从新生小鼠中磁分离小胶质细胞用于原代细胞培养

摘要

原代小胶质细胞培养通常用于评估新的抗炎分子。本协议描述了一种可重复且相关的方法，用于从新生儿幼崽中磁性分离小胶质细胞。

摘要

小胶质细胞作为大脑驻留巨噬细胞，是多种功能的基础，包括对环境压力的反应和大脑稳态。小胶质细胞可以采用大谱活化表型。此外，支持促炎表型的小胶质细胞与神经发育和神经退行性疾病有关。 体外 研究广泛用于评估特定细胞类型的潜在治疗策略的研究。在这种情况下，使用原代小胶质细胞培养物在 体外研究 小胶质细胞活化和神经炎症比小胶质细胞系或干细胞衍生的小胶质细胞更相关。然而，某些原代培养物的使用可能会受到缺乏可重复性的影响。该协议提出了一种从新生儿幼崽中磁性分离小胶质细胞的可重复和相关方法。这里展示了在4小时和24小时后通过mRNA表达定量和Cy3-珠吞噬细胞测定使用几种刺激物的小胶质细胞活化。目前的工作有望提供一种易于复制的技术，用于从青少年发育阶段分离生理相关的小胶质细胞。

引言

小胶质细胞是中枢神经系统驻留的巨噬细胞样细胞，来源于卵黄囊的红细胞生成前体，在胚胎早期发育期间迁移到神经上皮¹。除了免疫功能外，它们在神经发育过程中也起着重要作用，特别是在突触发生、神经元稳态和髓^{鞘形成方面}2。在成年期，小胶质细胞发展出长细胞过程以连续扫描环境。在脑损伤或脑部疾病等稳态破裂的情况下，小胶质细胞可以改变其形态外观，采用变形虫形状，迁移到受伤区域，增加和释放许多细胞保护或细胞毒性因子。小胶质细胞具有异质性激活状态，具体取决于其发育阶段和所受损伤的类型³，^4，5。在这项研究中，这些激活状态大致分为三种不同的表型:促炎/吞噬细胞，抗炎和免疫调节，请记住，实际上，情况可能^更复杂6。

由于（1）断奶前动物的脆弱性和（2）小胶质细胞细胞数量少，在大脑发育的早期阶段研究体内小胶质细胞活化和神经保护策略的筛选可能具有挑战性。因此，小胶质细胞的体外研究广泛用于毒性⁷，^8，9，^神经保护策略⁵，^10，11，12，13，14和共培养15，16，^17，18，¹⁹，^20，21.体外研究可以使用小胶质细胞系、干细胞来源的小胶质细胞或原代小胶质细胞培养。所有这些方法都有优点和缺点，选择取决于最初的生物学问题。使用原代小胶质细胞培养物的好处是同质的遗传背景、无病原体的历史以及控制动物死亡后小胶质细胞被刺激的时间²²。

多年来，开发了不同的方法（流式细胞术，摇动或磁性标记）用于培养啮齿动物的初级小胶质细胞，包括新生儿和成人²³，24，²⁵，²⁶，²⁷，^28，29。在本工作中，使用先前描述的磁激活细胞分选技术使用微珠包被的抗小鼠CD11b 25^，27，29进行小鼠新生幼崽的小胶质细胞分离。CD11b是一种在骨髓细胞（包括小胶质细胞）表面表达的整合素受体。当大脑内没有炎症挑战时，几乎所有的CD11b +细胞都是小胶质细胞³⁰。与先前发表的其他方法²³，^24，25，26，²⁷，²⁸，²⁹相比^，本协议平衡了即时离体小胶质细胞活化分析和常见的体外原代小胶质细胞培养。 因此，小胶质细胞（1）在出生后第（P）8天分离，没有髓磷脂去除，（2）无血清培养，（3）在脑分离后仅48小时暴露于siRNA，miRNA，药理化合物和/或炎症刺激。这三个方面中的每一个都使当前的协议具有相关性和快速性。首先，使用小儿小胶质细胞可以在培养中获得动态和反应性活细胞，而无需额外的脱髓鞘步骤，这可能会在体外改变小胶质细胞的反应性。本协议旨在尽可能接近小胶质细胞的生理环境。事实上，小胶质细胞从未遇到过血清，并且该方案也不需要使用血清。此外，早在培养后48小时暴露小胶质细胞可以防止它们失去生理能力。

研究方案

该协议获得批准，所有动物均根据国家卫生和科学研究研究所（法国Inserm）的机构准则进行处理。介绍了 P8 处 24 只 OF1 小鼠幼崽（雄性和雌性）大脑中小胶质细胞的磁分离，分为 6 孔、12 孔或 96 孔板。实验工作在引擎盖下进行，以保持无菌条件。

1. 制备用于分离和细胞培养的无菌溶液

1. 从市售的 10x 溶液中制备 50 mL 不含 Ca 2+ 和 Mg²⁺ （HBSS^-/-） 的 1x Hanks 平衡盐溶液 （HBSS）（参见材料表）。
2. 使用市售的组织解离试剂盒根据表 1 中提供的组成制备解离混合物（参见 材料表）。
3. 从市售的 10x 溶液中制备 200 mL 含有 Ca 2+ 和 Mg²+ （HBSS^+/+） 的 1x HBSS。
4. 准备 200 mL 的 1x PBS + 0.5% BSA（称为细胞分选缓冲液）。
5. 根据 表2制备CD11b微珠。
6. 准备 500 mL 无巨噬细胞血清培养基 （SFM） + 1% 青霉素-链霉素 （P/S）。制作50mL管的等分试样并将其储存在4°C。 这在文的后面被称为小胶质细胞培养基。
   注意:所有分离溶液必须在实验当天在无菌条件下新鲜制备并保持在冰上。可以制备小胶质细胞培养基，在50 mL管中等分，并保持在4°C以备将来使用。不需要过滤。

2.脑解剖

1. 在没有全身麻醉的情况下，用大剪刀斩首幼犬的头部。
2. 用小剪刀在矢状缝合线（15-20毫米）后从颈部到鼻子切开皮肤（图1A-C）。
3. 在与头骨平行的大孔内插入一个小剪刀尖。从每侧小心地切到眼睛（图1D，E）。
4. 用小剪刀在眼睛之间剪开，将头骨和大脑从头部分离（图1F）。
5. 用两个镊子抓住靠近嗅球的头骨并小心撕裂头骨，注意不要损坏下面的大脑（图1G-I）。
6. 用剃须刀片去除小脑和嗅觉球，并将大脑切成两块（图1J）。
7. 将脑碎片放入含有30-40mL ^HBSS的 培养皿中（图1K）。

3.脑解离与磁小胶质细胞分离

注意:所有细胞操作和重悬液必须非常小心地使用1，000μL移液器进行。施加高机械作用可能会激活或杀死小胶质细胞。

1. 根据表1，每个含有解离混合物的解离管转移12个脑碎片（~1.2g）。对于24只幼崽，需要四个C管（图2A-B）。
2. 将C管放在解离器上（使用加热模式）。根据制造商的说明在设备中启动优化的NTDK程序（图2D）。
3. 以300× g 离心20秒（在4°C下）以收集所有细胞。用 1，000 μL 移液器上下移液 3 次，完成机械解离（图 2E）。
4. 将细胞转移到四个 15 mL 管 + 过滤器中。用 10 mL HBSS^+/+ 冲洗过滤器（图 2F）。
5. 以300× g 离心10分钟（在4°C）并除去上清液。小心地用 10 mL HBSS^+/+ 重悬沉淀（图 2G）。
6. 以300× g 离心10分钟（在4°C）并除去上清液。小心地用6 mL分选缓冲液重悬沉淀（步骤1.4）（图2H）。
7. 以300× g 离心10分钟（在4°C）并除去上清液。每管加入 200 μL CD11b 微珠溶液（步骤 1.5），并小心重悬（图 2I）。
8. 将试管在4°C孵育15-20分钟。 小心地用 6 mL 分选缓冲液重悬沉淀（图 2I-J）。
9. 以300× g 离心10分钟（在4°C）并除去上清液。小心地用8 mL分选缓冲液重悬沉淀（图2K）。
10. 按照分离器上的POSSEL程序（见 材料表）准备八根色谱柱。将细胞转移到色谱柱上 1 mL x 1 mL。等待所有细胞通过，然后再添加另一个 mL。用 1 mL 分选缓冲液在无菌洗脱板上洗脱 CD11b+ 细胞（图 2L）。
11. 将CD11b +细胞汇集在新的50 mL管中（图2M）。
12. 以300× g 离心10分钟（在4°C）并除去上清液。小心地用10mL冷小胶质细胞培养基重悬沉淀（步骤1.6）（图2N）。
13. 计数CD11b +细胞。在P8时，每个大脑应该获得~650，000个细胞。
    注意:在本协议中，使用自动细胞计数器对细胞进行计数（参见 材料表）。
14. 将细胞重悬于冷小胶质细胞培养基中至终浓度为650，000-700，000个细胞/ mL，并分配在细胞培养板中。
    注意:6孔板用于蛋白质印迹（每孔2 mL）;12 孔板用于 RT-qPCR 分析（每孔 1 mL），96 孔板用于吞噬细胞测定（每孔 250 μL）;这三个都用于这项工作。然而，在本手稿中，没有显示蛋白质印迹分析的结果，但可以使用该方案进行。
15. 将板置于37°C，5%CO₂过夜。使用带有预热小胶质细胞培养基的 1，000 μL 移液器小心更换培养基。
16. 在刺激前将板置于37°C，5%CO₂过夜。
    注意:不建议从超过 36 只幼崽和 P9 之后分离小胶质细胞。这将增加污染和细胞碎片积累以激活小胶质细胞的风险。

4. 细胞刺激

1. 使用市售试剂根据表 3 制备刺激试剂（参见 材料表）。
2. 在每个刺激孔中加入适当的体积。
   注意:适当的体积取决于刺激物的浓度和孔的大小。
3. 将板置于37°C，5%CO₂直到6小时，24小时或48小时刺激结束。
4. 对于蛋白质印迹分析，吸出上清液并用移液器加入50 μL蛋白质裂解缓冲液（参见 材料表）。使用吸头刮擦板底部以分离裂解的细胞并将其转移到 1.5 mL 管中。储存在-80°C。
   注意:如果正确吸出上清液，培养板可以在-80°C下储存多年。
5. 对于RT-qPCR分析⁶，^31，吸出上清液并将培养板直接储存在-80°C直至mRNA提取（步骤5）。
6. 对于吞噬细胞测定，请参阅步骤6。

5. mRNA提取和RT-qPCR分析

1. 按照制造商的方案进行RNA提取，RT-PCR和RT-qPCR（参见材料表）。引物序列5，^6，31参见表4。
2. 按照先前发布的报告进行 RT-qPCR 分析⁵.

6. 吞噬细胞测定

1. 刺激细胞并在刺激的最后3小时内进行吞噬测定。例如，对于6小时的刺激，在刺激3小时后开始吞噬测定;对于刺激12小时，在刺激开始后9小时开始吞噬测定。
2. 考虑到比率（1 个单元格:50 个珠子），计算制备所需的珠子数量。对于 96 孔板的一个孔，需要 8.1 x 10⁶ 个磁珠。根据 表5制备珠子混合物。
   注意:在加入PBS / FBS混合物之前，请小心地涡旋珠子库存小瓶。
3. 在37°C的水浴中孵育1小时。 每10分钟涡旋一次。
4. 计算要添加到每个孔中的溶液体积。加入溶液并孵育3小时。
5. 用 1x PBS 冲洗孔三次。读取 550 nm 处的荧光发射（Cy3 发射波长）。

7. 纯度质量控制

1. 通过流式细胞术（FACS）（细胞分选前后）评估CD11b磁性分离的纯度，然后进行RT-qPCR。
   1. 计数细胞并重悬于FACS缓冲液（PBS + 2mM的EDTA + 0.5%的牛血清白蛋白）中，以便在步骤3.5和步骤3.14之后获得10 x 10⁶ 细胞/ mL的稀释度。
   2. 常规Fc封闭³²，331分钟后，用活性探针（FVS780）和针对小鼠CD45，CD11b，CX3CR1，ACSA-2，O4或其相应的对照同种型³²，³³的荧光团偶联抗体孵育细胞15分钟^，浓度为制造商推荐的浓度（参见材料表）。
   3. 用FACS缓冲液洗涤细胞，固定并用市售的透化试剂盒透化（参见 材料表）。
   4. 在透化细胞上再次进行Fc封闭，然后与针对NeuN的荧光团偶联抗体（参见 材料表）或其对照同种型孵育15分钟。
   5. 用FACS缓冲液洗涤后进行FACS分析。
   6. 分别根据形态学参数和FVS780染色排除双峰和死细胞后，选择CX3CR1（小胶质细胞），ACSA-2（星形胶质细胞），O4（少突胶质细胞）和NeuN（神经元）的细胞内存在的表面表达的门控策略，以分析阳性细胞的百分比。
2. 在步骤5之后，提取mRNA并进行RT-qPCR以定量 Itgam （CD11b），Cx3cr1，Olig2，Synaptophysin 和 Gfap mRNA。使用 Rpl13a mRNA作为报告基因标准化Cq，并对 Itgam mRNA进行相对表达。

结果

小胶质细胞是中枢神经系统驻留的巨噬细胞，当暴露于环境挑战（创伤，有毒分子，炎症）时被激活⁴，⁵，^6，34（图3A）。小胶质细胞的体外研究通常用于评估与这些环境挑战相关的细胞自主机制，并表征药理学或遗传操作后的激活状态。本文提出了一种使用磁耦合珠在幼...

讨论

目前的工作展示了使用磁分选CD11b +细胞的原代小胶质细胞培养物。除了小胶质细胞功能评估（RT-qPCR和吞噬细胞测定）外，还测定了小胶质细胞培养纯度。

经典的小胶质细胞培养物通常由 P1 或 P2 啮齿动物新生儿脑生成，并与星形胶质细胞共培养至少 10 天。然后使用轨道摇床机械分离小胶质细胞。体 外分离 和培养小胶质细胞的方法在1990年代末首次从新生大鼠的大脑

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Anti mouse ACSA-2 PE Vio 615	Miltenyi Biotec	130-116-246
Anti mouse CD11b BV421	Sony Biotechnology	1106255
Anti mouse CD45 BV510	Sony Biotechnology	1115690
Anti mouse CX3CR1 PE Cy7	Sony Biotechnology	1345075
Anti mouse NeuN PE	Milli-Mark	FCMAB317PE
anti mouse O4 Vio Bright B515	Miltenyi Biotec	130-120-016
BD Cytofix/Cytoperm permeabilization kit	BD Biosciences	554655
Bovine Serum Albumin	Miltenyi Biotec	130-091-376
CD11b (Microglia) MicroBeads, h, m	Miltenyi Biotec	130-093-634
Confocal microscope	Leica TCS SP8
D-PBS (10x)	Thermo Scientific	14200067
EDTA	Sigma-Aldrich	E1644
Falcon Cell culture 12-well plate, flat bottom + lid	Dutscher	353043
Falcon Cell culture 96-well plate, flat bottom + lid	Dutscher	353072
Falcon tubes 50 mL	Dutscher	352098
Fc blocking reagent (Mouse CD16/32)	BD Biosciences	553142
Fluorescence microscope	Nikon ECLIPSE TE300
gentleMACS C Tubes (4 x 25 tubes)	Miltenyi Biotec	130-096-334
gentleMACS Octo Dissociator with Heaters	Miltenyi Biotec	130-096-427
Hanks' Balanced Salt Solution (HBSS) +CaCl2 +MgCl2 10x	Thermo Scientific	14065049
Hanks' Balanced Salt Solution (HBSS) -CaCl2 -MgCl2 10x	Thermo Scientific	14185045
iQ SYBR Green Supermix	Bio-rad	1725006CUST
Iscript c-DNA synthesis	Bio-rad	1708890
Latex beads, amine-modified polystyrene, fluorescent red	Sigma-Aldrich	L2776-1mL
Lipopolysaccharides (LPS) from Escherichia coli O55:B5	Sigma-Aldrich	L2880
Macrophage-SFM serum-free medium	Thermo Scientific	12065074
MACS BSA Stock Solution	Miltenyi Biotec	130-091-376
MACS SmartStrainers (70 μm), 4 x 25 pcs	Miltenyi Biotec	130-110-916
Mouse IgG1 PE	Millipore	MABC002H
Mouse IgG2a PE Cy7	Sony Biotechnology	2601265
Mouse IL1 beta	Miltenyi Biotec	130-101-684
Multi-24 Column Blocks	Miltenyi Biotec	130-095-691
MultiMACS Cell24 Separator	Miltenyi Biotec
Neural Tissue Dissociation Kit - Papain	Miltenyi Biotec	130-092-628
Nucleocounter NC-200	Chemometec
Nucleospin RNA Plus XS	Macherey Nagel	740990.5
Nun EZFlip Top Conical Centrifuge Tubes	Thermo Scientific	362694
OPTILUX Petri dish - 100 x 20 mm	Dutscher	353003
Pénicilline-streptomycine (10 000 U/mL)	Thermo Scientific	15140122
Rat IgG2b, k BV421	BD Biosciences	562603
Rat IgG2b, k BV510	Sony Biotechnology	2603230
REA control (S) PE vio 615	Miltenyi Biotec	130-104-616
REA control (S) Vio Bright B515	Miltenyi Biotec	130-113-445
Recombinant Mouse IFN-gamma Protein	R&D System	485-MI
Recombinant Mouse IL-10 Protein	R&D System	417-ML
Recombinant Mouse IL-4 Protein	R&D System	404-ML
RIPA Buffer	Sigma-Aldrich	R0278
Viability probe (FVS780)	BD Biosciences	565388