JoVE Logo
发表
联系我们

登录

需要订阅 JoVE 才能查看此. 登录或开始免费试用。

本文内容

  • 摘要
  • 摘要
  • 引言
  • 研究方案
  • 结果
  • 讨论
  • 披露声明
  • 致谢
  • 材料
  • 参考文献
  • 转载和许可

摘要

在这里，我们描述了一种从人类诱导多能干细胞（iPSCs）产生脑类器官的方案。为了获得大量和高质量的脑类器官，我们使用自制的迷你生物反应器。

摘要

iPSC衍生的脑类器官是一种有前途的技术，用于 体外 建模神经系统的病理学和药物筛选。这项技术最近才出现。它仍处于起步阶段，并且有一些限制尚未解决。目前的方案不允许获得足够一致的类器官用于药物发现和临床前研究。类器官的成熟可能需要长达一年的时间，这促使研究人员同时启动多个分化过程。这在空间和设备方面给实验室带来了额外的成本。此外，脑类器官通常在中心有一个坏死区，患有营养和缺氧。因此，大多数现行方案使用循环系统作为培养基以改善营养。

同时，没有用于类器官培养的廉价动态系统或生物反应器。本文描述了一种在紧凑且廉价的自制小型生物反应器中生产脑类器官的方案。该协议允许大量获得高质量的类器官。

引言

人类iPSC衍生的模型广泛用于神经发育和神经退行性疾病的研究1。在过去的十年中，3D脑组织模型，即所谓的脑类器官，基本上补充了传统的2D神经元培养物2。类器官在一定程度上概括了胚胎大脑的3D结构，并允许更精确的建模。许多方案已经发表，用于产生代表不同大脑区域的类器官:大脑皮层3，4，5，小脑6，中脑，前脑，下丘脑7，8，9和海马体10。已经有多个使用类器官研究人类神经系统疾病的例子11。此外，类器官在药物发现12中实施，并用于传染病研究，包括SARS-Cov-213，14。

大脑类器官的直径可达几毫米。因此，类器官的内区可能患有缺氧或营养不良，最终变得坏死。因此，许多方案包括特殊的生物反应器8、振荡器或微流体系统15。这些设备可能需要大量昂贵的细胞培养基。此外，这种设备的成本通常很高。一些生物反应器由许多机械部件组成，使其难以灭菌以重复使用。

大多数方案都受到"批处理效应"16的影响，这在从相同的iPSC获得的类器官之间产生了显着的变异性。这种变异性阻碍了需要一致性的药物测试或临床前研究。类器官的高产量足以选择大小均匀的类器官，可以部分解决这个问题。

时间因素也是一个重大问题。Matsui等人（2018）表明，脑类器官至少需要六个月才能达到成熟17。Trujillo等人（2019）还证明，只有在培养六个月后，类器官中才会发生电生理活性18。由于类器官成熟时间长，研究人员经常在完成前一个分化之前启动新的分化。多个并行的差异化过程需要额外的费用、设备和实验室空间。

我们最近开发了一种迷你生物反应器，主要解决了上述问题19。这款自制生物反应器由超低附着力或未经处理的培养皿组成，中间有一个塑料旋钮。这种塑料旋钮可防止类器官拥挤及其在培养皿中心的凝结，这是由振荡器的旋转引起的。本文描述了这种廉价而简单的自制迷你生物反应器如何能够大量产生高质量的脑类器官。

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

研究方案

注意:在整个方案中使用无菌技术，不包括步骤1.2和1.3。在应用于细胞或类器官之前，将所有培养基和溶液加热至37°C。在37°C的CO2 培养箱中培养细胞，在80%湿度下在5%CO2 中培养细胞。协议方案如图 1所示。

1. 将培养皿转变为微型生物反应器

  1. 将无菌的15 mL离心管切割成7-8毫米高的环;高压灭菌环。
  2. 将低附着力、未经处理或微生物培养皿分解成碎屑。将约1克塑料屑溶解在10毫升氯仿中过夜，以制备液体塑料。
    注意:在通风橱中工作。
  3. 检查得到的液体塑料是否足够粘稠，可以移液;它的液滴保持球形，不会在表面上扩散。如果非常液体，请添加更多的塑料屑。如果很厚，则加入氯仿。
  4. 在无菌超低附着力6厘米培养皿的中心制作一个塑料旋钮。有两种同样合适的方法，详见下文。
    1. 将高压灭菌的塑料环放在中心，然后将液体塑料滴到环的内部。
    2. 在没有任何塑料环的情况下，将液体塑料放在培养皿的中心。
  5. 将盘子在层流罩中打开2-3小时，直到干燥完成。用紫外线辐射处理干燥的盘子15-20分钟。

2. 诱导iPSCs的神经元分化

  1. 在预涂有细胞外蛋白质的基质的35毫米培养皿中培养用于多能干细胞的培养基中培养高达75-90%汇合的iPSCs。
  2. 准备介质 A-SR。有关详细信息，请参见表 1。
  3. 吸出培养基，并在分化的第0天加入2mL A-SR培养基。
  4. 准备培养基A（见表2）。
  5. 从第2-14天开始，在培养基A中培养细胞两周，每隔一天在培养皿中刷新培养基。

3. 第14天神经上皮前体细胞球状体的形成

  1. 在第14天，使用特殊的24孔培养板从神经上皮前体细胞中制造球状体，每个孔中含有约1，200个微孔（图2C）。请按照下面给出的步骤操作。
    注意:在这个分化阶段，35毫米培养皿通常含有3 - 3.5 x 106 个神经上皮前体细胞。因此，一个带有神经上皮前体细胞的35mm培养皿足以用于3-4孔具有微孔的24孔培养板。
  2. 准备一个带有微孔的24孔培养板:向每个孔中加入1mL培养基A.在装有板架的摆动桶转子中以1，300×g短暂离心5分钟。 在显微镜下控制微孔中没有气泡。
  3. 制备培养基B（表3）。
  4. 用神经上皮前体细胞从培养皿中取出培养基;用2 mL DMEM / F12洗涤细胞。对于细胞脱离，用PBS制备的1.5mL0.48mM EDTA溶液处理细胞。在显微镜下控制细胞脱离。
  5. 将细胞收集到15 mL管中。在试管中加入5mL DMEM / F12以洗涤细胞。以200×g离心5分钟。 除去上清液并将细胞重悬于2mL培养基B中。
  6. 通过台盼蓝染色和血细胞计数器检查细胞浓度和活力。计算总共包含1 x 106 个活细胞所需的悬浮液体积。
  7. 将含有1 x 106个细胞的细胞悬浮液转移到具有微孔的24孔板的每个孔中。将培养基B最多2mL加入每个孔中，轻轻地上下移液细胞几次，然后以100×g短暂离心1分钟以捕获微孔中的细胞。
    注意:每孔的细胞数不应超过1 x 106。否则，来自邻近微孔的球体会融合。
  8. 在显微镜下检查细胞是否均匀分布在微孔中。如果细胞分布不均匀，则重复移液和离心。
  9. 将板孵育过夜，让细胞聚集在球状体中。

4. 获得和培养类器官

  1. 第二天早上（第15天），在显微镜下检查球体的质量。如果健康，请确保它们是透明和光滑的（图2A，B）。小心地将每个孔中的球体收集到15 mL管中，让球体通过重力沉淀2-3分钟，然后除去上清液。
  2. 加入球体2 mL在冰上同时解冻的基质。通过移液轻轻混合，并在室温下孵育30分钟。
  3. 为了洗涤多余的基质，将8mL培养基B.轻轻移液至管中，然后在100×g下离心管1分钟。
    注意:不要超过离心的时间和速度，以避免球体的不可逆聚集。
  4. 除去上清液。将2 mL培养基B加入试管中，轻轻移液。将球状悬浮液在两个迷你生物反应器之间分开，每个生物反应器含有4 mL培养基B.将迷你生物反应器放入15厘米培养皿中，以防止水蒸发并避免污染。
  5. 将带有迷你生物反应器的培养皿放在轨道振荡器上。以70-75rpm的旋转速率培养类器官。
  6. 在第16天，准备培养基C（表4）。
  7. 将类器官转移到15 mL管中。5分钟，让它们落到底部，吸出上清液，加入5毫升培养基C.将类器官返回到迷你生物反应器中。
    注意:注意不要丢失球体，这些球体是透明的，几乎看不见。
  8. 在培养基C中培养球体两周，每两天刷新培养基。在这两周结束时，每个迷你生物反应器留下约100个球体用于以下培养。在液氮冷冻介质中冷冻过量的球体。
  9. 在第30天，准备培养基D（表5）。
  10. 将培养基改为培养基D，这是一种成熟培养基。每2-3天刷新培养基，持续三周，然后使用不含BDNF和GDNF的培养基D。

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

结果

协议方案如图1所示。该协议包括五种培养基，其中iPSCs在至少一个月内分化为脑类器官。开始分化，然后iPSCs达到75-90%的汇合度（图2A，B）。在培养基A中iPSC培养的第10-11天观察到向神经元分化的最初迹象，当时细胞开始聚集成"玫瑰花"（图2C）。在第14-15天，iPSCs分化为神经上皮祖细胞。99%的细胞在神经上皮标志物SOX1?...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

讨论

所描述的方案有两个关键步骤，允许产生大小均匀的高质量类器官。首先，类器官从在细胞数量和细胞成熟度上几乎相同的球体生长。其次，自制的生物反应器为每个类器官提供了一个统一的环境，在这个环境中，类器官不会聚集或粘在一起。

细胞质量和细胞成熟状态对于执行实验方案至关重要。在iPSC汇合75-90%处开始神经元分化至关重要。如果细胞密度太低，iPSC可以分化成...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

披露声明

作者没有什么可透露的。

致谢

这项工作得到了俄罗斯联邦科学和高等教育部（RT-PCR分析）的075-15-2019-1669赠款以及俄罗斯科学基金会第19-15-00425号赠款（用于所有其他工作）的支持。作者还感谢Pavel Belikov在视频编辑方面的帮助。手稿中的人物是用 BioRender.com 创作的。

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

材料

NameCompanyCatalog NumberComments
Advanced DMEM/F-12Gibco12634010DMEM/F-12
AggreWell400STEMCELL Technologies Inc3442524-well culture plate with microwells
B-27 SupplementGibco17504044Neuronal supplement B
GlutaMAX SupplementGibco35050061200 mM L-alanyl-L-glutamine
Human BDNFMiltenyi Biotec130-096-285
Human FGF-2Miltenyi Biotec130-093-839
Human GDNFMiltenyi Biotec130-096-290
KnockOut Serum ReplacementGibco10828028Serum replacement
mTESR1STEMCELL Technologies Inc85850Pliripotent stem cell medium
N2 SupplementGibco17502001
Neurobasal MediumGibco21103049Basal medium for neuronal cell maintenance
Penicillin-Streptomycin SolutionGibco15140130
PlasmocinInvivoGenant-mpt-1Antimicrobials
PurmorphamineEMD Millipore540220
StemMACS Y27632Miltenyi Biotec130-106-538Y27632
StemMACS DorsomorphinMiltenyi Biotec130-104-466Dorsomorphin
StemMACS LDN-193189Miltenyi Biotec130-106-540LDN-193189
StemMACS SB431542Miltenyi Biotec130-106-543SB431542
Trypan Blue SolutionGibco15250061
Versen solutionGibco150400660.48 mM EDTA in PBS
β-mercaptoethanolGibco31350010

参考文献

  1. Marchetto, M. C., Winner, B., Gage, F. H. Pluripotent stem cells in neurodegenerative and neurodevelopmental diseases. Human Molecular Genetics. 19, 71-76 (2010).
  2. Lee, C. T., Bendriem, R. M., Wu, W. W., Shen, R. F. 3D brain Organoids derived from pluripotent stem cells: promising experimental models for brain development and neurodegenerative disorders. Journal of Biomedical Science. 24 (1), 1-12 (2017).
  3. Kadoshima, T., et al. Self-organization of axial polarity, inside out layer pattern, and species-specific progenitor dynamics in human ES cell-derived neocortex. Proceedings of the National Academy of Sciences U.S.A. 110 (50), 20284(2013).
  4. Lancaster, M. A., et al. Cerebral organoids model human brain development and microcephaly. Nature. 501 (7467), 373-379 (2013).
  5. Xiang, Y., et al. Fusion of regionally specified hPSC derived organoids models human brain development and interneuron migration. Cell Stem Cell. 21, 383-398 (2017).
  6. Muguruma, K., Nishiyama, A., Kawakami, H., Hashimoto, K., Sasai, Y. Self-organization of polarized cerebellar tissue in 3D culture of human pluripotent stem cells. Cell Reports. 10 (4), 537-550 (2015).
  7. Qian, X., et al. Brain region specific organoids using mini bioreactors for modeling ZIKV exposure. Cell. 165 (5), 1238-1254 (2016).
  8. Qian, X., et al. Generation of human brain region specific organoids using a miniaturized spinning bioreactor. Nature Protocols. 13 (3), 565-580 (2018).
  9. Jo, J., et al. Midbrain like organoids from human pluripotent stem cells contain functional dopaminergic and neuro melanin producing neurons. Cell Stem Cell. 19 (2), 248-257 (2016).
  10. Sakaguchi, H., et al. Generation of functional hippocampal neurons from self-organizing human embryonic stem cell derived dorsomedial telencephalic tissue. Nature Communication. 6 (1), 8896(2015).
  11. Di Lullo, E., Kriegstein, A. R. The use of brain organoids to investigate neural development and disease. Nature Reviews Neuroscience. 18 (10), 573-584 (2017).
  12. Chen, K. G., et al. Pluripotent stem cell platforms for drug discovery. Trends in Molecular Medicine. 24 (9), 805-820 (2018).
  13. Dang, J., et al. Zika virus depletes neural progenitors in human cerebral organoids through activation of the innate immune receptor TLR3. Cell Stem Cell. 19 (2), 258-265 (2016).
  14. Tiwari, S. K., Wang, S., Smith, D., Carlin, A. F., Rana, T. M. Revealing tissue-specific SARS-CoV-2 infection and host responses using human stem cell-derived lung and cerebral organoids. Stem Cell Reports. 16 (3), 437-445 (2021).
  15. Ao, Z., et al. One-stop microfluidic assembly of human brain organoids to model prenatal cannabis exposure. Analytical Chemistry. 92 (6), 4630-4638 (2020).
  16. Di Nardo, P., Parker, G. C. Stem cell standardization. Stem Cells Development. 20 (3), 375-377 (2011).
  17. Jo, J., Xiao, Y., et al. Midbrain like organoids from human pluripotent stem cells contain functional dopaminergic and neuro melanin producing neurons. Cell Stem Cell. 19 (2), 248-257 (2016).
  18. Matsui, T. K., et al. Six-month cultured cerebral organoids from human ES cells contain matured neural cells. Neuroscience Letters. 670, 75-82 (2018).
  19. Trujillo, C. A., et al. Complex oscillatory waves emerging from cortical organoids model early human brain network development. Cell Stem Cell. 25 (4), 558-569 (2019).
  20. Eremeev, A. V., et al. Necessity Is the mother of invention” or inexpensive, reliable, and reproducible protocol for generating organoids. Biochemistry (Moscow). 84 (3), 321-328 (2019).
  21. Qian, X., et al. Generation of human brain region–specific organoids using a miniaturized spinning bioreactor. Nature Protocols. 13, 565-580 (2018).
  22. Matsui, T. K., Tsuru, Y., Hasegawa, K., Kuwako, K. I. Vascularization of human brain organoids. Stem Cells. 39 (8), 1017-1024 (2021).
  23. Hall, G. N., et al. Patterned, organoid-based cartilaginous implants exhibit zone specific functionality forming osteochondral-like tissues in vivo. Biomaterials. 273, 120820(2021).
  24. Zachos, N. C., et al. Human enteroids/colonoids and intestinal organoids functionally recapitulate normal intestinal physiology and pathophysiology. Journal of Biological Chemistry. 291, 3759-3766 (2016).
  25. Eremeev, A., et al. Cerebral organoids—challenges to establish a brain prototype. Cells. 10 (7), 1790(2021).
  26. Kadoshima, T., et al. Self-organization of axial polarity, inside-out layer pattern, and species-specific progenitor dynamics in human ES Cell-derived neocortex. Proceedings of the National Academy of Sciences U. S. A. 110, 20284-20289 (2013).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

转载和许可

请求许可使用此 JoVE 文章的文本或图形

请求许可

探索更多文章

178

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

政策

使用条款

隐私

联系我们

向图书馆推荐

JoVE 新闻简报

科研

教育

发表

图书馆员

关于 JoVE

版权所属 © 2025 MyJoVE 公司版权所有，本公司不涉及任何医疗业务和医疗服务。