JoVE Logo
Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • תוצאות
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

תרביות מיקרוגליה ראשוניות משמשות בדרך כלל להערכת מולקולות נוגדות דלקת חדשות. הפרוטוקול הנוכחי מתאר שיטה ניתנת לשחזור ורלוונטית לבידוד מגנטי של מיקרוגליה מגורים יילודים.

Abstract

מיקרוגליה, כמקרופאגים תושבי המוח, הם חיוניים למספר תפקודים, כולל תגובה ללחץ סביבתי והומאוסטזיס מוחי. מיקרוגליה יכולה לאמץ ספקטרום גדול של פנוטיפים של הפעלה. יתר על כן, מיקרוגליה התומכת בפנוטיפ מרובה דלקת קשורה הן להפרעות נוירו-התפתחותיות והן להפרעות נוירודגנרטיביות. מחקרים במבחנה נמצאים בשימוש נרחב במחקר להערכת אסטרטגיות טיפוליות פוטנציאליות בסוגי תאים ספציפיים. בהקשר זה חקר הפעלה מיקרוגליאלית ודלקת עצבית במבחנה באמצעות תרביות מיקרוגליאליות ראשוניות רלוונטי יותר מאשר קווי תאים מיקרוגליאליים או מיקרוגליה שמקורה בתאי גזע. עם זאת, השימוש בכמה תרבויות ראשוניות עלול לסבול מחוסר שכפול. פרוטוקול זה מציע שיטה ניתנת לשחזור ורלוונטית לבידוד מגנטי של מיקרוגליה מגורים יילודים. הפעלה מיקרוגליאלית באמצעות מספר גירויים לאחר 4 שעות ו-24 שעות על ידי כימות ביטוי mRNA ובדיקה פאגוציטית של חרוזי Cy3 מודגמת כאן. העבודה הנוכחית צפויה לספק טכניקה הניתנת לשחזור בקלות לבידוד מיקרוגליה רלוונטית מבחינה פיזיולוגית משלבי התפתחות צעירים.

Introduction

מיקרוגליה (Microglia) הם תאים דמויי מקרופאגים של מערכת העצבים המרכזית, שמקורם במבשרים אריתרופוייטיים של שק החלמון הנודדים לנוירואפיתל במהלך ההתפתחות העוברית המוקדמת1. מלבד תפקודי החסינות שלהם, הם גם ממלאים תפקיד משמעותי במהלך התפתחות עצבית, במיוחד עבור סינפטוגנזה, הומאוסטזיס עצבי ומיאלינציה2. בבגרות, מיקרוגליה מפתחת תהליכים תאיים ארוכים כדי לסרוק את הסביבה ברציפות. במקרה של קרעים הומאוסטזיס כגון פגיעה מוחית או מחלת מוח, מיקרוגליה יכולה לשנות את המראה המורפולוגי שלהם כדי לאמץ צורה אמבואידית, לנדוד לאזור הפגוע, להגדיל ולשחרר גורמים ציטולוגיים או ציטוטוקסיים רבים. למיקרוגליה יש מצבי הפעלה הטרוגניים בהתאם לשלב ההתפתחותי שלהם ולסוג הפציעהשספג 3,4,5. במחקר זה, מצבי הפעלה אלה מסווגים באופן נרחב לשלושה פנוטיפים שונים: פרו-דלקתיים/פאגוציטיים, נוגדי דלקת ואימונו-רגולטוריים, תוך התחשבות בכך שבמציאות, המצב צפוי להיות מורכב יותר6.

חקר ההפעלה המיקרוגליאלית in vivo וסינון אחר אסטרטגיות הגנה עצבית בשלבים מוקדמים של התפתחות המוח יכול להיות מאתגר בשל (1) שבריריותם של בעלי חיים לפני הגמילה ו-(2) המספר הנמוך של תאים מיקרוגליאליים. לכן מחקרים במבחנה על מיקרוגליה נמצאים בשימוש נרחב לרעילות 7,8,9, אסטרטגיות הגנה עצבית5,10,11,12,13,14, ותרביות משותפות 15,16,17,18,19,20,21 . מחקרים במבחנה יכולים להשתמש בקווי תאים מיקרוגליאליים, במיקרוגליה שמקורה בתאי גזע או בתרבית מיקרוגליה ראשונית. לכל הגישות הללו יש יתרונות וחסרונות, והבחירה תלויה בשאלה הביולוגית הראשונית. היתרונות של שימוש בתרביות מיקרוגליה ראשוניות הם הרקע הגנטי ההומוגני, היסטוריה נטולת פתוגנים ושליטה בזמן שבו המיקרוגליה מגורה לאחר מות בעלי חיים22.

במהלך השנים פותחו שיטות שונות (ציטומטריה של זרימה, טלטול או תיוג מגנטי) לגידול מיקרוגליה ראשונית ממכרסמים, הן יילודים והן בוגרים 23,24,25,26,27,28,29. בעבודה הנוכחית, בידוד מיקרוגליה מגורי עכברים מבוצע באמצעות טכנולוגיית מיון תאים המופעלים על ידי מגנט שתוארה קודם לכן באמצעות CD11b 25,27,29 מצופה מיקרובאד נגד עכברים. CD11b הוא קולטן אינטגרין המתבטא על פני השטח של תאים מיאלואידים, כולל מיקרוגליה. כאשר אין אתגר דלקתי במוח, כמעט כל תאי CD11b+ הם מיקרוגליה30. בהשוואה לשיטות אחרות שפורסמו בעבר 23,24,25,26,27,28,29, הפרוטוקול הנוכחי מאזן ניתוחי הפעלה מיקרוגליאליים מיידיים ex vivo ותרבית מיקרוגליאלית ראשונית נפוצה במבחנה. לפיכך, מיקרוגליה (1) מבודדת ביום שלאחר הלידה (P)8 ללא הסרת מיאלין, (2) מבודדת ללא סרום, ו-(3) נחשפת ל-siRNA, miRNA, תרכובת פרמקולוגית ו/או גירויים דלקתיים רק 48 שעות לאחר בידוד המוח. כל אחד משלושת ההיבטים הללו הופך את הפרוטוקול הנוכחי לרלוונטי ומהיר. ראשית, השימוש במיקרוגליה ילדים מאפשר קבלת תאים בני קיימא דינמיים ותגובתיים בתרבית ללא צורך בצעד נוסף של דה-מיאלינציה שעשוי לשנות את תגובתיות המיקרוגליה במבחנה. הפרוטוקול הנוכחי נועד להתקרב ככל האפשר לסביבה הפיזיולוגית של המיקרוגליה. ואכן, מיקרוגליה לעולם אינה נתקלת בסרום, וגם פרוטוקול זה אינו דורש שימוש בסרום. יתר על כן, חשיפת מיקרוגליה כבר 48 שעות לאחר התרבית מונעת מהם לאבד את יכולותיהם הפיזיולוגיות.

Protocol

הפרוטוקול אושר, וכל בעלי החיים טופלו על פי ההנחיות המוסדיות של המכון הלאומי למחקרי ביטחון לאומי (Inserm, צרפת). בידוד מגנטי של מיקרוגליה ממוחם של 24 גורי עכברי OF1 (זכר ונקבה כאחד) ב-P8, המחולק לצלחות של 6 בארות, 12 בארות, או 96 בארות. העבודה הניסיונית בוצעה מתחת למכסה מנוע כדי לשמור על תנאים סטריליים.

1. הכנת תמיסות סטריליות לבידוד ותרבית תאים

  1. הכן 50 מ"ל של תמיסת מלח מאוזנת (HBSS) של הנקס ללא Ca 2+ ו-Mg2+ (HBSS-/-) מתמיסת 10x הזמינה מסחרית (ראה טבלת חומרים).
  2. הכינו תערובת דיסוציאציה בהתאם להרכב המופיע בטבלה 1 באמצעות ערכת דיסוציאציה מסחרית של רקמות (ראו טבלת חומרים).
  3. הכן 200 מ"ל של HBSS אחד עם Ca 2+ ו-Mg2+ (HBSS+/+) מפתרון 10x הזמין מסחרית.
  4. הכן 200 מ"ל של 1x PBS + 0.5% BSA (המכונה מאגר מיון תאים).
  5. הכן CD11b-microads לפי טבלה 2.
  6. הכינו 500 מ"ל של מדיום תרבית ללא סרום מקרופאגים (SFM) + 1% של פניצילין-סטרפטומיצין (P/S). לעשות aliquots של צינורות 50 מ"ל ולאחסן אותם ב 4 °C (60 °F). זה מכונה מדיום המיקרוגליה בהמשך הטקסט.
    הערה: כל תמיסות הבידוד חייבות להיות מוכנות טריות בתנאים סטריליים ביום הניסוי ולהישמר על קרח. ניתן להכין מדיום של תרבית תאי מיקרוגליה, להתרומם בצינורות של 50 מ"ל, ולהישמר בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס לשימוש עתידי. אין צורך בסינון.

2. דיסקציה מוחית

  1. ערפו את ראשו של הגור באמצעות מספריים גדולים ללא הרדמה כללית קודמת.
  2. חתכו את העור מהצוואר לאף בעקבות התפר הסגיטלי (15-20 מ"מ) בעזרת מספריים קטנים (איור 1A-C).
  3. הכנס קצה מספריים קטן בתוך מגנום פורמן במקביל לגולגולת. חותכים מכל צד בזהירות לעיניים (איור 1D,E).
  4. חתכו בין העיניים עם מספריים קטנים כדי לנתק את הגולגולת והמוח מהראש (איור 1F).
  5. בעזרת שני מלקחיים, תפסו את הגולגולת קרוב לנורות חוש הריח וקרעו את הגולגולת בזהירות, תוך הקפדה שלא לפגוע במוח שמתחתיה (איור 1G-I).
  6. הסירו את המוח הקטן ואת הנורה האולפת בעזרת סכין גילוח וחתכו את המוח לשני חלקים (איור 1J).
  7. הניחו את חלקי המוח בצלחת פטרי המכילה 30-40 מ"ל של HBSS-/- (איור 1K).

3. דיסוציאציה מוחית ובידוד מיקרוגליאלי מגנטי

הערה: כל המניפולציות והחידושים של התאים חייבים להתבצע עם פיפטה של 1,000 μL בזהירות רבה. הפעלת פעולה מכנית גבוהה עלולה להפעיל או להרוג תאי מיקרוגליה.

  1. העבר 12 חתיכות מוח (~ 1.2 גרם) לכל צינור דיסוציאציה המכיל תערובת דיסוציאציה לפי טבלה 1. עבור 24 גורים היה צורך בארבע צינורות C (איור 2A-B).
  2. מניחים צינורות C על הדיסוציאטור (עם מצב חימום). הפעל את תוכנית NTDK הממוטבת בציוד בהתאם להוראת היצרן (איור 2D).
  3. צנטריפוגה ב 300 x גרם במשך 20 שניות (ב 4 מעלות צלזיוס) כדי לאסוף את כל התאים. השלם את הדיסוציאציה המכנית על-ידי פיפטה שלוש פעמים למעלה ולמטה באמצעות פיפטה של 1,000 μL (איור 2E).
  4. מעבירים את התאים לארבעה צינורות 15 מ"ל + מסננים. שטפו את המסננים ב-10 מ"ל של HBSS+/+ (איור 2F).
  5. צנטריפוגה ב 300 x גרם במשך 10 דקות (ב 4 מעלות צלזיוס) ולהסיר את supernatant. החזירו בזהירות את הכדור עם 10 מ"ל של HBSS+/+ (איור 2G).
  6. צנטריפוגה ב 300 x גרם במשך 10 דקות (ב 4 מעלות צלזיוס) ולהסיר את supernatant. החזירו בזהירות את הכדור עם מאגר מיון של 6 מ"ל (שלב 1.4) (איור 2H).
  7. צנטריפוגה ב 300 x גרם במשך 10 דקות (ב 4 מעלות צלזיוס) ולהסיר את supernatant. הוסף 200 μL של תמיסת CD11b-microbead (שלב 1.5) לכל צינור והשהה מחדש בזהירות (איור 2I).
  8. לדגור את הצינורות במשך 15-20 דקות ב 4 מעלות צלזיוס. החזירו בזהירות את הכדור עם מאגר מיון של 6 מ"ל (איור 2I-J).
  9. צנטריפוגה ב 300 x גרם במשך 10 דקות (ב 4 מעלות צלזיוס) ולהסיר את supernatant. החזירו בזהירות את הכדור עם חיץ מיון של 8 מ"ל (איור 2K).
  10. עקוב אחר תוכנית POSSEL על המפריד (ראה טבלת חומרים) כדי להכין שמונה עמודות. העבר תאים 1 מ"ל על 1 מ"ל בעמודה. המתן עד שכל התאים יעברו לפני הוספת מ"ל נוסף. תאי CD11b+ אלוטים על צלחת אלוציה סטרילית עם מאגר מיון של 1 מ"ל (איור 2L).
  11. מאגר תאי CD11b+ בצינור חדש של 50 מ"ל (איור 2M).
  12. צנטריפוגה ב 300 x גרם במשך 10 דקות (ב 4 מעלות צלזיוס) ולהסיר את supernatant. החזירו בזהירות את הכדור עם 10 מ"ל של מדיום מיקרוגליה קרה (שלב 1.6) (איור 2N).
  13. ספירת תאי CD11b+ . ב-P8 יש להשיג ~650,000 תאים לכל מוח.
    הערה: בפרוטוקול הנוכחי, התאים נספרו באמצעות מונה תאים אוטומטי (ראה טבלת חומרים).
  14. יש לתלות את התאים במדיום מיקרוגליה קרה לריכוז סופי של 650,000-700,000 תאים/מ"ל ולוותר על צלחות תרבית תאים.
    הערה: לוחות 6 באר הם עבור כתם מערבי (2 מ"ל לכל באר); לוחות 12 הבאר מיועדים לניתוח RT-qPCR (1 מ"ל לבאר), ולוחות 96 הבאר מיועדים לבדיקה פאגוציטית (250 מיקרול לבאר); כל השלושה שימשו לעבודה זו. עם זאת, בכתב יד זה, התוצאות מניתוח הכתם המערבי אינן מוצגות, אך ניתן לבצע עם פרוטוקול זה.
  15. מניחים את הצלחות בטמפרטורה של 37°C עם 5% CO2 למשך הלילה. החלף את המדיום בזהירות עם פיפטה של 1,000 μL עם מדיום מיקרוגליה מחומם מראש.
  16. מניחים את הצלחות על 37°C עם 5% CO2 לילה לפני הגירוי.
    הערה: בידוד מיקרוגליה מיותר מ-36 גורים ולאחר P9 אינו מומלץ. זה יגביר את הסיכון של זיהום והצטברות של פסולת תאים כדי להפעיל microglia.

4. גירויים תאיים

  1. הכינו ריאגנטים לגירוי לפי טבלה 3 באמצעות הריאגנטים הזמינים מסחרית (ראו טבלת חומרים).
  2. הוסף את הנפח המתאים בכל מגורה היטב.
    הערה: הנפח המתאים תלוי בריכוז הגירוי ובגודל הבאר.
  3. מניחים את הצלחות על 37°C עם 5% CO2עד סוף הגירוי ב-6 שעות, 24 שעות או 48 שעות.
  4. לניתוח הכתם המערבי, שאפו את הסופר-נאטנט והוסיפו 50 מיקרון ליטר של חיץ תזה חלבונית (ראו טבלת חומרים) עם פיפטה. באמצעות טיפים, לגרד את החלק התחתון של הצלחת כדי לנתק את התאים lysed ולהעביר אותם 1.5 מ"ל צינורות. יש לאחסן בטמפרטורה של -80°C.
    הערה: ניתן לאחסן את לוחות התרבית במשך שנים בטמפרטורה של -80 מעלות צלזיוס אם הסופר-נטנט שואף כראוי.
  5. עבור ניתוח RT-qPCR 6,31, שאפו את הסופר-נטנט ואחסנו את לוחות התרבית ישירות בטמפרטורה של -80 מעלות צלזיוס עד למיצוי mRNA (שלב 5).
  6. עבור הבדיקה הפאגוציטית, ראה שלב 6.

5. מיצוי mRNA וניתוח RT-qPCR

  1. בצע מיצוי RNA, RT-PCR ו- RT-qPCR בהתאם לפרוטוקול היצרן (ראה טבלת חומרים). עיין בטבלה 4 עבור רצפי הפריימרים 5,6,31.
  2. בצע ניתוח RT-qPCR על-ידי ביצוע הדוחשפורסם בעבר 5.

6. בדיקה פאגוציטית

  1. לעורר את התאים ולבצע בדיקה phagocytic במהלך 3 השעות האחרונות של הגירוי. לדוגמה, עבור גירוי של 6 שעות, להתחיל את הבדיקה phagocytic לאחר 3 שעות של גירוי; ולגירוי של 12 שעות, התחל את הבדיקה הפאגוציטית 9 שעות לאחר תחילת הגירוי.
  2. חשב את מספר החרוזים הדרושים להכנה בהתחשב ביחס (1 תא: 50 חרוזים). עבור באר אחת של צלחת 96 באר, 8.1 x 106 חרוזים נדרשים. מכינים את תערובת החרוזים לפי טבלה 5.
    הערה: מערבבים בזהירות את בקבוקון מלאי החרוזים לפני הוספתם לתערובת PBS/FBS.
  3. דגירה במשך שעה אחת באמבט מים ב 37 מעלות צלזיוס. מערבולת כל 10 דקות.
  4. חשב את נפח הפתרון כדי להוסיף לכל באר. מוסיפים את הפתרון ומדגרים במשך 3 שעות.
  5. שטפו את הבארות שלוש פעמים עם PBS אחד. קרא את פליטת הפליטה הפלואורסצנטית ב-550 ננומטר (אורך גל פליטת Cy3).

7. בקרת איכות טוהר

  1. הערך את טוהר הבידוד המגנטי של CD11b על-ידי ציטומטריה של זרימה (FACS) (לפני ואחרי מיון תאים), ולאחר מכן בצע את RT-qPCR.
    1. לספור את התאים ולחזור במאגר FACS (PBS + 2 mM של EDTA + 0.5% של אלבומין בסרום בקר) על מנת לקבל דילול של 10 x 106 תאים / מ"ל לאחר שלב 3.5 ושלב 3.14.
    2. לאחר 15 דקות של חסימת Fc קונבנציונלית 32,33, דגירה של התאים למשך 15 דקות עם בדיקת כדאיות (FVS780) ונוגדנים מצומדים לפלואורופור נגד עכבר CD45, CD11b, CX3CR1, ACSA-2, O4 או איזוטיפים בקרה מתאימים שלהם32,33 בריכוז המומלץ על ידי היצרנים (ראה טבלת חומרים).
    3. שטפו את התאים באמצעות מאגר FACS, תיקון וחדירה באמצעות ערכת חלחול זמינה מסחרית (ראו טבלת חומרים).
    4. בצע שוב חסימת Fc על התאים המחלחלים, ולאחר מכן דגירה עם נוגדן מצומד פלואורופור נגד NeuN (ראה טבלת חומרים) או איזוטיפ הבקרה שלו במשך 15 דקות.
    5. בצע ניתוח FACS לאחר כביסה עם מאגר FACS.
    6. לאחר אי הכללת הכפילים והתאים המתים בהתבסס על פרמטרים מורפולוגיים וכתם FVS780, בהתאמה, בחר את אסטרטגיית ההטיה לביטוי פני השטח של CX3CR1 (מיקרוגליה), ACSA-2 (אסטרוציטים), O4 (אוליגודנדרוציטים), ונוכחות תוך תאית של NeuN (נוירונים) לניתוח אחוז התאים החיוביים.
  2. לאחר שלב 5, חלץ mRNA ובצע RT-qPCR כדי לכמת את Itgam (CD11b), Cx3cr1, Olig2, Synaptophysin ו- Gfap mRNA. נרמל את Cq באמצעות Rpl13a mRNA כמדווח, ובצע ביטוי יחסי ל- Itgam mRNA.

תוצאות

מיקרוגליה היא מקרופאג' תושב CNS שמופעל כאשר הוא נחשף לאתגרים סביבתיים (טראומה, מולקולות רעילות, דלקת)4,5,6,34 (איור 3A). מחקרים במבחנה על מיקרוגליה משמשים בדרך כלל להערכת מנגנונים אוטונומיים תאיים הקשורי?...

Discussion

העבודה הנוכחית מציגה תרבית תאים מיקרוגליאלית ראשונית באמצעות תאי CD11b+ ממוינים מגנטית. בנוסף להערכה התפקודית המיקרוגליאלית (RT-qPCR ומבחני פאגוציטים), נקבע גם טוהר התרבית המיקרוגליאלית.

תרביות תאי מיקרוגליה קלאסיות נוצרות בדרך כלל ממוח ילודים של מכרסם P1 או P2 ומתרבית משותפת עם ?...

Disclosures

המחברים מצהירים על היעדר ניגוד עניינים.

Acknowledgements

הדמויות נוצרו באמצעות BioRender. המחקר ממומן על ידי Inserm, אוניברסיטת פריז, Horizon 2020 (PREMSTEM-874721), Fondation de France, Fondation ARSEP, Fondation pour la Recherche sur le Cerveau, Fondation Grace de Monaco, ומענק נוסף מ- Investissement d'Avenir -ANR-11-INBS-0011-NeurATRIS and Investissement d'Avenir -ANR-17-EURE-001-EUR G.E.N.E.

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
Anti mouse ACSA-2 PE Vio 615Miltenyi Biotec130-116-246
Anti mouse CD11b BV421Sony Biotechnology1106255
Anti mouse CD45 BV510Sony Biotechnology1115690
Anti mouse CX3CR1 PE Cy7Sony Biotechnology1345075
Anti mouse NeuN PEMilli-MarkFCMAB317PE
anti mouse O4 Vio Bright B515Miltenyi Biotec130-120-016
BD Cytofix/Cytoperm permeabilization kitBD Biosciences554655
Bovine Serum AlbuminMiltenyi Biotec130-091-376
CD11b (Microglia) MicroBeads, h, mMiltenyi Biotec130-093-634
Confocal microscopeLeica TCS SP8
D-PBS (10x)Thermo Scientific14200067
EDTASigma-AldrichE1644
Falcon Cell culture 12-well plate, flat bottom + lidDutscher353043
Falcon Cell culture 96-well plate, flat bottom + lidDutscher353072
Falcon tubes 50 mLDutscher352098
Fc blocking reagent (Mouse CD16/32)BD Biosciences553142
Fluorescence microscopeNikon ECLIPSE TE300
gentleMACS C Tubes (4 x 25 tubes)Miltenyi Biotec130-096-334
gentleMACS Octo Dissociator with HeatersMiltenyi Biotec130-096-427
Hanks' Balanced Salt Solution (HBSS) +CaCl2 +MgCl2 10xThermo Scientific14065049
Hanks' Balanced Salt Solution (HBSS) -CaCl2 -MgCl2 10xThermo Scientific14185045
iQ SYBR Green SupermixBio-rad1725006CUST
Iscript c-DNA synthesisBio-rad1708890
Latex beads, amine-modified polystyrene, fluorescent redSigma-AldrichL2776-1mL
Lipopolysaccharides (LPS) from Escherichia coli O55:B5Sigma-AldrichL2880
Macrophage-SFM serum-free mediumThermo Scientific12065074
MACS BSA Stock SolutionMiltenyi Biotec130-091-376
MACS SmartStrainers (70 μm), 4 x 25 pcsMiltenyi Biotec130-110-916
Mouse IgG1 PEMilliporeMABC002H
Mouse IgG2a PE Cy7Sony Biotechnology2601265
Mouse IL1 betaMiltenyi Biotec130-101-684
Multi-24 Column BlocksMiltenyi Biotec130-095-691
MultiMACS Cell24 SeparatorMiltenyi Biotec
Neural Tissue Dissociation Kit - PapainMiltenyi Biotec130-092-628
Nucleocounter NC-200Chemometec
Nucleospin RNA Plus XSMacherey Nagel740990.5
Nun EZFlip Top Conical Centrifuge TubesThermo Scientific362694
OPTILUX Petri dish - 100 x 20 mmDutscher353003
Pénicilline-streptomycine (10 000 U/mL)Thermo Scientific15140122
Rat IgG2b, k BV421BD Biosciences562603
Rat IgG2b, k BV510Sony Biotechnology2603230
REA control (S) PE vio 615Miltenyi Biotec130-104-616
REA control (S) Vio Bright B515Miltenyi Biotec130-113-445
Recombinant Mouse IFN-gamma ProteinR&D System485-MI
Recombinant Mouse IL-10 ProteinR&D System417-ML
Recombinant Mouse IL-4 ProteinR&D System404-ML
RIPA BufferSigma-AldrichR0278
Viability probe (FVS780)BD Biosciences565388

References

  1. Kierdorf, K., et al. Microglia emerge from erythromyeloid precursors via Pu.1- and Irf8-dependent pathways. Nature Neuroscience. 16 (3), 273-280 (2013).
  2. Wright-Jin, E. C., Gutmann, D. H. Microglia as dynamic cellular mediators of brain function. Trends in Molecular Medicine. 25 (11), 967-979 (2019).
  3. Hellstrom Erkenstam, N., et al. Temporal characterization of microglia/macrophage phenotypes in a mouse model of neonatal hypoxic-ischemic brain injury. Frontiers in Cellular Neuroscience. 10, 286 (2016).
  4. Chhor, V., et al. Role of microglia in a mouse model of paediatric traumatic brain injury. Brain, Behavior, and Immunity. 63, 197-209 (2017).
  5. Van Steenwinckel, J., et al. Decreased microglial Wnt/beta-catenin signalling drives microglial pro-inflammatory activation in the developing brain. Brain. 142 (12), 3806-3833 (2019).
  6. Chhor, V., et al. Characterization of phenotype markers and neuronotoxic potential of polarised primary microglia in vitro. Brain, Behavior, and Immunity. 32, 70-85 (2013).
  7. Di Pietro, P., et al. Bisphenol A induces DNA damage in cells exerting immune surveillance functions at peripheral and central level. Chemosphere. 254, 126819 (2020).
  8. Roque, P. J., Dao, K., Costa, L. G. Microglia mediate diesel exhaust particle-induced cerebellar neuronal toxicity through neuroinflammatory mechanisms. Neurotoxicology. 56, 204-214 (2016).
  9. Yun, H. S., Oh, J., Lim, J. S., Kim, H. J., Kim, J. S. Anti-inflammatory effect of wasp venom in BV-2 microglial cells in comparison with bee venom. Insects. 12 (4), 297 (2021).
  10. Nair, S., et al. Lipopolysaccharide-induced alteration of mitochondrial morphology induces a metabolic shift in microglia modulating the inflammatory response in vitro and in vivo. Glia. 67 (6), 1047-1061 (2019).
  11. Fleiss, B., et al. The anti-inflammatory effects of the small molecule pifithrin-micro on BV2 microglia. Developmental Neuroscience. 37 (4-5), 363-375 (2015).
  12. Dean, J. M., et al. Microglial MyD88 signaling regulates acute neuronal toxicity of LPS-stimulated microglia in vitro. Brain, Behavior, and Immunity. 24 (5), 776-783 (2010).
  13. Tang, Y., Wolk, B., Nolan, R., Scott, C. E., Kendall, D. A. Characterization of subtype selective cannabinoid CB2 receptor agonists as potential anti-inflammatory agents. Pharmaceuticals (Basel). 14 (4), 378 (2021).
  14. Liu, C. P., et al. miR146a reduces depressive behavior by inhibiting microglial activation. Molecular Medicine Reports. 23 (6), 463 (2021).
  15. Aquino, G. V., Dabi, A., Odom, G. J., Zhang, F., Bruce, E. D. Evaluating the endothelial-microglial interaction and comprehensive inflammatory marker profiles under acute exposure to ultrafine diesel exhaust particles in vitro. Toxicology. 454, 152748 (2021).
  16. You, J. E., Jung, S. H., Kim, P. H. The effect of Annexin A1 as a potential new therapeutic target on neuronal damage by activated microglia. Molecules and Cells. 44 (4), 195-206 (2021).
  17. Xie, Z., et al. By regulating the NLRP3 inflammasome can reduce the release of inflammatory factors in the co-culture model of tuberculosis H37Ra strain and rat microglia. Frontiers in Cellular and Infection Microbiology. 11, 637769 (2021).
  18. Ogunrinade, F. A., et al. Zanthoxylum zanthoxyloides inhibits lipopolysaccharide- and synthetic hemozoin-induced neuroinflammation in BV-2 microglia: roles of NF-kappaB transcription factor and NLRP3 inflammasome activation. Journal of Pharmacy and Pharmacology. 73 (1), 118-134 (2021).
  19. Fernandez-Arjona, M. D. M., Leon-Rodriguez, A., Lopez-Avalos, M. D., Grondona, J. M. Microglia activated by microbial neuraminidase contributes to ependymal cell death. Fluids Barriers CNS. 18 (1), 15 (2021).
  20. Du, S., et al. Primary microglia isolation from postnatal mouse brains. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (168), e62237 (2021).
  21. Boccazzi, M., et al. The immune-inflammatory response of oligodendrocytes in a murine model of preterm white matter injury: the role of TLR3 activation. Cell Death & Disease. 12 (2), 166 (2021).
  22. Timmerman, R., Burm, S. M., Bajramovic, J. J. An overview of in vitro methods to study microglia. Frontiers in Cellular Neuroscience. 12, 242 (2018).
  23. Nikodemova, M., Watters, J. J. Efficient isolation of live microglia with preserved phenotypes from adult mouse brain. Journal of Neuroinflammation. 9, 147 (2012).
  24. Bennett, M. L., et al. New tools for studying microglia in the mouse and human CNS. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (12), 1738-1746 (2016).
  25. Bohlen, C. J., Bennett, F. C., Bennett, M. L. Isolation and culture of microglia. Current Protocols in Immunology. 125 (1), 70 (2019).
  26. Schroeter, C. B., et al. One brain-all cells: A comprehensive protocol to isolate all principal CNS-resident cell types from brain and spinal cord of adult healthy and EAE mice. Cells. 10 (3), 651 (2021).
  27. Harms, A. S., Tansey, M. G. Isolation of murine postnatal brain microglia for phenotypic characterization using magnetic cell separation technology. Methods in Molecular Biology. 1041, 33-39 (2013).
  28. Pan, J., Wan, J. Methodological comparison of FACS and MACS isolation of enriched microglia and astrocytes from mouse brain. Journal of Immunological Methods. 486, 112834 (2020).
  29. Montilla, A., Zabala, A., Matute, C., Domercq, M. Functional and metabolic characterization of microglia culture in a defined medium. Frontiers in Cellular Neuroscience. 14, 22 (2020).
  30. Krishnan, M. L., et al. Integrative genomics of microglia implicates DLG4 (PSD95) in the white matter development of preterm infants. Nature Communications. 8 (1), 428 (2017).
  31. Bokobza, C., et al. miR-146b protects the perinatal brain against microglia-induced hypomyelination. Annals of Neurology. 91 (1), 48-65 (2021).
  32. Villapol, S., et al. Early sex differences in the immune-inflammatory responses to neonatal ischemic stroke. International Journal of Molecular Sciences. 20 (15), 3809 (2019).
  33. Rosiewicz, K. S., et al. Comparison of RNA isolation procedures for analysis of adult murine brain and spinal cord astrocytes. Journal of Neuroscience Methods. 333, 108545 (2020).
  34. Fleiss, B., et al. Microglia-mediated neurodegeneration in perinatal brain injuries. Biomolecules. 11 (1), 99 (2021).
  35. Pawelec, P., Ziemka-Nalecz, M., Sypecka, J., Zalewska, T. The Impact of the CX3CL1/CX3CR1 axis in neurological disorders. Cells. 9 (10), 2277 (2020).
  36. Reynolds, R., Cenci di Bello, I., Dawson, M., Levine, J. The response of adult oligodendrocyte progenitors to demyelination in EAE. Progress in Brain Research. 132, 165-174 (2001).
  37. Duan, W., et al. Novel insights into NeuN: From neuronal marker to splicing regulator. Molecular Neurobiology. 53 (3), 1637-1647 (2016).
  38. Kantzer, C. G., et al. Anti-ACSA-2 defines a novel monoclonal antibody for prospective isolation of living neonatal and adult astrocytes. Glia. 65 (6), 990-1004 (2017).
  39. Lee, S., Lee, D. K. What is the proper way to apply the multiple comparison test. Korean Journal of Anesthesiology. 71 (5), 353-360 (2018).
  40. Chao, C. C., Hu, S., Molitor, T. W., Shaskan, E. G., Peterson, P. K. Activated microglia mediate neuronal cell injury via a nitric oxide mechanism. Journal of Immunology. 149 (8), 2736-2741 (1992).
  41. Boje, K. M., Arora, P. K. Microglial-produced nitric oxide and reactive nitrogen oxides mediate neuronal cell death. Brain Research. 587 (2), 250-256 (1992).
  42. Biber, K., Owens, T., Boddeke, E. What is microglia neurotoxicity (Not). Glia. 62 (6), 841-854 (2014).
  43. Biber, K., Neumann, H., Inoue, K., Boddeke, H. W. Neuronal 'On' and 'Off' signals control microglia. Trends in Neurosciences. 30 (11), 596-602 (2007).
  44. Ransohoff, R. M., Cardona, A. E. The myeloid cells of the central nervous system parenchyma. Nature. 468 (7321), 253-262 (2010).
  45. Boucsein, C., Kettenmann, H., Nolte, C. Electrophysiological properties of microglial cells in normal and pathologic rat brain slices. European Journal of Neuroscience. 12 (6), 2049-2058 (2000).
  46. Beutner, C., et al. Unique transcriptome signature of mouse microglia. Glia. 61 (9), 1429-1442 (2013).
  47. Schmid, C. D., et al. Differential gene expression in LPS/IFNgamma activated microglia and macrophages: in vitro versus in vivo. Journal of Neurochemistry. 109, 117-125 (2009).
  48. Srivastava, P. K., et al. A systems-level framework for drug discovery identifies Csf1R as an anti-epileptic drug target. Nature Communications. 9 (1), 3561 (2018).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

185

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved