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Resumen

Los cultivos primarios de microglía se utilizan comúnmente para evaluar nuevas moléculas antiinflamatorias. El presente protocolo describe un método reproducible y relevante para aislar magnéticamente la microglía de cachorros neonatos.

Resumen

La microglía, como macrófagos residentes en el cerebro, es fundamental para varias funciones, incluida la respuesta al estrés ambiental y la homeostasis cerebral. La microglía puede adoptar un amplio espectro de fenotipos de activación. Además, la microglía que respalda el fenotipo proinflamatorio se asocia con trastornos del desarrollo neurológico y neurodegenerativos. Los estudios in vitro son ampliamente utilizados en la investigación para evaluar posibles estrategias terapéuticas en tipos específicos de células. En este contexto, el estudio de la activación microglial y la neuroinflamación in vitro utilizando cultivos microgliales primarios es más relevante que las líneas celulares microgliales o la microglía derivada de células madre. Sin embargo, el uso de algunos cultivos primarios puede adolecer de una falta de reproducibilidad. Este protocolo propone un método reproducible y relevante para aislar magnéticamente la microglía de cachorros neonatos. Aquí se demuestra la activación microglial utilizando varios estímulos después de 4 h y 24 h mediante la cuantificación de la expresión de ARNm y un ensayo fagocítico de perlas Cy3. Se espera que el trabajo actual proporcione una técnica fácilmente reproducible para aislar microglía fisiológicamente relevante de las etapas de desarrollo juvenil.

Introducción

Las microglías son las células similares a los macrófagos residentes en el sistema nervioso central derivadas de precursores eritropoyéticos del saco vitelino que migran al neuroepitelio durante el desarrollo embrionario temprano1. Además de sus funciones de inmunidad, también juegan un papel importante durante el neurodesarrollo, particularmente para la sinaptogénesis, la homeostasis neuronal y la mielinización2. En la edad adulta, la microglía desarrolla largos procesos celulares para escanear el medio ambiente continuamente. En caso de rupturas de homeostasis como lesión cerebral o enfermedad cerebral, la microglía puede cambiar su apariencia morfológica para adoptar una forma ameboide, migrar a la zona lesionada, aumentar y liberar muchos factores citoprotectores o citotóxicos. Las microglías tienen estados de activación heterogéneos dependiendo de su etapa de desarrollo y del tipo de lesión sufrida 3,4,5. En este estudio, estos estados de activación se clasifican ampliamente en tres fenotipos diferentes: proinflamatorio/fagocítico, antiinflamatorio e inmunorregulador, teniendo en cuenta que, en realidad, la situación es probable que sea más compleja6.

El estudio de la activación microglial in vivo y la detección de estrategias neuroprotectoras en las primeras etapas del desarrollo cerebral puede ser un desafío debido a (1) la fragilidad de los animales antes del destete y (2) el bajo número de células microgliales. Por lo tanto, los estudios in vitro sobre la microglía son ampliamente utilizados para la toxicidad 7,8,9, las estrategias neuroprotectoras5,10,11,12,13,14 y los cocultivos 15,16,17,18,19,20,21 . Los estudios in vitro pueden utilizar líneas celulares microgliales, microglía derivada de células madre o cultivo primario de microglia. Todos estos enfoques tienen ventajas y desventajas, y la elección depende de la pregunta biológica inicial. Los beneficios del uso de cultivos primarios de microglia son los antecedentes genéticos homogéneos, la historia libre de patógenos y el control del momento en que la microglía es estimulada después de la muerte animal22.

A lo largo de los años, se desarrollaron diferentes métodos (citometría de flujo, agitación o marcado magnético) para cultivar microglia primaria de roedores, tanto neonatos como adultos 23,24,25,26,27,28,29. En el presente trabajo, el aislamiento de microglia de crías neonatales de ratón se realiza utilizando la tecnología de clasificación celular activada magnéticamente previamente descrita utilizando CD11b de ratón anti-ratón recubierto de microperlas25,27,29. CD11b es un receptor de integrina expresado en la superficie de las células mieloides, incluida la microglía. Cuando no hay un desafío inflamatorio dentro del cerebro, casi todas las células CD11b + son microglia30. En comparación con otros métodos publicados anteriormente 23,24,25,26,27,28,29, el presente protocolo equilibra los análisis de activación microglial ex vivo inmediato y el cultivo microglial primario in vitro común. Por lo tanto, las microglías son (1) aisladas en el día postnatal (P)8 sin eliminación de mielina, (2) cultivadas sin suero, y (3) expuestas a siRNA, miRNA, compuesto farmacológico y/o estímulos inflamatorios solo 48 h después del aislamiento cerebral. Cada uno de estos tres aspectos hace que el protocolo actual sea relevante y rápido. En primer lugar, el uso de la microglía pediátrica permite obtener células viables dinámicas y reactivas en cultivo sin requerir un paso adicional de desmielinización que podría modificar potencialmente la reactividad microglial in vitro. El presente protocolo tiene como objetivo acercarse lo más posible al entorno fisiológico de la microglía. De hecho, la microglía nunca encuentra suero, y este protocolo tampoco requiere el uso de suero. Además, la exposición de la microglía tan pronto como 48 h después del cultivo evita que pierdan sus facultades fisiológicas.

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Protocolo

El protocolo fue aprobado, y todos los animales fueron manejados de acuerdo con las directrices institucionales del Institut National de la Santé et de la Recherche Scientifique (Inserm, Francia). Se presenta el aislamiento magnético de la microglía del cerebro de 24 crías de ratón OF1 (tanto machos como hembras) en P8, divididas en placas de 6 pocillos, 12 pocillos o 96 pocillos. El trabajo experimental se realizó bajo una campana para mantener condiciones estériles.

1. Preparación de soluciones estériles para aislamiento y cultivo celular

  1. Prepare 50 ml de 1x solución salina balanceada de Hanks (HBSS) sin Ca 2+ y Mg2+ (HBSS-/-) de la solución 10x disponible comercialmente (consulte la Tabla de materiales).
  2. Prepare la mezcla de disociación de acuerdo con la composición proporcionada en la Tabla 1 utilizando un kit de disociación de tejidos disponible comercialmente (consulte la Tabla de materiales).
  3. Prepare 200 ml de 1x HBSS con Ca 2+ y Mg2+ (HBSS+/+) a partir de la solución 10x disponible comercialmente.
  4. Prepare 200 ml de 1x PBS + 0.5% BSA (denominado tampón de clasificación celular).
  5. Preparar microperlas CD11b de acuerdo con la Tabla 2.
  6. Preparar 500 ml de medio de cultivo libre de suero de macrófagos (SFM) + 1% de penicilina-estreptomicina (P/S). Hacer alícuotas de 50 ml de tubos y almacenarlos a 4 °C. Esto se conoce como el medio microglia más adelante en el texto.
    NOTA: Todas las soluciones de aislamiento deben prepararse recientemente en condiciones estériles el día de la experimentación y mantenerse en hielo. El medio de cultivo de células microgliales puede prepararse, alicotizarse en tubos de 50 ml y mantenerse a 4 °C para su uso futuro. La filtración no es necesaria.

2. Disección cerebral

  1. Decapitar la cabeza del cachorro con unas tijeras grandes sin anestesia general previa.
  2. Cortar la piel desde el cuello hasta la nariz siguiendo la sutura sagital (15-20 mm) con tijeras pequeñas (Figura 1A-C).
  3. Inserte las puntas de una tijera pequeña dentro del foramen magnum paralelo al cráneo. Corte desde cada lado cuidadosamente hasta los ojos (Figura 1D, E).
  4. Corte entre los ojos con tijeras pequeñas para separar el cráneo y el cerebro de la cabeza (Figura 1F).
  5. Con dos fórceps, agarre el cráneo cerca de los bulbos olfatorios y rasgue el cráneo con cuidado, teniendo cuidado de no dañar el cerebro subyacente (Figura 1G-I).
  6. Retire el cerebelo y el bulbo olfativo con una cuchilla de afeitar y corte el cerebro en dos pedazos (Figura 1J).
  7. Coloque las piezas cerebrales en una placa de Petri que contenga 30-40 ml de HBSS-/- (Figura 1K).

3. Disociación cerebral y aislamiento microglial magnético

NOTA: Todas las manipulaciones y resuspensiones celulares deben realizarse con una pipeta de 1.000 μL con gran precaución. La aplicación de una alta acción mecánica puede activar o matar las células microgliales.

  1. Transfiera 12 piezas cerebrales (~ 1.2 g) por tubo de disociación que contenga una mezcla de disociación de acuerdo con la Tabla 1. Para 24 cachorros, se necesitaron cuatro tubos en C (Figura 2A-B).
  2. Coloque los tubos C en el disociador (con el modo de calentamiento). Inicie el programa NTDK optimizado en el equipo de acuerdo con las instrucciones del fabricante (Figura 2D).
  3. Centrifugar a 300 x g durante 20 s (a 4 °C) para recoger todas las células. Completar la disociación mecánica pipeteando tres veces hacia arriba y hacia abajo con una pipeta de 1.000 μL (Figura 2E).
  4. Transfiera las células a cuatro tubos de 15 ml + filtros. Enjuague los filtros con 10 ml de HBSS+/+ (Figura 2F).
  5. Centrifugar a 300 x g durante 10 min (a 4 °C) y retirar el sobrenadante. Resuspender cuidadosamente el pellet con 10 mL de HBSS+/+ (Figura 2G).
  6. Centrifugar a 300 x g durante 10 min (a 4 °C) y retirar el sobrenadante. Resuspender cuidadosamente el pellet con 6 ml de tampón de clasificación (paso 1.4) (Figura 2H).
  7. Centrifugar a 300 x g durante 10 min (a 4 °C) y retirar el sobrenadante. Añadir 200 μL de solución de microperlas CD11b (paso 1.5) por tubo y resuspender cuidadosamente (Figura 2I).
  8. Incubar los tubos durante 15-20 min a 4 °C. Resuspenda cuidadosamente el pellet con 6 ml de tampón de clasificación (Figura 2I-J).
  9. Centrifugar a 300 x g durante 10 min (a 4 °C) y retirar el sobrenadante. Resuspenda cuidadosamente el pellet con 8 ml de tampón de clasificación (Figura 2K).
  10. Siga el programa POSSEL en el separador (consulte la Tabla de materiales) para preparar ocho columnas. Transfiera las células 1 mL por 1 mL en la columna. Espere a que pasen todas las células antes de agregar otro ml. Células CD11b+ de elución en placa de elución estéril con 1 ml de tampón de clasificación (Figura 2L).
  11. Agrupar células CD11b+ en un nuevo tubo de 50 ml (Figura 2M).
  12. Centrifugar a 300 x g durante 10 min (a 4 °C) y retirar el sobrenadante. Resuspender cuidadosamente el pellet con 10 ml de medio microglial frío (paso 1.6) (Figura 2N).
  13. Cuente las células CD11b+. En P8, uno debe obtener ~ 650,000 células por cerebro.
    NOTA: En el protocolo actual, las celdas se contaron utilizando un contador de celdas automatizado (ver Tabla de materiales).
  14. Resuspender las células en medio de microglía fría hasta una concentración final de 650.000-700.000 células/ml y dispensar en placas de cultivo celular.
    NOTA: Las placas de 6 pocillos son para Western Blot (2 mL por pocillo); las placas de 12 pocillos son para análisis RT-qPCR (1 ml por pocillo) y las placas de 96 pocillos son para ensayo fagocítico (250 μL por pocillo); Los tres fueron utilizados para este trabajo. Sin embargo, en este manuscrito, los resultados del análisis de Western Blot no se muestran, pero es posible realizar con este protocolo.
  15. Colocar las placas a 37 °C con un 5% deCO2 durante la noche. Cambie el medio cuidadosamente con una pipeta de 1.000 μL con medio microglial precalentado.
  16. Colocar las placas a 37 °C con 5% deCO2 durante la noche antes de la estimulación.
    NOTA: No se recomienda aislar la microglía de más de 36 cachorros y después de P9. Esto aumentará el riesgo de contaminación y acumulación de restos celulares para activar la microglía.

4. Estimulaciones celulares

  1. Prepare los reactivos de estimulación de acuerdo con la Tabla 3 utilizando los reactivos disponibles comercialmente (ver Tabla de materiales).
  2. Añadir el volumen adecuado en cada bien estimulado.
    NOTA: El volumen apropiado depende de la concentración del estímulo y del tamaño del pozo.
  3. Colocar las placas a 37 °C con un 5% deCO2hasta el final de la estimulación a las 6 h, 24 h o 48 h.
  4. Para el análisis Western Blot, aspirar el sobrenadante y añadir 50 μL de tampón de lisis proteica (ver Tabla de materiales) con una pipeta. Usando puntas, rasque la parte inferior de la placa para separar las células lisadas y transfiéralas a tubos de 1,5 ml. Conservar a -80 °C.
    NOTA: Las placas de cultivo pueden conservarse durante años a -80 °C si el sobrenadante se aspira correctamente.
  5. Para el análisis RT-qPCR 6,31, aspirar el sobrenadante y almacenar las placas de cultivo directamente a -80 °C hasta la extracción del ARNm (paso 5).
  6. Para el ensayo fagocítico, consulte el paso 6.

5. Extracción de ARNm y análisis de RT-qPCR

  1. Realice la extracción de ARN, RT-PCR y RT-qPCR siguiendo el protocolo del fabricante (consulte la Tabla de materiales). Consulte la Tabla 4 para las secuencias de cebadores5,6,31.
  2. Realizar el análisis de RT-qPCR siguiendo el informe publicado anteriormente5.

6. Ensayo fagocítico

  1. Estimular las células y realizar ensayos fagocíticos durante las últimas 3 h de la estimulación. Por ejemplo, para la estimulación de 6 h, comience el ensayo fagocítico después de 3 h de estimulación; y para la estimulación de 12 h, iniciar el ensayo fagocítico 9 h después del inicio de la estimulación.
  2. Calcule el número de cuentas necesarias para preparar considerando la proporción (1 celda: 50 cuentas). Para un pocillo de la placa de 96 pocillos, se requieren 8.1 x 106 cuentas. Prepare la mezcla de perlas de acuerdo con la Tabla 5.
    NOTA: Cuidadosamente haga un vórtice del vial de tallas antes de agregarlo a la mezcla PBS / FBS.
  3. Incubar durante 1 h en un baño maría a 37 °C. Vórtice cada 10 min.
  4. Calcule el volumen de solución para agregar a cada pozo. Añadir la solución e incubar durante 3 h.
  5. Enjuague los pocillos tres veces con 1x PBS. Lea la emisión de fluorescencia a 550 nm (longitud de onda de emisión Cy3).

7. Control de calidad de pureza

  1. Evaluar la pureza del aislamiento magnético CD11b por citometría de flujo (FACS) (antes y después de la clasificación celular), y luego realizar la RT-qPCR.
    1. Contar las células y resuspender en tampón FACS (PBS + 2 mM de EDTA + 0,5% de albúmina sérica bovina) para obtener una dilución de 10 x 106 células/ml después de los pasos 3.5 y 3.14.
    2. Después de 15 min del Fc convencional bloqueando 32,33, incubar las células durante 15 min con sonda de viabilidad (FVS780) y anticuerpos conjugados con fluoróforos contra CD45, CD11b, CX3CR1, ACSA-2, O4 de ratón o sus correspondientes isotipos de control32,33 a la concentración recomendada por los fabricantes (ver Tabla de Materiales).
    3. Lave las celdas con tampón FACS, fije y permeabilice con un kit de permeabilización disponible comercialmente (consulte la Tabla de materiales).
    4. Realizar el bloqueo Fc de nuevo en las células permeabilizadas, y luego incubar con anticuerpos conjugados con fluoróforos contra NeuN (ver Tabla de materiales) o su isotipo de control durante 15 min.
    5. Realice el análisis FACS después del lavado con tampón FACS.
    6. Después de excluir los dobletes y las células muertas en función de los parámetros morfológicos y la tinción FVS780, respectivamente, seleccione la estrategia de compuerta para la expresión superficial de CX3CR1 (microglía), ACSA-2 (astrocitos), O4 (oligodendrocitos) y presencia intracelular de NeuN (neuronas) para el análisis del porcentaje de células positivas.
  2. Después del paso 5, extraiga el ARNm y realice RT-qPCR para cuantificar Itgam (CD11b), Cx3cr1, Olig2, Sinaptofisina y ARNm de Gfap . Normalizar Cq usando ARNm Rpl13a como reportero, y realizar una expresión relativa al ARNm de Itgam .

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Resultados

La microglía es el macrófago residente en el SNC que se activa cuando se expone a desafíos ambientales (trauma, moléculas tóxicas, inflamación)4,5,6,34 (Figura 3A). Los estudios in vitro sobre la microglía se utilizan comúnmente para evaluar los mecanismos autónomos celulares relacionados con esos desafíos ambientales y caracterizar el estado de ...

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Discusión

El trabajo actual presenta un cultivo primario de células microgliales utilizando células CD11b + clasificadas magnéticamente. Además de la evaluación funcional microglial (RT-qPCR y ensayos fagocíticos), también se determinó la pureza del cultivo microglial.

Los cultivos clásicos de células microgliales se generan comúnmente a partir del cerebro neonatal de roedores P1 o P2 y el cocultivo con astrocitos durante al menos 10 días. Las microglías se separan mecánicamente usando un ...

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Divulgaciones

Los autores declaran no tener conflictos de intereses.

Agradecimientos

Las figuras fueron creadas usando BioRender. La investigación está financiada por Inserm, Université de Paris, Horizon 2020 (PREMSTEM-874721), Fondation de France, Fondation ARSEP, Fondation pour la Recherche sur le Cerveau, Fondation Grace de Monaco, y una subvención adicional de Investissement d'Avenir -ANR-11-INBS-0011-NeurATRIS e Investissement d'Avenir -ANR-17-EURE-001-EUR G.E.N.E.

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Materiales

NameCompanyCatalog NumberComments
Anti mouse ACSA-2 PE Vio 615Miltenyi Biotec130-116-246
Anti mouse CD11b BV421Sony Biotechnology1106255
Anti mouse CD45 BV510Sony Biotechnology1115690
Anti mouse CX3CR1 PE Cy7Sony Biotechnology1345075
Anti mouse NeuN PEMilli-MarkFCMAB317PE
anti mouse O4 Vio Bright B515Miltenyi Biotec130-120-016
BD Cytofix/Cytoperm permeabilization kitBD Biosciences554655
Bovine Serum AlbuminMiltenyi Biotec130-091-376
CD11b (Microglia) MicroBeads, h, mMiltenyi Biotec130-093-634
Confocal microscopeLeica TCS SP8
D-PBS (10x)Thermo Scientific14200067
EDTASigma-AldrichE1644
Falcon Cell culture 12-well plate, flat bottom + lidDutscher353043
Falcon Cell culture 96-well plate, flat bottom + lidDutscher353072
Falcon tubes 50 mLDutscher352098
Fc blocking reagent (Mouse CD16/32)BD Biosciences553142
Fluorescence microscopeNikon ECLIPSE TE300
gentleMACS C Tubes (4 x 25 tubes)Miltenyi Biotec130-096-334
gentleMACS Octo Dissociator with HeatersMiltenyi Biotec130-096-427
Hanks' Balanced Salt Solution (HBSS) +CaCl2 +MgCl2 10xThermo Scientific14065049
Hanks' Balanced Salt Solution (HBSS) -CaCl2 -MgCl2 10xThermo Scientific14185045
iQ SYBR Green SupermixBio-rad1725006CUST
Iscript c-DNA synthesisBio-rad1708890
Latex beads, amine-modified polystyrene, fluorescent redSigma-AldrichL2776-1mL
Lipopolysaccharides (LPS) from Escherichia coli O55:B5Sigma-AldrichL2880
Macrophage-SFM serum-free mediumThermo Scientific12065074
MACS BSA Stock SolutionMiltenyi Biotec130-091-376
MACS SmartStrainers (70 μm), 4 x 25 pcsMiltenyi Biotec130-110-916
Mouse IgG1 PEMilliporeMABC002H
Mouse IgG2a PE Cy7Sony Biotechnology2601265
Mouse IL1 betaMiltenyi Biotec130-101-684
Multi-24 Column BlocksMiltenyi Biotec130-095-691
MultiMACS Cell24 SeparatorMiltenyi Biotec
Neural Tissue Dissociation Kit - PapainMiltenyi Biotec130-092-628
Nucleocounter NC-200Chemometec
Nucleospin RNA Plus XSMacherey Nagel740990.5
Nun EZFlip Top Conical Centrifuge TubesThermo Scientific362694
OPTILUX Petri dish - 100 x 20 mmDutscher353003
Pénicilline-streptomycine (10 000 U/mL)Thermo Scientific15140122
Rat IgG2b, k BV421BD Biosciences562603
Rat IgG2b, k BV510Sony Biotechnology2603230
REA control (S) PE vio 615Miltenyi Biotec130-104-616
REA control (S) Vio Bright B515Miltenyi Biotec130-113-445
Recombinant Mouse IFN-gamma ProteinR&D System485-MI
Recombinant Mouse IL-10 ProteinR&D System417-ML
Recombinant Mouse IL-4 ProteinR&D System404-ML
RIPA BufferSigma-AldrichR0278
Viability probe (FVS780)BD Biosciences565388

Referencias

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