在自制迷你生物反应器中从诱导多能干细胞中生成脑类器官

摘要

在这里，我们描述了一种从人类诱导多能干细胞（iPSCs）产生脑类器官的方案。为了获得大量和高质量的脑类器官，我们使用自制的迷你生物反应器。

摘要

iPSC衍生的脑类器官是一种有前途的技术，用于 体外 建模神经系统的病理学和药物筛选。这项技术最近才出现。它仍处于起步阶段，并且有一些限制尚未解决。目前的方案不允许获得足够一致的类器官用于药物发现和临床前研究。类器官的成熟可能需要长达一年的时间，这促使研究人员同时启动多个分化过程。这在空间和设备方面给实验室带来了额外的成本。此外，脑类器官通常在中心有一个坏死区，患有营养和缺氧。因此，大多数现行方案使用循环系统作为培养基以改善营养。

同时，没有用于类器官培养的廉价动态系统或生物反应器。本文描述了一种在紧凑且廉价的自制小型生物反应器中生产脑类器官的方案。该协议允许大量获得高质量的类器官。

引言

人类iPSC衍生的模型广泛用于神经发育和神经退行性疾病的研究^1。在过去的十年中，3D脑组织模型，即所谓的脑类器官，基本上补充了传统的2D神经元培养^物2。类器官在一定程度上概括了胚胎大脑的3D结构，并允许更精确的建模。许多方案已经发表，用于产生代表不同大脑区域的类器官：大脑皮层^3，4，5，小脑^6，中脑，前脑，下丘脑^7，8，9和海马^体10。已经有多个使用类器官研究人类神经系统疾病的例子¹¹。此外，类器官在药物发现¹²中实施，并用于传染病研究，包括SARS-Cov-2^13，14。

大脑类器官的直径可达几毫米。因此，....

研究方案

注意：在整个方案中使用无菌技术，不包括步骤1.2和1.3。在应用于细胞或类器官之前，将所有培养基和溶液加热至37°C。在37°C的CO₂ 培养箱中培养细胞，在80%湿度下在5%CO₂ 中培养细胞。协议方案如图 1所示。

1. 将培养皿转变为微型生物反应器

1. 将无菌的15 mL离心管切割成7-8毫米高的环;高压灭菌环。
2. 将低附着力、未经处理或微生物培养皿分解成碎屑。将约1克塑料屑溶解在10毫升氯仿中过夜，以制备液体塑料。
   注意：在通风橱中工作。
3. 检查得到的液体塑料是否足够粘稠，可以移液;它的液滴保持球形，不会在表面上扩散。如果非常液体，请添加更多的塑料屑。如果很厚，则加入氯仿。
4. 在无菌超低附着力6厘米培养皿的中心制作一个塑料旋钮。有两种同样合适的方法，详见下文。
   1. 将高压灭菌的塑料环放在中心，然后将液体塑料滴到环的内部。
   2. 在没有任何塑料环的情况下，将液体塑料放在培养皿的中心。
5. 将盘子在层流罩中打开2-3小时，直到干燥完成。用紫外线辐射处理干燥的盘子15-20分钟。

2. 诱导iPSCs的神经元分化

结果

协议方案如图1所示。该协议包括五种培养基，其中iPSCs在至少一个月内分化为脑类器官。开始分化，然后iPSCs达到75-90%的汇合度（图2A，B）。在培养基A中iPSC培养的第10-11天观察到向神经元分化的最初迹象，当时细胞开始聚集成"玫瑰花"（图2C）。在第14-15天，iPSCs分化为神经上皮祖细胞。99%的细胞在神经上皮标志物SOX1?.......

讨论

所描述的方案有两个关键步骤，允许产生大小均匀的高质量类器官。首先，类器官从在细胞数量和细胞成熟度上几乎相同的球体生长。其次，自制的生物反应器为每个类器官提供了一个统一的环境，在这个环境中，类器官不会聚集或粘在一起。

细胞质量和细胞成熟状态对于执行实验方案至关重要。在iPSC汇合75-90%处开始神经元分化至关重要。如果细胞密度太低，iPSC可以分化成.......

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Advanced DMEM/F-12	Gibco	12634010	DMEM/F-12
AggreWell400	STEMCELL Technologies Inc	34425	24-well culture plate with microwells
B-27 Supplement	Gibco	17504044	Neuronal supplement B
GlutaMAX Supplement	Gibco	35050061	200 mM L-alanyl-L-glutamine
Human BDNF	Miltenyi Biotec	130-096-285
Human FGF-2	Miltenyi Biotec	130-093-839
Human GDNF	Miltenyi Biotec	130-096-290
KnockOut Serum Replacement	Gibco	10828028	Serum replacement
mTESR1	STEMCELL Technologies Inc	85850	Pliripotent stem cell medium
N2 Supplement	Gibco	17502001
Neurobasal Medium	Gibco	21103049	Basal medium for neuronal cell maintenance
Penicillin-Streptomycin Solution	Gibco	15140130
Plasmocin	InvivoGen	ant-mpt-1	Antimicrobials
Purmorphamine	EMD Millipore	540220
StemMACS Y27632	Miltenyi Biotec	130-106-538	Y27632
StemMACS Dorsomorphin	Miltenyi Biotec	130-104-466	Dorsomorphin
StemMACS LDN-193189	Miltenyi Biotec	130-106-540	LDN-193189
StemMACS SB431542	Miltenyi Biotec	130-106-543	SB431542
Trypan Blue Solution	Gibco	15250061
Versen solution	Gibco	15040066	0.48 mM EDTA in PBS
β-mercaptoethanol	Gibco	31350010