JoVE Logo
Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • النتائج
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

هنا نصف بروتوكول لتوليد الأجهزة العضوية في الدماغ من الخلايا الجذعية المستحثة من قبل الإنسان (iPSCs). للحصول على أعضاء الدماغ بكميات كبيرة وبجودة عالية، نستخدم المفاعلات الحيوية المصغرة المصنوعة منزليا.

Abstract

الجهاز العضوي الدماغ المستمدة من iPSC هي تقنية واعدة للنمذجة في المختبر أمراض الجهاز العصبي وفحص المخدرات. وقد ظهرت هذه التكنولوجيا في الآونة الأخيرة. وهي لا تزال في مهدها ولم تحل بعض القيود بعد. البروتوكولات الحالية لا تسمح الحصول على organoids لتكون متسقة بما فيه الكفاية لاكتشاف المخدرات والدراسات قبل السريرية. يمكن أن يستغرق نضوج الأعضاء ما يصل إلى عام ، مما يدفع الباحثين إلى إطلاق عمليات تمايز متعددة في وقت واحد. ويفرض تكاليف إضافية على المختبر من حيث المساحة والمعدات. بالإضافة إلى ذلك ، غالبا ما يكون لدى أعضاء الدماغ منطقة نخرية في المركز ، والتي تعاني من نقص المغذيات والأوكسجين. ومن ثم، فإن معظم البروتوكولات الحالية تستخدم نظاما متداولا للوسط الثقافي لتحسين التغذية.

وفي الوقت نفسه، لا توجد أنظمة ديناميكية غير مكلفة أو مفاعلات حيوية لزراعة الأعضاء العضوية. تصف هذه الورقة بروتوكولا لإنتاج أعضاء الدماغ في المفاعلات الحيوية الصغيرة المدمجة وغير المكلفة المصنوعة منزليا. يسمح هذا البروتوكول بالحصول على أجهزة عضوية عالية الجودة بكميات كبيرة.

Introduction

وتستخدم على نطاق واسع نماذج الإنسان iPSC المستمدة في دراسات الاضطرابات العصبية النمائية والعصبية1. على مدى العقد الماضي، نماذج أنسجة الدماغ 3D، ما يسمى organoids الدماغ، تكمل أساسا الثقافات العصبية التقليدية 2D2. الأجهزة العضوية تلخيص إلى حد ما الهندسة المعمارية 3D من الدماغ الجنيني والسماح النمذجة أكثر دقة. يتم نشر العديد من البروتوكولات لجيل من organoids تمثل مناطق الدماغ المختلفة: قشرة الدماغ3,4,5, المخيخ6, منتصف الدماغ, الدماغ الأمامي, تحت المهاد7,8,9, والحصين10. كانت هناك أمثلة متعددة لاستخدام organoids لدراسة أمراض الجهاز العصبي البشري11. أيضا ، تم تنفيذ organoids في الاكتشافات المخدرات12 وتستخدم في دراسات الأمراض المعدية ، بما في ذلك سارس - كوف - 213،14.

يمكن أن تصل عضويات الدماغ إلى عدة ملليمترات في القطر. لذلك ، قد تعاني المنطقة الداخلية من الجهاز من نقص الأكسيجة أو سوء التغذية وتصبح في نهاية المطاف نخرية. لذلك، تتضمن العديد من البروتوكولات المفاعلات الحيوية الخاصة8،الهزازات، أو أنظمة microfluidic15. قد تتطلب هذه الأجهزة كميات كبيرة من الوسائط ثقافة الخلية مكلفة. كما أن تكلفة هذه المعدات عادة ما تكون مرتفعة. تتكون بعض المفاعلات الحيوية من العديد من الأجزاء الميكانيكية التي تجعل من الصعب تعقيمها لإعادة استخدامها.

معظم البروتوكولات تعاني من "تأثير دفعي"16، مما يولد تباينا كبيرا بين organoids التي تم الحصول عليها من iPSCs متطابقة. هذا التباين يعوق اختبار المخدرات أو الدراسات قبل السريرية التي تتطلب التوحيد. الغلة العالية من organoids بما فيه الكفاية لتحديد organoids من حجم موحد قد يحل جزئيا هذه المشكلة.

عامل الوقت هو أيضا مشكلة كبيرة. أظهر ماتسوي وآخرون (2018) أن أعضاء الدماغ تتطلب ستة أشهر على الأقل للوصول إلى مرحلة النضج17. تروخيلو وآخرون (2019) أظهر أيضا أن النشاط الكهربي حدث في الأجهزة العضوية فقط بعد ستة أشهر منالزراعة 18. بسبب فترة النضج العضوي الطويلة ، يطلق الباحثون في كثير من الأحيان تمايزا جديدا قبل إكمال سابقه. تتطلب عمليات التمايز المتوازية المتعددة نفقات ومعدات ومساحات مختبرية إضافية.

لقد قمنا مؤخرا بتطوير مفاعل حيوي مصغر يحل بشكل رئيسي المشاكل المذكورة أعلاه19. يتكون هذا المفاعل الحيوي المصنوع منزليا من التصاق منخفض للغاية أو طبق بيتري غير المعالج مع مقبض بلاستيكي في الوسط. هذا مقبض بلاستيكي يمنع تزاحم organoids وconglutination بهم في وسط طبق بيتري، الذي يسببه تناوب شاكر. تصف هذه الورقة كيف أن هذا المفاعل الحيوي الصغير غير المكلف والبسيط المصنوع منزليا يسمح بتوليد أعضاء دماغية عالية الجودة بكميات كبيرة.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

ملاحظة: استخدام تقنية عقيمة في جميع أنحاء البروتوكول، باستثناء الخطوتين 1.2 و 1.3. قم بتدفئة جميع الوسائط والثقافة والحلول إلى 37 درجة مئوية قبل تطبيقها على الخلايا أو الأعضاء العضوية. زراعة الخلايا فيحاضنة ثاني أكسيد الكربون عند 37 درجة مئوية في 5٪ CO2 عند رطوبة 80٪. يظهر مخطط البروتوكول في الشكل 1.

1. تحويل أطباق بيتري إلى مفاعلات حيوية مصغرة

  1. قطع أنابيب الطرد المركزي العقيمة 15 مل في حلقات من 7-8 ملم في الارتفاع؛ أوتوكلاف الحلقات.
  2. كسر منخفضة التصاق، غير المعالجة أو الميكروبيولوجية أطباق بيتري إلى فتات. حل حوالي 1 غرام من فتات البلاستيك في 10 مل من الكلوروفورم بين عشية وضحاها لإعداد البلاستيك السائل.
    تنبيه: العمل في غطاء الدخان.
  3. تأكد من أن البلاستيك السائل الناتج لزج بما يكفي للأنابيب؛ يحتفظ قطرة شكل كروي ولا ينتشر على السطح. إذا كان سائلا جدا، أضف المزيد من الفتات البلاستيكي. إذا كان سميكا، ثم إضافة الكلوروفورم.
  4. جعل مقبض بلاستيكي في وسط الالتصاق العقيمة منخفضة جدا 6 سم طبق بيتري. هناك طريقتان مناسبتان على قدم المساواة ، كما هو مفصل أدناه.
    1. وضع حلقة بلاستيكية autoclaved على المركز وإسقاط البلاستيك السائل إلى داخل الحلبة.
    2. دون أي حلقة بلاستيكية، إسقاط البلاستيك السائل على وسط طبق بيتري.
  5. اترك الأطباق مفتوحة لمدة 2-3 ساعة في غطاء تدفق صفح حتى تكتمل. علاج الأطباق المجففة بالأشعة فوق البنفسجية لمدة 15-20 دقيقة.

2. تحريض التمايز العصبي من iPSCs

  1. زراعة iPSCs في المتوسط للخلايا الجذعية متعددة القدرات تصل إلى التقاء 75-90٪ في أطباق بيتري 35 ملم precoated مع مصفوفة تتكون من البروتينات خارج الخلية.
  2. إعداد متوسط A-SR. انظر الجدول 1 للاطلاع على التفاصيل.
  3. يستنشق المتوسطة زراعة وإضافة 2 مل من A-SR المتوسطة في اليوم 0 من التمايز.
  4. إعداد المتوسطة A (انظر الجدول 2).
  5. زراعة الخلايا في المتوسط A لمدة أسبوعين من أيام 2-14، منعش المتوسطة في أطباق بيتري كل يومين.

3. تشكيل كرويدات من خلايا السلائف العصبية الإبطية في اليوم 14

  1. في اليوم 14، وجعل كرويدات من خلايا السلائف العصبية الإبطية باستخدام لوحة خاصة ثقافة 24 جيدا تحتوي على ما يقرب من 1200 ميكروويل في كل بئر(الشكل 2C). اتبع الإجراء الموضح أدناه.
    ملاحظة: في هذه المرحلة التمايز، طبق بيتري 35 ملم يحتوي عادة 3-3.5 × 106 خلايا السلائف العصبية الإبطية. وهكذا، طبق بيتري واحد 35 ملم مع خلايا السلائف العصبية الإبطية كافية ل3-4 آبار من لوحة ثقافة 24 جيدا مع microwells.
  2. إعداد لوحة ثقافة 24 جيدا مع microwells: إلى كل بئر، إضافة 1 مل من أجهزة الطرد المركزي A. المتوسطة لفترة وجيزة في 1300 × ز لمدة 5 دقائق في الدوار دلو يتأرجح مزودة حامل لوحة. السيطرة تحت المجهر أنه لا توجد فقاعات في microwells.
  3. إعداد المتوسط B (الجدول 3).
  4. إزالة المتوسطة من طبق بيتري مع خلايا السلائف العصبية الإبطية; غسل الخلايا مع 2 مل من DMEM/F12. لمفرزة الخلية، علاج الخلايا مع 1.5 مل من 0.48 mM EDTA الحل المعدة في برنامج تلفزيوني. السيطرة على مفرزة الخلية تحت المجهر.
  5. حصاد الخلايا في أنبوب 15 مل. إضافة 5 مل من DMEM/F12 في أنبوب لغسل الخلايا. جهاز طرد مركزي عند 200 × ز لمدة 5 دقائق. إزالة الخلايا العملاقة وإعادة الإنفاق في 2 مل من B المتوسطة.
  6. تحقق من تركيز الخلية وقابليتها للحياة عن طريق تلطيخ تريبان الأزرق ومقياس الدم. حساب حجم التعليق اللازمة لاحتواء 1 × 106 خلايا قابلة للحياة في المجموع.
  7. نقل تعليق الخلية التي تحتوي على 1 ×10 6 خلايا في كل بئر من لوحة 24 جيدا مع microwells. أضف متوسط B يصل إلى 2 مل في كل بئر، وخلايا ماصة بلطف صعودا وهبوطا عدة مرات، والطرد المركزي لفترة وجيزة 100 × ز لمدة 1 دقيقة لالتقاط الخلايا في microwells.
    ملاحظة: يجب ألا يتجاوز عدد الخلايا لكل بئر 1 × 106. خلاف ذلك ، تنصهر كرويدات من الروبوتات الدقيقة المجاورة.
  8. تحقق تحت المجهر من أن الخلايا موزعة بالتساوي في microwells. كرر الأنابيب والطرد المركزي إذا تم توزيع الخلايا بشكل غير متساو.
  9. احتضان لوحة بين عشية وضحاها للسماح للخلايا تتجمع في كرويات.

4. الحصول على وزراعة الأجهزة العضوية

  1. في صباح اليوم التالي (اليوم 15) ، تحقق من جودة كرويات تحت المجهر. تأكد من أنها شفافة وسلسة، إذا كانت صحية(الشكل 2A،B). جمع بعناية كرويدات من كل بئر في أنبوب 15 مل، وترك كرويدات للتعجيل بالجاذبية لمدة 2-3 دقائق، ومن ثم إزالة supernatant.
  2. إضافة إلى كرويدات 2 مل من المصفوفة إذابة خلال نفس الوقت على الجليد. تخلط بلطف عن طريق الأنابيب واحتضان في درجة حرارة الغرفة لمدة 30 دقيقة.
  3. لغسل الزائدة من المصفوفة، إضافة إلى أنبوب 8 مل من المتوسط B. Pipette بلطف، ثم الطرد المركزي أنبوب لمدة 1 دقيقة في 100 × ز.
    ملاحظة: لا تتجاوز الوقت وسرعة الطرد المركزي لتجنب تجميع لا رجعة فيه من كرويدات.
  4. أزل الناتنات الفائق. إضافة إلى أنبوب 2 مل من B المتوسطة، ماصة بلطف. تقسيم تعليق كروية بين اثنين من المفاعلات الحيوية المصغرة، كل تحتوي على 4 مل من B. متوسطة وضع المفاعلات الحيوية المصغرة في طبق بيتري 15 سم لمنع تبخر المياه وتجنب التلوث.
  5. وضع طبق بيتري مع المفاعلات الحيوية المصغرة على شاكر المدارية. زراعة organoids بمعدل دوران 70-75 دورة في الدقيقة.
  6. في اليوم 16، إعداد متوسط C (الجدول 4).
  7. نقل organoids في أنبوب 15 مل. لمدة 5 دقائق، والسماح لهم تقع إلى أسفل، يستنشق supernatant، إضافة 5 مل من C. متوسطة عودة organoids في المفاعلات الحيوية المصغرة.
    ملاحظة: يجب الحرص على عدم فقدان كرويدات شفافة وبالكاد مرئية.
  8. زراعة كرويدات في المتوسط C لمدة أسبوعين، منعش المتوسطة كل يومين. في نهاية هذين الأسبوعين، اترك حوالي 100 كروية لكل مفاعل حيوي صغير للزراعة التالية. تجميد كرويات المفرط في وسيلة تجميد في النيتروجين السائل.
  9. في اليوم 30، قم بإعداد متوسط D (الجدول 5).
  10. تغيير زراعة المتوسطة والمتوسطة D، وهو وسيط النضج. تحديث زراعة المتوسطة كل 2-3 أيام لمدة ثلاثة أسابيع، ثم استخدام متوسط D دون BDNF وGDNF.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

النتائج

يظهر مخطط البروتوكول في الشكل 1. وتضمن البروتوكول خمس وسائط تمايزت فيها أجهزة iPSCs إلى أعضاء دماغية خلال شهر واحد على الأقل. بدأ التمايز ثم وصلت iPSCs إلى التقاء 75-90 ٪ (الشكل 2A، B). لوحظت العلامات الأولى للتمايز نحو الخلايا العصبية في الأيام 10-11 من زراعة iP...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

البروتوكول الموصوف له خطوتان حاسمتان تسمحان بتوليده من الأجهزة عالية الجودة ذات الحجم الموحد. أولا ، تنمو الأجهزة العضوية من كرويات متطابقة تقريبا في عدد الخلايا ونضج الخلية. ثانيا، توفر المفاعلات الحيوية المصنوعة منزليا لكل عضو بيئة موحدة، حيث لا تزاحم الأعضاء أو تلتصق ببعضها البعض.

<...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

وليس لدى صاحبي البلاغ ما يكشفان عنه.

Acknowledgements

تم دعم هذا العمل من خلال المنحة 075-15-2019-1669 من وزارة العلوم والتعليم العالي في الاتحاد الروسي (تحليل RT-PCR) والمنحة رقم 19-15-00425 من مؤسسة العلوم الروسية (لجميع الأعمال الأخرى). كما يشكر المؤلفون بافل بيلكوف على مساعدته في تحرير الفيديو. تم إنشاء الأرقام في المخطوطة مع BioRender.com.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
Advanced DMEM/F-12Gibco12634010DMEM/F-12
AggreWell400STEMCELL Technologies Inc3442524-well culture plate with microwells
B-27 SupplementGibco17504044Neuronal supplement B
GlutaMAX SupplementGibco35050061200 mM L-alanyl-L-glutamine
Human BDNFMiltenyi Biotec130-096-285
Human FGF-2Miltenyi Biotec130-093-839
Human GDNFMiltenyi Biotec130-096-290
KnockOut Serum ReplacementGibco10828028Serum replacement
mTESR1STEMCELL Technologies Inc85850Pliripotent stem cell medium
N2 SupplementGibco17502001
Neurobasal MediumGibco21103049Basal medium for neuronal cell maintenance
Penicillin-Streptomycin SolutionGibco15140130
PlasmocinInvivoGenant-mpt-1Antimicrobials
PurmorphamineEMD Millipore540220
StemMACS Y27632Miltenyi Biotec130-106-538Y27632
StemMACS DorsomorphinMiltenyi Biotec130-104-466Dorsomorphin
StemMACS LDN-193189Miltenyi Biotec130-106-540LDN-193189
StemMACS SB431542Miltenyi Biotec130-106-543SB431542
Trypan Blue SolutionGibco15250061
Versen solutionGibco150400660.48 mM EDTA in PBS
β-mercaptoethanolGibco31350010

References

  1. Marchetto, M. C., Winner, B., Gage, F. H. Pluripotent stem cells in neurodegenerative and neurodevelopmental diseases. Human Molecular Genetics. 19, 71-76 (2010).
  2. Lee, C. T., Bendriem, R. M., Wu, W. W., Shen, R. F. 3D brain Organoids derived from pluripotent stem cells: promising experimental models for brain development and neurodegenerative disorders. Journal of Biomedical Science. 24 (1), 1-12 (2017).
  3. Kadoshima, T., et al. Self-organization of axial polarity, inside out layer pattern, and species-specific progenitor dynamics in human ES cell-derived neocortex. Proceedings of the National Academy of Sciences U.S.A. 110 (50), 20284(2013).
  4. Lancaster, M. A., et al. Cerebral organoids model human brain development and microcephaly. Nature. 501 (7467), 373-379 (2013).
  5. Xiang, Y., et al. Fusion of regionally specified hPSC derived organoids models human brain development and interneuron migration. Cell Stem Cell. 21, 383-398 (2017).
  6. Muguruma, K., Nishiyama, A., Kawakami, H., Hashimoto, K., Sasai, Y. Self-organization of polarized cerebellar tissue in 3D culture of human pluripotent stem cells. Cell Reports. 10 (4), 537-550 (2015).
  7. Qian, X., et al. Brain region specific organoids using mini bioreactors for modeling ZIKV exposure. Cell. 165 (5), 1238-1254 (2016).
  8. Qian, X., et al. Generation of human brain region specific organoids using a miniaturized spinning bioreactor. Nature Protocols. 13 (3), 565-580 (2018).
  9. Jo, J., et al. Midbrain like organoids from human pluripotent stem cells contain functional dopaminergic and neuro melanin producing neurons. Cell Stem Cell. 19 (2), 248-257 (2016).
  10. Sakaguchi, H., et al. Generation of functional hippocampal neurons from self-organizing human embryonic stem cell derived dorsomedial telencephalic tissue. Nature Communication. 6 (1), 8896(2015).
  11. Di Lullo, E., Kriegstein, A. R. The use of brain organoids to investigate neural development and disease. Nature Reviews Neuroscience. 18 (10), 573-584 (2017).
  12. Chen, K. G., et al. Pluripotent stem cell platforms for drug discovery. Trends in Molecular Medicine. 24 (9), 805-820 (2018).
  13. Dang, J., et al. Zika virus depletes neural progenitors in human cerebral organoids through activation of the innate immune receptor TLR3. Cell Stem Cell. 19 (2), 258-265 (2016).
  14. Tiwari, S. K., Wang, S., Smith, D., Carlin, A. F., Rana, T. M. Revealing tissue-specific SARS-CoV-2 infection and host responses using human stem cell-derived lung and cerebral organoids. Stem Cell Reports. 16 (3), 437-445 (2021).
  15. Ao, Z., et al. One-stop microfluidic assembly of human brain organoids to model prenatal cannabis exposure. Analytical Chemistry. 92 (6), 4630-4638 (2020).
  16. Di Nardo, P., Parker, G. C. Stem cell standardization. Stem Cells Development. 20 (3), 375-377 (2011).
  17. Jo, J., Xiao, Y., et al. Midbrain like organoids from human pluripotent stem cells contain functional dopaminergic and neuro melanin producing neurons. Cell Stem Cell. 19 (2), 248-257 (2016).
  18. Matsui, T. K., et al. Six-month cultured cerebral organoids from human ES cells contain matured neural cells. Neuroscience Letters. 670, 75-82 (2018).
  19. Trujillo, C. A., et al. Complex oscillatory waves emerging from cortical organoids model early human brain network development. Cell Stem Cell. 25 (4), 558-569 (2019).
  20. Eremeev, A. V., et al. Necessity Is the mother of invention” or inexpensive, reliable, and reproducible protocol for generating organoids. Biochemistry (Moscow). 84 (3), 321-328 (2019).
  21. Qian, X., et al. Generation of human brain region–specific organoids using a miniaturized spinning bioreactor. Nature Protocols. 13, 565-580 (2018).
  22. Matsui, T. K., Tsuru, Y., Hasegawa, K., Kuwako, K. I. Vascularization of human brain organoids. Stem Cells. 39 (8), 1017-1024 (2021).
  23. Hall, G. N., et al. Patterned, organoid-based cartilaginous implants exhibit zone specific functionality forming osteochondral-like tissues in vivo. Biomaterials. 273, 120820(2021).
  24. Zachos, N. C., et al. Human enteroids/colonoids and intestinal organoids functionally recapitulate normal intestinal physiology and pathophysiology. Journal of Biological Chemistry. 291, 3759-3766 (2016).
  25. Eremeev, A., et al. Cerebral organoids—challenges to establish a brain prototype. Cells. 10 (7), 1790(2021).
  26. Kadoshima, T., et al. Self-organization of axial polarity, inside-out layer pattern, and species-specific progenitor dynamics in human ES Cell-derived neocortex. Proceedings of the National Academy of Sciences U. S. A. 110, 20284-20289 (2013).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

178

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved