Генерация органоидов мозга из индуцированных плюрипотентных стволовых клеток в самодельных мини-биореакторах

Резюме

Здесь мы описываем протокол генерации органоидов мозга из индуцированных человеком плюрипотентных стволовых клеток (IPSCs). Для получения органоидов головного мозга в больших количествах и высокого качества мы используем самодельные мини-биореакторы.

Аннотация

Органоид мозга, полученный из iPSC, является перспективной технологией для моделирования in vitro патологий нервной системы и скрининга лекарств. Эта технология появилась недавно. Он все еще находится в зачаточном зачаточном начале и имеет некоторые ограничения, которые еще не решены. Существующие протоколы не позволяют получить органоиды, чтобы быть достаточно последовательными для открытия лекарств и доклинических исследований. Созревание органоидов может занять до года, подталкивая исследователей к запуску нескольких процессов дифференцировки одновременно. Это налагает дополнительные расходы на лабораторию с точки зрения площади и оборудования. Кроме того, органоиды головного мозга часто имеют некротическую зону в центре, которая страдает от дефицита питательных веществ и кислорода. Следовательно, большинство современных протоколов используют циркулирующую систему для культивирования среды для улучшения питания.

Между тем, не существует недорогих динамических систем или биореакторов для культивирования органоидов. В этой статье описывается протокол производства органоидов головного мозга в компактных и недорогих самодельных мини-биореакторах. Этот протокол позволяет получать высококачественные органоиды в больших количествах.

Введение

Модели, полученные из iPSC человека, широко используются в исследованиях нейроразвития и нейродегенеративных расстройств¹. За последнее десятилетие 3D-модели мозговой ткани, так называемые органоиды мозга, существенно дополнили традиционные 2D-нейронные культуры^2. Органоиды в некоторой степени повторяют 3D-архитектуру эмбрионального мозга и позволяют более точно моделировать. Опубликовано много протоколов для генерации органоидов, представляющих различные области мозга: кора головного мозга^3,4,5,мозжечок^6,средний мозг, передний мозг, гипоталамус^7,8,9и гиппокамп^10. Было несколько примеров использования органоидов для изучения заболеваний нервной системы человека^11. Также органоиды были внедрены в лекарственные открытия¹² и использованы в исследованиях инфекционных заболеваний, в том числе SARS-Cov-2^13,14.

Органоиды головного мозга могут достигать до нескольких миллиметров в диаметре. Так, внутренняя зона органоида может страдать от гипоксии или неправильного питания и со временем становиться некротической. Поэтому многие протоколы включают специальные биореакторы^8,шейкеры или микрофлюидные системы^15. Эти устройства могут потребовать больших объемов дорогостоящих клеточных культур. Также стоимость такого оборудования обычно высока. Некоторые биореакторы состоят из множества механических частей, которые затрудняют их стерилизацию для повторного использования.

Большинство протоколов страдают от «пакетного эффекта»^16,который порождает значительную вариабельность среди органоидов, полученных из идентичных ИПСК. Эта изменчивость препятствует тестированию лекарств или доклиническим исследованиям, требующим единообразия. Высокий выход органоидов, достаточный для выбора органоидов однородного размера, может частично решить эту проблему.

Фактор времени также является существенной проблемой. Matsui et al. (2018) показали, что органоидам мозга требуется не менее шести месяцев, чтобы достичь зрелости^17. Trujillo et al. (2019) также продемонстрировали, что электрофизиологическая активность возникала у органоидов только после шести месяцев культивирования^18. Из-за длительного времени созревания органоидов исследователи часто запускают новую дифференциацию до завершения предыдущей. Множественные параллельные процессы дифференциации требуют дополнительных затрат, оборудования и лабораторного пространства.

Недавно мы разработали мини-биореактор, который в основном решает проблемы, упомянутые выше^19. Этот самодельный биореактор состоит из сверхнизкой адгезии или необработанная чашка Петри с пластиковой ручкой в центре. Эта пластиковая ручка предотвращает скопление органоидов и их смешение в центре чашки Петри, что вызвано вращением шейкер. В данной работе описано, как этот недорогой и простой самодельный мини-биореактор позволяет генерировать высококачественные органоиды мозга в больших количествах.

протокол

ПРИМЕЧАНИЕ: Используйте стерильный метод во всем протоколе, исключая этапы 1.2 и 1.3. Прогрейте все культуральные среды и растворы до 37 °C перед нанесением на клетки или органоиды. Культивируйте клетки в инкубаторе_CO2 при 37 °C при 5% CO₂ при влажности 80%. Схема протокола показана на рисунке 1.

1. Превращение чашек Петри в мини-биореакторы

1. Нарезать стерильные 15 мл центрифужные трубки в кольца высотой 7-8 мм; автоклав колец.
2. Разбейте низкоадгезионные, необработанные или микробиологические чашки Петри на крошки. Растворите около 1 г пластиковой крошки в 10 мл хлороформа на ночь для приготовления жидкого пластика.
   ВНИМАНИЕ: Работайте в вытяжном капюшоне.
3. Убедитесь, что полученный жидкий пластик достаточно вязкий для пипетки; его капля сохраняет сферическую форму и не распространяется по поверхности. Если он очень жидкий, добавьте больше пластиковых крошек. Если он густой, то добавляют хлороформ.
4. Сделайте пластиковую ручку в центре стерильной сверхнизкой адгезии 6-сантиметровой чашки Петри. Есть два одинаково подходящих способа, как подробно описано ниже.
   1. Поместите автоклавное пластиковое кольцо по центру и опустите жидкий пластик внутрь кольца.
   2. Без пластикового кольца опустите жидкий пластик на центр чашки Петри.
5. Оставьте посуду открытой на 2-3 ч в ламинарном проточном вытяжке до полного высыхания. Обработать высушенную посуду ультрафиолетовым излучением в течение 15-20 мин.

2. Индукция нейронной дифференцировки ИПСК

1. Культивируют иПСК в среде для плюрипотентных стволовых клеток до 75-90% слияния в 35 мм чашках Петри, предварительно покрытых матрицей, состоящей из внеклеточных белков.
2. Готовят среду A-SR. Подробную информацию см. в таблице 1.
3. Аспирировать питательную среду и добавить 2 мл среды A-SR на 0-й день дифференцировки.
4. Подготовьте носитель А (см. табл. 2).
5. Культивируют клетки в среде А в течение двух недель со 2-14 дней, освежая среду в чашках Петри через день.

3. Образование сфероидов из нейроэпителиальных клеток-предшественников на 14 день

1. На 14-й день делают сфероиды из нейроэпителиальных клеток-предшественников, используя специальную 24-скважинную культуральную пластину, содержащую примерно 1 200 микроядер в каждой скважине(рисунок 2C). Следуйте процедуре, приведенной ниже.
   ПРИМЕЧАНИЕ: На этой стадии дифференцировки чашка Петри размером 35 мм обычно содержит 3 - 3,5 х 10⁶ нейроэпителиальных клеток-предшественников. Таким образом, одной 35-миллиметровой чашки Петри с нейроэпителиальными клетками-предшественниками достаточно для 3 - 4 скважин 24-скважинной культуральной пластины с микроэлементами.
2. Подготовьте 24-скважинную культурную пластину с микролунками: к каждой скважине добавьте 1 мл среды А. Центрифуга ненадолго при 1 300 х г в течение 5 мин в качающемся роторе ковша, оснащенном держателем пластины. Контролируйте под микроскопом, чтобы в микровеллах не было пузырьков.
3. Готовят среду В(таблица 3).
4. Удалить среду из чашки Петри с нейроэпителиальными клетками-предшественниками; промыть ячейки 2 мл DMEM/F12. Для отслоения клеток обработать клетки 1,5 мл раствора ЭДТА 0,48 мМ, приготовленным в PBS. Контролируйте отсоединение клеток под микроскопом.
5. Соберите клетки в трубку 15 мл. Добавьте 5 мл DMEM/F12 в пробирку для промывки клеток. Центрифуга при 200 х г в течение 5 мин. Удаляют супернатант и повторно суспендировали клетки в 2 мл среды В.
6. Проверьте концентрацию и жизнеспособность клеток с помощью окрашивания Trypan Blue и гемоцитометра. Рассчитайте объем суспензии, необходимый для содержания 1 х 10⁶ жизнеспособных клеток в общей сложности.
7. Перенесите клеточную суспензию, содержащую 1^{х 10 6} клеток, в каждую скважину 24-скважинной пластины с микроэлементами. Добавьте среду B до 2 мл в каждую скважину, аккуратно пипетку клеток вверх и вниз несколько раз и центрифугируйте ненадолго 100 х г в течение 1 мин для захвата клеток в микролунках.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Количество ячеек в скважине не должно превышать 1 х 10^6. В противном случае сфероиды из соседних микроуровнях сливаются.
8. Проверьте под микроскопом, что клетки равномерно распределены в микрозвеллах. Повторите пипетку и центрифугирование, если ячейки распределены неравномерно.
9. Инкубируйте пластину в течение ночи, чтобы позволить клеткам объединяться в сфероиды.

4. Получение и культивирование органоидов

1. На следующее утро (день 15) проверьте качество сфероидов под микроскопом. Убедитесь, что они прозрачные и гладкие, если они здоровы(рисунок 2A,B). Осторожно соберите сфероиды из каждой лунки в трубку 15 мл, оставьте сфероиды выпадать в осадок под действием силы тяжести в течение 2-3 мин, а затем удалите супернатант.
2. Добавьте к сфероидам 2 мл матрицы, размороженные за это же время на льду. Аккуратно перемешать путем пипетки и инкубировать при комнатной температуре в течение 30 мин.
3. Для промывания избытка матрицы добавляют в пробирку 8 мл среды Б. Пипетку аккуратно, затем центрифугируют трубку в течение 1 мин при 100 х г.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Не превышайте время и скорость центрифугирования, чтобы избежать необратимой агрегации сфероидов.
4. Удалите супернатант. Добавьте в туба 2 мл среды В, аккуратно пипетку. Разделите сфероидную суспензию между двумя мини-биореакторами, каждый из которых содержит 4 мл среды B. Поместите мини-биореакторы в чашку Петри 15 см, чтобы предотвратить испарение воды и избежать загрязнения.
5. Поставьте чашку Петри с мини-биореакторами на орбитальный шейкер. Культивируют органоиды со скоростью вращения 70-75 об/мин.
6. На 16 день приготовьте среду С(табл. 4).
7. Перенесите органоиды в трубку 15 мл. В течение 5 мин дайте им упасть на дно, аспирировать супернатант, добавить 5 мл среды С. Верните органоиды в мини-биореакторы.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Будьте осторожны, чтобы не потерять сфероиды, которые прозрачны и едва заметны.
8. Культивируйте сфероиды в среде С в течение двух недель, освежая среду каждые два дня. В конце этих двух недель оставьте около 100 сфероидов на мини-биореактор для последующего культивирования. Заморозьте избыточные сфероиды в морозильной среде в жидком азоте.
9. На 30 день приготовьте среду D(табл. 5).
10. Измените среду культивации на среду D, которая является средой созревания. Обновляйте культивирование среды каждые 2-3 дня в течение трех недель, затем используйте среду D без BDNF и GDNF.

Результаты

Схема протокола показана на рисунке 1. Протокол включал пять сред, в которых IPSCs дифференцировались на органоиды мозга в течение как минимум одного месяца. Дифференциация была начата, после чего ИПСК достигли 75-90% слияния(Рисунок 2А,В). Первые приз...

Обсуждение

Описанный протокол имеет два важных этапа, позволяющих генерацию высококачественных органоидов одинакового размера. Во-первых, органоиды растут из сфероидов, которые почти идентичны по количеству клеток и зрелости клеток. Во-вторых, самодельные биореакторы обеспечивают каждому орга?...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
Advanced DMEM/F-12	Gibco	12634010	DMEM/F-12
AggreWell400	STEMCELL Technologies Inc	34425	24-well culture plate with microwells
B-27 Supplement	Gibco	17504044	Neuronal supplement B
GlutaMAX Supplement	Gibco	35050061	200 mM L-alanyl-L-glutamine
Human BDNF	Miltenyi Biotec	130-096-285
Human FGF-2	Miltenyi Biotec	130-093-839
Human GDNF	Miltenyi Biotec	130-096-290
KnockOut Serum Replacement	Gibco	10828028	Serum replacement
mTESR1	STEMCELL Technologies Inc	85850	Pliripotent stem cell medium
N2 Supplement	Gibco	17502001
Neurobasal Medium	Gibco	21103049	Basal medium for neuronal cell maintenance
Penicillin-Streptomycin Solution	Gibco	15140130
Plasmocin	InvivoGen	ant-mpt-1	Antimicrobials
Purmorphamine	EMD Millipore	540220
StemMACS Y27632	Miltenyi Biotec	130-106-538	Y27632
StemMACS Dorsomorphin	Miltenyi Biotec	130-104-466	Dorsomorphin
StemMACS LDN-193189	Miltenyi Biotec	130-106-540	LDN-193189
StemMACS SB431542	Miltenyi Biotec	130-106-543	SB431542
Trypan Blue Solution	Gibco	15250061
Versen solution	Gibco	15040066	0.48 mM EDTA in PBS
β-mercaptoethanol	Gibco	31350010