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  • Resumen
  • Resumen
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  • Protocolo
  • Resultados
  • Discusión
  • Divulgaciones
  • Agradecimientos
  • Materiales
  • Referencias
  • Reimpresiones y Permisos

Resumen

Aquí describimos un protocolo para generar organoides cerebrales a partir de células madre pluripotentes inducidas por humanos (iPSC). Para obtener organoides cerebrales en grandes cantidades y de alta calidad, utilizamos mini biorreactores caseros.

Resumen

El organoide cerebral derivado de iPSC es una tecnología prometedora para el modelado in vitro de las patologías del sistema nervioso y el cribado de fármacos. Esta tecnología ha surgido recientemente. Todavía está en su infancia y tiene algunas limitaciones aún sin resolver. Los protocolos actuales no permiten que la obtención de organoides sea lo suficientemente consistente para el descubrimiento de fármacos y estudios preclínicos. La maduración de los organoides puede tardar hasta un año, lo que empuja a los investigadores a lanzar múltiples procesos de diferenciación simultáneamente. Impone costos adicionales para el laboratorio en términos de espacio y equipo. Además, los organoides cerebrales a menudo tienen una zona necrótica en el centro, que sufre de deficiencia de nutrientes y oxígeno. Por lo tanto, la mayoría de los protocolos actuales utilizan un sistema circulante para el medio de cultivo para mejorar la nutrición.

Mientras tanto, no hay sistemas dinámicos baratos o biorreactores para el cultivo de organoides. Este artículo describe un protocolo para producir organoides cerebrales en mini biorreactores caseros compactos y económicos. Este protocolo permite obtener organoides de alta calidad en grandes cantidades.

Introducción

Los modelos derivados de iPSC humanos son ampliamente utilizados en los estudios de trastornos del neurodesarrollo y neurodegenerativos1. Durante la última década, los modelos de tejido cerebral en 3D, los llamados organoides cerebrales, complementaron esencialmente los cultivos neuronales 2D tradicionales2. Los organoides recapitulan en cierta medida la arquitectura 3D del cerebro embrionario y permiten un modelado más preciso. Se publican muchos protocolos para la generación de organoides que representan diferentes regiones cerebrales: corteza cerebral3,4,5,cerebelo6,mesencéfalo, prosencéfalo, hipotálamo7,8,9e hipocampo10. Ha habido múltiples ejemplos de uso de organoides para estudiar enfermedades del sistema nervioso humano11. Además, los organoides se implementaron en descubrimientos de fármacos12 y se utilizaron en estudios de enfermedades infecciosas, incluido el SARS-Cov-213,14.

Los organoides cerebrales pueden alcanzar hasta varios milímetros de diámetro. Por lo tanto, la zona interna del organoide puede sufrir de hipoxia o desnutrición y eventualmente volverse necrótica. Por lo tanto, muchos protocolos incluyen biorreactores especiales8,agitadores o sistemas microfluídicos15. Estos dispositivos pueden requerir grandes volúmenes de costosos medios de cultivo celular. Además, el costo de dicho equipo suele ser alto. Algunos biorreactores consisten en muchas partes mecánicas que los hacen difíciles de esterilizar para su reutilización.

La mayoría de los protocolos sufren el "efecto lote"16,que genera una variabilidad significativa entre los organoides obtenidos de las iPSC idénticas. Esta variabilidad dificulta las pruebas de drogas o los estudios preclínicos que requieren uniformidad. El alto rendimiento de organoides suficiente para seleccionar organoides de tamaño uniforme puede resolver parcialmente este problema.

El factor tiempo también es un problema importante. Matsui et al. (2018) demostraron que los organoides cerebrales requieren al menos seis meses para alcanzar la madurez17. Trujillo et al. (2019) también demostraron que la actividad electrofisiológica ocurrió en organoides solo después de seis meses de cultivo18. Debido al largo tiempo de maduración de los organoides, los investigadores a menudo lanzan una nueva diferenciación antes de completar la anterior. Múltiples procesos paralelos de diferenciación requieren gastos adicionales, equipos y espacio de laboratorio.

Recientemente hemos desarrollado un mini biorreactor que resuelve principalmente los problemas mencionados anteriormente19. Este biorreactor casero consiste en una placa de Petri de adhesión ultra baja o sin tratar con una perilla de plástico en el centro. Esta perilla de plástico evita el apiñamiento de organoides y su conglutinación en el centro de la placa de Petri, que es causada por la rotación del agitador. Este artículo describe cómo este mini biorreactor casero económico y simple permite generar organoides cerebrales de alta calidad en grandes cantidades.

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Protocolo

NOTA: Utilice la técnica estéril en todo el protocolo, excluyendo los pasos 1.2 y 1.3. Calentar todos los medios de cultivo y soluciones a 37 °C antes de aplicar sobre células u organoides. Cultive células en una incubadora de CO2 a 37 °C en 5% de CO2 sobre 80% de humedad. El esquema de protocolo se muestra en la Figura 1.

1. Transformación de placas de Petri en mini biorreactores

  1. Cortar tubos centrífugos estériles de 15 ml en anillos de 7-8 mm de altura; autoclave los anillos.
  2. Rompe las placas de Petri de baja adherencia, no tratadas o microbiológicas en migas. Disuelva aproximadamente 1 g de migas de plástico en 10 ml de cloroformo durante la noche para preparar plástico líquido.
    PRECAUCIÓN: Trabaje en una campana extractora de humos.
  3. Verifique que el plástico líquido resultante sea lo suficientemente viscoso para pipetear; su gota conserva una forma esférica y no se propaga en la superficie. Si es muy líquido, añade más migas de plástico. Si es espeso, agregue cloroformo.
  4. Haga una perilla de plástico en el centro de una placa de Petri estéril de 6 cm de adhesión ultra baja. Hay dos formas igualmente adecuadas, como se detalla a continuación.
    1. Coloque el anillo de plástico en autoclave en el centro y deje caer el plástico líquido en el interior del anillo.
    2. Sin ningún anillo de plástico, deje caer el plástico líquido en el centro de la placa de Petri.
  5. Deje los platos abiertos durante 2-3 h en una campana de flujo laminar hasta que se sequen completos. Trate los platos secos con radiación ultravioleta durante 15-20 min.

2. Inducción de la diferenciación neuronal de las iPSCs

  1. Cultivar iPSCs en el medio para células madre pluripotentes hasta un 75-90% de confluencia en placas de Petri de 35 mm precubiertas con una matriz formada por proteínas extracelulares.
  2. Preparar medio A-SR. Consulte la Tabla 1 para obtener más detalles.
  3. Aspirar el medio de cultivo y añadir 2 mL de medio A-SR en el Día 0 de diferenciación.
  4. Preparar el medio A (ver Tabla 2).
  5. Cultive las células en medio A durante dos semanas de los días 2-14, medio refrescante en placas de Petri cada dos días.

3. La formación de esferoides a partir de células precursoras neuroepiteliales en el día 14

  1. En el Día 14, hacer esferoides a partir de células precursoras neuroepiteliales utilizando una placa de cultivo especial de 24 pozos que contiene aproximadamente 1,200 micropios en cada pozo(Figura 2C). Siga el procedimiento que se indica a continuación.
    NOTA: En esta etapa de diferenciación, una placa de Petri de 35 mm generalmente contiene 3 - 3.5 x 106 células precursoras neuroepiteliales. Por lo tanto, una placa de Petri de 35 mm con células precursoras neuroepiteliales es suficiente para 3 - 4 pozos de placa de cultivo de 24 pozos con micropios.
  2. Prepare una placa de cultivo de 24 pozos con micropios: A cada pozo, agregue 1 ml de A mediano. Centrífuga brevemente a 1,300 x g durante 5 minutos en rotor de cucharón oscilante equipado con soporte de placa. Controle bajo el microscopio que no hay burbujas en los microbuzos.
  3. Preparar el medio B (Tabla 3).
  4. Retire el medio de la placa de Petri con células precursoras neuroepiteliales; lavar las células con 2 ml de DMEM/F12. Para el desprendimiento celular, tratar las células con 1,5 ml de solución de EDTA de 0,48 mM preparada en PBS. Controlar el desprendimiento celular bajo el microscopio.
  5. Cosecha las células en un tubo de 15 ml. Agregue 5 ml de DMEM/F12 en el tubo para lavar las células. Centrifugadora a 200 x g durante 5 min. Retire las células sobrenadantes y resuspend en 2 ml de medio B.
  6. Compruebe la concentración celular y la viabilidad mediante la tinción trypan Blue y un hemocitómetro. Calcule el volumen de suspensión necesario para contener 1 x 106 células viables en total.
  7. Transfiera la suspensión celular que contiene 1 x 106 células a cada pozo de una placa de 24 pozos con microagres. Agregue el medio B hasta 2 ml en cada pozo, pipete suavemente las células hacia arriba y hacia abajo varias veces, y centrifugue brevemente 100 x g durante 1 minuto para capturar las células en los micropizos.
    NOTA: El número de celdas por pozo no debe exceder de 1 x 106. De lo contrario, los esferoides de los micronúpulos vecinos se fusionan.
  8. Compruebe bajo el microscopio que las células están distribuidas uniformemente en microburuezos. Repita el pipeteo y la centrifugación si las células se distribuyen de manera desigual.
  9. Incubar la placa durante la noche para permitir que las células se agreguen en esferoides.

4. Obtención y cultivo de organoides

  1. A la mañana siguiente (Día 15), verifique la calidad de los esferoides bajo el microscopio. Asegúrese de que sean transparentes y suaves, si están sanos (Figura 2A,B). Recoja cuidadosamente los esferoides de cada pozo en un tubo de 15 ml, deje que los esferoides precipiten por gravedad durante 2-3 minutos y luego retire el sobrenadante.
  2. Agregue a los esferoides 2 ml de la matriz descongelada durante el mismo tiempo en hielo. Mezclar suavemente mediante pipeteo e incubar a temperatura ambiente durante 30 min.
  3. Para lavar el exceso de la matriz, agregue al tubo 8 ml de medio B. Pipete suavemente, luego centrifugue el tubo durante 1 min a 100 x g.
    NOTA: No exceda el tiempo y la velocidad de centrifugación para evitar la agregación irreversible de esferoides.
  4. Retire el sobrenadante. Añadir al tubo 2 mL de B medio, pipetear suavemente. Divida la suspensión de esferoides entre dos mini biorreactores, cada uno con 4 ml de medio B. Coloque los mini biorreactores en una placa de Petri de 15 cm para evitar la evaporación del agua y evitar la contaminación.
  5. Coloque la placa de Petri con mini biorreactores en un agitador orbital. Cultive los organoides a una velocidad de rotación de 70-75 rpm.
  6. El día 16, preparar el medio C (Tabla 4).
  7. Transfiera los organoides a un tubo de 15 ml. Durante 5 min, déjelos caer al fondo, aspire el sobrenadante, agregue 5 ml de C medio. Devuelva los organoides a los mini biorreactores.
    NOTA: Tenga cuidado de no perder los esferoides, que son transparentes y apenas visibles.
  8. Cultiva los esferoides en C medio durante dos semanas, refrescando el medio cada dos días. Al final de estas dos semanas, deje unos 100 esferoides por mini biorreactor para el siguiente cultivo. Congelar esferoides excesivos en un medio de congelación en nitrógeno líquido.
  9. El día 30, preparar el medio D (Tabla 5).
  10. Cambie el medio de cultivo al medio D, que es un medio de maduración. Refresque el medio de cultivo cada 2-3 días durante tres semanas, luego use el medio D sin BDNF y GDNF.

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Resultados

El esquema de protocolo se muestra en la Figura 1. El protocolo incluyó cinco medios en los que las iPSC se diferenciaron en organoides cerebrales durante al menos un mes. La diferenciación se inició entonces las iPSC alcanzaron la confluencia del 75-90%(Figura 2A,B). Los primeros signos de diferenciación hacia las neuronas se observaron en los días 10-11 de cultivo de iPSC en el medio A cuando las células comenzaron a agruparse en "roseta...

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Discusión

El protocolo descrito tiene dos pasos cruciales que permiten la generación de organoides de alta calidad de tamaño uniforme. Primero, los organoides crecen a partir de esferoides que son casi idénticos en número de células y madurez celular. En segundo lugar, los biorreactores caseros proporcionan a cada organoide un entorno uniforme, donde los organoides no se amontonan ni se pegan.

La calidad celular y el estado de maduración celular son esenciales para realizar el protocolo. Es fundam...

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Divulgaciones

Los autores no tienen nada que revelar.

Agradecimientos

Este trabajo fue apoyado por la subvención 075-15-2019-1669 del Ministerio de Ciencia y Educación Superior de la Federación de Rusia (análisis RT-PCR) y por la subvención No. 19-15-00425 de la Fundación Rusa de Ciencia (para todos los demás trabajos). Los autores también agradecen a Pavel Belikov por su ayuda con la edición de video. Las figuras en el manuscrito fueron creadas con BioRender.com.

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Materiales

NameCompanyCatalog NumberComments
Advanced DMEM/F-12Gibco12634010DMEM/F-12
AggreWell400STEMCELL Technologies Inc3442524-well culture plate with microwells
B-27 SupplementGibco17504044Neuronal supplement B
GlutaMAX SupplementGibco35050061200 mM L-alanyl-L-glutamine
Human BDNFMiltenyi Biotec130-096-285
Human FGF-2Miltenyi Biotec130-093-839
Human GDNFMiltenyi Biotec130-096-290
KnockOut Serum ReplacementGibco10828028Serum replacement
mTESR1STEMCELL Technologies Inc85850Pliripotent stem cell medium
N2 SupplementGibco17502001
Neurobasal MediumGibco21103049Basal medium for neuronal cell maintenance
Penicillin-Streptomycin SolutionGibco15140130
PlasmocinInvivoGenant-mpt-1Antimicrobials
PurmorphamineEMD Millipore540220
StemMACS Y27632Miltenyi Biotec130-106-538Y27632
StemMACS DorsomorphinMiltenyi Biotec130-104-466Dorsomorphin
StemMACS LDN-193189Miltenyi Biotec130-106-540LDN-193189
StemMACS SB431542Miltenyi Biotec130-106-543SB431542
Trypan Blue SolutionGibco15250061
Versen solutionGibco150400660.48 mM EDTA in PBS
β-mercaptoethanolGibco31350010

Referencias

  1. Marchetto, M. C., Winner, B., Gage, F. H. Pluripotent stem cells in neurodegenerative and neurodevelopmental diseases. Human Molecular Genetics. 19, 71-76 (2010).
  2. Lee, C. T., Bendriem, R. M., Wu, W. W., Shen, R. F. 3D brain Organoids derived from pluripotent stem cells: promising experimental models for brain development and neurodegenerative disorders. Journal of Biomedical Science. 24 (1), 1-12 (2017).
  3. Kadoshima, T., et al. Self-organization of axial polarity, inside out layer pattern, and species-specific progenitor dynamics in human ES cell-derived neocortex. Proceedings of the National Academy of Sciences U.S.A. 110 (50), 20284(2013).
  4. Lancaster, M. A., et al. Cerebral organoids model human brain development and microcephaly. Nature. 501 (7467), 373-379 (2013).
  5. Xiang, Y., et al. Fusion of regionally specified hPSC derived organoids models human brain development and interneuron migration. Cell Stem Cell. 21, 383-398 (2017).
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  8. Qian, X., et al. Generation of human brain region specific organoids using a miniaturized spinning bioreactor. Nature Protocols. 13 (3), 565-580 (2018).
  9. Jo, J., et al. Midbrain like organoids from human pluripotent stem cells contain functional dopaminergic and neuro melanin producing neurons. Cell Stem Cell. 19 (2), 248-257 (2016).
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  12. Chen, K. G., et al. Pluripotent stem cell platforms for drug discovery. Trends in Molecular Medicine. 24 (9), 805-820 (2018).
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  14. Tiwari, S. K., Wang, S., Smith, D., Carlin, A. F., Rana, T. M. Revealing tissue-specific SARS-CoV-2 infection and host responses using human stem cell-derived lung and cerebral organoids. Stem Cell Reports. 16 (3), 437-445 (2021).
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  26. Kadoshima, T., et al. Self-organization of axial polarity, inside-out layer pattern, and species-specific progenitor dynamics in human ES Cell-derived neocortex. Proceedings of the National Academy of Sciences U. S. A. 110, 20284-20289 (2013).

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