanto, estudos in vitro sobre micróglias são amplamente utilizados para toxicidade 7,8,9, estratégias neuroprotetoras5,10,11,12,13,14 e coculturas 15,16,17,18,19,20,21 . Estudos in vitro podem usar linhagens celulares microgliais, microglia derivada de células-tronco ou cultura de micróglia primária. Todas essas abordagens têm vantagens e desvantagens, e a escolha depende da questão biológica inicial. Os benefícios do uso de culturas primárias de micróglias são o fundo genético homogêneo, a história livre de patógenos e o controle do momento em que as micróglias são estimuladas após a morte animal22.

Ao longo dos anos, diferentes métodos (citometria de fluxo, agitação ou marcação magnética) foram desenvolvidos para a cultura de micróglias primárias de roedores, tanto recém-nascidos quanto adultos 23,24,25,26,27,28,29. No presente trabalho, o isolamento de micróglias de filhotes de camundongos recém-nascidos é realizado utilizando-se a tecnologia de classificação de células ativadas magneticicamente descritas anteriormente, utilizando CD11b anti-camundongo revestido por microesferas25,27,29. CD11b é um receptor de integrina expresso na superfície das células mielóides, incluindo a micróglia. Quando não há desafio inflamatório dentro do cérebro, quase todas as células CD11b + são microglia30. Comparado a outros métodos publicados anteriormente 23,24,25,26,27,28,29, o presente protocolo equilibra análises de ativação microglial ex vivo imediata e cultura microglial primária in vitro comum. Assim, as micróglias são (1) isoladas no dia pós-natal (P)8 sem remoção de mielina, (2) cultivadas sem soro e (3) expostas a siRNA, miRNA, composto farmacológico e/ou estímulos inflamatórios apenas 48 h após o isolamento cerebral. Cada um desses três aspectos torna o protocolo atual relevante e rápido. Em primeiro lugar, o uso da micróglia pediátrica permite a obtenção de células viáveis dinâmicas e reativas em cultura sem a necessidade de uma etapa adicional de desmielinização que poderia potencialmente modificar a reatividade microglial in vitro. O presente protocolo tem como objetivo aproximar-se o máximo possível do ambiente fisiológico da micróglia. De fato, a micróglia nunca encontra soro, e esse protocolo também não requer o uso de soro. Além disso, expor a micróglia já 48 h após a cultura impede que eles percam suas faculdades fisiológicas.

Protocolo

O protocolo foi aprovado e todos os animais foram manuseados de acordo com as diretrizes institucionais do Institut National de la Santé et de la Recherche Scientifique (Inserm, França). O isolamento magnético da micróglia dos cérebros de 24 filhotes de camundongos OF1 (machos e fêmeas) em P8, divididos em placas de 6 poços, 12 ou 96 poços, são apresentados. O trabalho experimental foi realizado sob um capô para manter as condições estéreis.

1. Preparação de soluções estéreis para isolamento e cultura celular

  1. Prepare 50 mL de 1x Solução Sal Balanceada de Hanks (HBSS) sem Ca 2+ e Mg2+ (HBSS-/-) a partir da solução 10x comercialmente disponível (consulte Tabela de Materiais).
  2. Preparar a mistura de dissociação de acordo com a composição fornecida no Quadro 1 utilizando um kit de dissociação tecidual comercialmente disponível (ver Tabela de Materiais).
  3. Prepare 200 mL de 1x HBSS com Ca 2+ e Mg2+ (HBSS+/+) a partir da solução 10x disponível comercialmente.
  4. Prepare 200 mL de 1x PBS + 0,5% BSA (referido como buffer de classificação celular).
  5. Preparar microesferas CD11b de acordo com a Tabela 2.
  6. Preparar 500 mL de meio de cultura livre de soro de macrófagos (SFM) + 1% de Penicilina-Estreptomicina (P/S). Fazer alíquotas de tubos de 50 ml e armazená-las a 4 °C. Isso é referido como o meio da micróglia mais adiante no texto.
    NOTA: Todas as soluções de isolamento devem ser preparadas na hora em condições estéreis no dia da experimentação e mantidas no gelo. O meio de cultura de células de micróglia pode ser preparado, alicitado em tubos de 50 mL e mantido a 4 °C para uso futuro. A filtração não é necessária.

2. Dissecção cerebral

  1. Decapitar a cabeça do filhote usando uma tesoura grande sem anestesia geral prévia.
  2. Corte a pele do pescoço ao nariz seguindo a sutura sagital (15-20 mm) com tesoura pequena (Figura 1A-C).
  3. Insira as pontas de uma pequena tesoura dentro do forame magno paralelo ao crânio. Corte de cada lado cuidadosamente para os olhos (Figura 1D,E).
  4. Corte entre os olhos com uma pequena tesoura para separar o crânio e o cérebro da cabeça (Figura 1F).
  5. Com duas pinças, agarre o crânio perto dos bulbos olfativos e rasgue o crânio com cuidado, tomando cuidado para não danificar o cérebro subjacente (Figura 1G-I).
  6. Remova o cerebelo e o bulbo olfativo com uma lâmina de barbear e corte o cérebro em dois pedaços (Figura 1J).
  7. Coloque os pedaços cerebrais em uma placa de Petri contendo 30-40 mL de HBSS-/- (Figura 1K).

3. Dissociação cerebral e isolamento microglial magnético

NOTA: Todas as manipulações e resuspensões celulares devem ser realizadas com uma pipeta de 1.000 μL com grande cautela. A aplicação de uma alta ação mecânica pode ativar ou matar as células da micróglia.

  1. Transferir 12 pedaços cerebrais (~1,2 g) por tubo de dissociação contendo mistura de dissociação de acordo com a Tabela 1. Para 24 filhotes, foram necessários quatro tubos C (Figura 2A-B).
  2. Coloque os tubos C no dissociador (com o modo de aquecimento). Inicie o programa NTDK otimizado no equipamento de acordo com as instruções do fabricante (Figura 2D).
  3. Centrifugar a 300 x g durante 20 s (a 4 °C) para recolher todas as células. Complete a dissociação mecânica pipetando três vezes para cima e para baixo com uma pipeta de 1.000 μL (Figura 2E).
  4. Transfira as células para quatro tubos de 15 mL + filtros. Enxaguar os filtros com 10 mL de HBSS+/+ (Figura 2F).
  5. Centrifugar a 300 x g durante 10 min (a 4 °C) e remover o sobrenadante. Ressuspeite cuidadosamente o pellet com 10 mL de HBSS+/+ (Figura 2G).
  6. Centrifugar a 300 x g durante 10 min (a 4 °C) e remover o sobrenadante. Ressuscite cuidadosamente o pellet com 6 mL de tampão de classificação (etapa 1.4) (Figura 2H).
  7. Centrifugar a 300 x g durante 10 min (a 4 °C) e remover o sobrenadante. Adicionar 200 μL de solução de microesferas CD11b (passo 1.5) por tubo e voltar a suspender cuidadosamente (Figura 2I).
  8. Incubar os tubos durante 15-20 min a 4 °C. Ressuspeite cuidadosamente o pellet com 6 mL de tampão de classificação (Figura 2I-J).
  9. Centrifugar a 300 x g durante 10 min (a 4 °C) e remover o sobrenadante. Ressuspeite cuidadosamente o pellet com 8 mL de tampão de classificação (Figura 2K).
  10. Siga o programa POSSEL no separador (consulte Tabela de Materiais) para preparar oito colunas. Transfira células 1 mL por 1 mL na coluna. Aguarde a passagem de todas as células antes de adicionar outro ml. Elute células CD11b+ em placa de eluição estéril com 1 mL de tampão de classificação (Figura 2L).
  11. Agrupe células CD11b+ em um novo tubo de 50 mL (Figura 2M).
  12. Centrifugar a 300 x g durante 10 min (a 4 °C) e remover o sobrenadante. Ressussuscite cuidadosamente o pellet com 10 mL de meio microglia frio (etapa 1.6) (Figura 2N).
  13. Conte as células CD11b+. Em P8, deve-se obter ~ 650.000 células por cérebro.
    NOTA: No presente protocolo, as células foram contadas usando um contador de células automatizado (consulte Tabela de Materiais).
  14. Ressuspender as células em meio microglia frio até uma concentração final de 650.000-700.000 células/mL e dispensar em placas de cultura celular.
    NOTA: As placas de 6 poços são para Western Blot (2 mL por poço); as placas de 12 poços são para análise de RT-qPCR (1 mL por poço), e as placas de 96 poços são para ensaio fagocítico (250 μL por poço); todos os três foram utilizados para este trabalho. No entanto, neste manuscrito, os resultados da análise de Western Blot não são mostrados, mas é possível realizar com este protocolo.
  15. Colocar as placas a 37 °C com 5% de CO2 durante a noite. Mude o meio cuidadosamente com uma pipeta de 1.000 μL com meio microglia pré-aquecido.
  16. Coloque as placas a 37 °C com 5% de CO2 durante a noite antes da estimulação.
    NOTA: O isolamento da micróglia de mais de 36 filhotes e após o P9 não é recomendado. Isso aumentará o risco de contaminação e acúmulo de detritos celulares para ativar a micróglia.

4. Estímulos celulares

  1. Preparar os reagentes de estimulação de acordo com o Quadro 3 utilizando os reagentes comercialmente disponíveis (ver Tabela de Materiais).
  2. Adicione o volume apropriado em cada poço estimulado.
    NOTA: O volume apropriado depende da concentração do estímulo e do tamanho do poço.
  3. Coloque as placas a 37 °C com 5% de CO2até o final da estimulação às 6 h, 24 h ou 48 h.
  4. Para a análise de Western Blot, aspirar o sobrenadante e adicionar 50 μL de tampão de lise proteica (ver Tabela de Materiais) com uma pipeta. Usando pontas, risque o fundo da placa para separar as células lisadas e transferi-las para tubos de 1,5 mL. Conservar a -80 °C.
    NOTA: As placas de cultura podem ser armazenadas durante anos a -80 °C se o sobrenadante for aspirado correctamente.
  5. Para a análise RT-qPCR 6,31, aspirar o sobrenadante e armazenar as placas de cultura diretamente a -80 °C até a extração do RNAm (etapa 5).
  6. Para o ensaio fagocítico, consulte o passo 6.

5. Extração de mRNA e análise RT-qPCR

  1. Execute a extração de RNA, RT-PCR e RT-qPCR seguindo o protocolo do fabricante (consulte Tabela de Materiais). Consulte a Tabela 4 para as sequências de primer 5,6,31.
  2. Execute a análise RT-qPCR seguindo o relatório publicado anteriormente5.

6. Ensaio fagocítico

  1. Estimular as células e realizar ensaio fagocítico durante as últimas 3 h da estimulação. Por exemplo, para estimulação de 6 h, inicie o ensaio fagocítico após 3 h de estimulação; e para estimulação de 12 h, iniciar o ensaio fagocítico 9 h após o início da estimulação.
  2. Calcule o número de contas necessárias para se preparar considerando a proporção (1 célula: 50 contas). Para um poço da placa de 96 poços, são necessárias 8,1 x 106 contas. Preparar a mistura de grânulos de acordo com a Tabela 5.
    NOTA: Vórtice cuidadosamente o frasco para injetáveis de caldo de contas antes de adicionar à mistura PBS/FBS.
  3. Incubar durante 1 h em banho-maria a 37 °C. Vórtice a cada 10 min.
  4. Calcule o volume de solução a ser adicionado a cada poço. Adicionar a solução e incubar durante 3 h.
  5. Lave os poços três vezes com 1x PBS. Leia a emissão de fluorescência a 550 nm (comprimento de onda de emissão Cy3).

7. Controle de qualidade da pureza

  1. Avaliar a pureza do isolamento magnético CD11b por citometria de fluxo (FACS) (antes e após a classificação celular) e, em seguida, realizar o RT-qPCR.
    1. Contar as células e ressuspender em tampão FACS (PBS + 2 mM de EDTA + 0,5% de Albumina Sérica Bovina) para obter uma diluição de 10 x 106 células/mL após a etapa 3.5 e a etapa 3.14.
    2. Após 15 min do bloqueio convencional de Fc 32,33, incubar as células por 15 min com sonda de viabilidade (FVS780) e anticorpos conjugados com fluoróforos contra CD45, CD11b, CX3CR1, ACSA-2, O4 ou seus correspondentes isótipos de controle32,33 na concentração recomendada pelos fabricantes (ver Tabela de Materiais).
    3. Lave as células com tampão FACS, fixe e permeabilize com um kit de permeabilização comercialmente disponível (consulte Tabela de Materiais).
    4. Realize o bloqueio de Fc novamente nas células permeabilizadas e, em seguida, incube com anticorpo conjugado com fluoróforo contra NeuN (ver Tabela de Materiais) ou seu isótipo de controle por 15 min.
    5. Realize a análise FACS após a lavagem com tampão FACS.
    6. Após a exclusão dos dubletos e das células mortas com base em parâmetros morfológicos e coloração FVS780, respectivamente, selecione a estratégia de bloqueio para a expressão superficial de CX3CR1 (micróglia), ACSA-2 (astrócitos), O4 (oligodendrócitos) e presença intracelular de NeuN (neurônios) para a análise da porcentagem de células positivas.
  2. Após a etapa 5, extraia o mRNA e execute o RT-qPCR para quantificar o mRNA Itgam (CD11b), Cx3cr1, Olig2, Synaptophysin e Gfap . Normalize o Cq usando o mRNA Rpl13a como repórter e execute uma expressão relativa ao mRNA do Itgam .

Resultados

A micróglia é o macrófago residente do SNC que é ativado quando exposto a desafios ambientais (trauma, moléculas tóxicas, inflamação)4,5,6,34 (Figura 3A). Estudos in vitro sobre micróglia são comumente usados para avaliar mecanismos autônomos celulares relacionados a esses desafios ambientais e caracterizar o estado de ativação após manipula?...

Discussão

O presente trabalho apresenta uma cultura primária de células microgliais usando células CD11b+ classificadas magneticamente. Além da avaliação funcional microglial (RT-qPCR e ensaios fagocíticos), a pureza da cultura microglial também foi determinada.

Culturas clássicas de células de micróglias são comumente geradas a partir do cérebro de recém-nascidos de roedores P1 ou P2 e co-cultura com astrócitos por pelo menos 10 dias. As micróglias são então separadas mecanicamente us...

Divulgações

Os autores declaram não haver conflitos de interesse.

Agradecimentos

As figuras foram criadas usando BioRender. A investigação é financiada pela Inserm, Université de Paris, Horizonte 2020 (PREMSTEM-874721), Fondation de France, Fondation ARSEP, Fondation pour la Recherche sur le Cerveau, Fondation Grace de Monaco, e uma subvenção adicional do Investissement d'Avenir -ANR-11-INBS-0011-NeurATRIS e Investissement d'Avenir -ANR-17-EURE-001-EUR G.E.N.E.

Materiais

NameCompanyCatalog NumberComments
Anti mouse ACSA-2 PE Vio 615Miltenyi Biotec130-116-246
Anti mouse CD11b BV421Sony Biotechnology1106255
Anti mouse CD45 BV510Sony Biotechnology1115690
Anti mouse CX3CR1 PE Cy7Sony Biotechnology1345075
Anti mouse NeuN PEMilli-MarkFCMAB317PE
anti mouse O4 Vio Bright B515Miltenyi Biotec130-120-016
BD Cytofix/Cytoperm permeabilization kitBD Biosciences554655
Bovine Serum AlbuminMiltenyi Biotec130-091-376
CD11b (Microglia) MicroBeads, h, mMiltenyi Biotec130-093-634
Confocal microscopeLeica TCS SP8
D-PBS (10x)Thermo Scientific14200067
EDTASigma-AldrichE1644
Falcon Cell culture 12-well plate, flat bottom + lidDutscher353043
Falcon Cell culture 96-well plate, flat bottom + lidDutscher353072
Falcon tubes 50 mLDutscher352098
Fc blocking reagent (Mouse CD16/32)BD Biosciences553142
Fluorescence microscopeNikon ECLIPSE TE300
gentleMACS C Tubes (4 x 25 tubes)Miltenyi Biotec130-096-334
gentleMACS Octo Dissociator with HeatersMiltenyi Biotec130-096-427
Hanks' Balanced Salt Solution (HBSS) +CaCl2 +MgCl2 10xThermo Scientific14065049
Hanks' Balanced Salt Solution (HBSS) -CaCl2 -MgCl2 10xThermo Scientific14185045
iQ SYBR Green SupermixBio-rad1725006CUST
Iscript c-DNA synthesisBio-rad1708890
Latex beads, amine-modified polystyrene, fluorescent redSigma-AldrichL2776-1mL
Lipopolysaccharides (LPS) from Escherichia coli O55:B5Sigma-AldrichL2880
Macrophage-SFM serum-free mediumThermo Scientific12065074
MACS BSA Stock SolutionMiltenyi Biotec130-091-376
MACS SmartStrainers (70 μm), 4 x 25 pcsMiltenyi Biotec130-110-916
Mouse IgG1 PEMilliporeMABC002H
Mouse IgG2a PE Cy7Sony Biotechnology2601265
Mouse IL1 betaMiltenyi Biotec130-101-684
Multi-24 Column BlocksMiltenyi Biotec130-095-691
MultiMACS Cell24 SeparatorMiltenyi Biotec
Neural Tissue Dissociation Kit - PapainMiltenyi Biotec130-092-628
Nucleocounter NC-200Chemometec
Nucleospin RNA Plus XSMacherey Nagel740990.5
Nun EZFlip Top Conical Centrifuge TubesThermo Scientific362694
OPTILUX Petri dish - 100 x 20 mmDutscher353003
Pénicilline-streptomycine (10 000 U/mL)Thermo Scientific15140122
Rat IgG2b, k BV421BD Biosciences562603
Rat IgG2b, k BV510Sony Biotechnology2603230
REA control (S) PE vio 615Miltenyi Biotec130-104-616
REA control (S) Vio Bright B515Miltenyi Biotec130-113-445
Recombinant Mouse IFN-gamma ProteinR&D System485-MI
Recombinant Mouse IL-10 ProteinR&D System417-ML
Recombinant Mouse IL-4 ProteinR&D System404-ML
RIPA BufferSigma-AldrichR0278
Viability probe (FVS780)BD Biosciences565388

Referências

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