Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • תוצאות
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

כאן אנו מתארים פרוטוקול ליצירת אורגנוידים במוח מתאי גזע פלוריפוטנטיים הנגרמים על ידי בני אדם (IPSCs). כדי להשיג אורגנוידים במוח בכמויות גדולות ובאיכות גבוהה, אנו משתמשים ביו-רה-קטרים מיני תוצרת בית.

Abstract

האורגנויד המוחי שמקורו ב- iPSC הוא טכנולוגיה מבטיחה למידול במבחנה של הפתולוגיות של מערכת העצבים והקרנת סמים. טכנולוגיה זו התפתחה לאחרונה. הוא עדיין בחיתוליו ויש לו כמה מגבלות שעדיין לא נפתרו. הפרוטוקולים הנוכחיים אינם מאפשרים להשיג organoids להיות עקבי מספיק לגילוי סמים ומחקרים פרה קליניים. ההתבגרות של organoids יכול לקחת עד שנה, דוחף את החוקרים להשיק תהליכי בידול מרובים בו זמנית. היא מטילה עלויות נוספות עבור המעבדה מבחינת שטח וציוד. בנוסף, אורגנוידים במוח לעתים קרובות יש אזור נמק במרכז, אשר סובל ממחסור בחומרים מזינים וחמצן. לפיכך, רוב הפרוטוקולים הנוכחיים להשתמש במערכת במחזור עבור מדיום תרבות כדי לשפר את התזונה.

בינתיים, אין מערכות דינמיות זולות או bioreactors לטיפוח organoid. מאמר זה מתאר פרוטוקול לייצור אורגנוידים במוח במיני-רה-קטרים ביתיים קומפקטיים וזולים. פרוטוקול זה מאפשר קבלת organoids באיכות גבוהה בכמויות גדולות.

Introduction

מודלים אנושיים נגזר iPSC נמצאים בשימוש נרחב במחקרים של הפרעות נוירו-התפתחותיות ונוירודגנרטיביות1. במהלך העשור האחרון, מודלים של רקמת מוח תלת-ממדית, מה שמכונה organoidsהמוח, השלימו למעשה תרביות עצביות 2D מסורתיות . האורגנוידים מסכמים במידה מסוימת את הארכיטקטורה התת-ממדית של המוח העוברי ומאפשרים מידול מדויק יותר. פרוטוקולים רבים מתפרסמים עבור הדור של organoids המייצגים אזורי מוח שונים: קליפת המוח3,4,5, המוח הקטן6, המוח האמצעי, המוח הקדמי, ההיפותלמוס7,8,9, והיפוקמפוס10. היו דוגמאות רבות לשימוש באורגנוידים כדי לחקור מחלות מערכת העצבים האנושית11. כמו כן, organoids יושמו בתגליות סמים12 ושימש במחקרים של מחלות זיהומיות, כולל SARS-Cov-213,14.

האורגנוידים במוח יכולים להגיע לקוטר של עד כמה מילימטרים. לכן, האזור הפנימי של האורגנויד עלול לסבול מהיפוקסיה או מתת תזונה ובסופו של דבר להפוך לנמק. לכן, פרוטוקולים רבים כוללים bioreactors מיוחדים8, שייקרים, או מערכות microfluidic15. התקנים אלה עשויים לדרוש כמויות גדולות של מדיה יקרה של תרבית תאים. כמו כן, העלות של ציוד כזה היא בדרך כלל גבוהה. כמה bioreactors מורכבים חלקים מכניים רבים שהופכים אותם קשה לעקר לשימוש חוזר.

רוב הפרוטוקולים סובלים "אפקט אצווה"16, אשר מייצר שונות משמעותית בין organoids המתקבלים iPSCs זהה. שונות זו מעכבת בדיקות סמים או מחקרים פרה-קליניים הדורשים אחידות. התשואה הגבוהה של organoids מספיק כדי לבחור organoids בגודל אחיד עשוי לפתור חלקית בעיה זו.

גורם הזמן הוא גם בעיה משמעותית. Matsui ואח ' (2018) הראה כי organoids המוח דורשים לפחות שישה חודשים כדי להגיע לבגרות17. Trujillo ואח ' (2019) גם הוכיח כי פעילות אלקטרופיזיולוגית התרחשה organoids רק לאחר שישה חודשים של טיפוח18. בשל זמן ההתבגרות האורגנויד הארוך, החוקרים לעתים קרובות להשיק בידול חדש לפני השלמת הקודם. תהליכים מקבילים מרובים של בידול דורשים הוצאות נוספות, ציוד ושטח מעבדה.

לאחרונה פיתחנו מיני bioreactor זה פותר בעיקר את הבעיות שהוזכרו לעיל19. ביו-ריאקטור ביתי זה מורכב מהדבקה נמוכה במיוחד או צלחת פטרי לא מטופלת עם ידית פלסטיק במרכז. ידית פלסטיק זו מונעת צפיפות של organoids ואת conglutination שלהם במרכז צלחת פטרי, אשר נגרמת על ידי סיבוב של שייקר. מאמר זה מתאר כיצד ביו-רקטור מיני זול ופשוט תוצרת בית זה מאפשר לייצר אורגנוידים במוח באיכות גבוהה בכמויות גדולות.

Protocol

הערה: השתמש בטכניקה סטרילית לאורך הפרוטוקול, למעט שלבים 1.2 ו- 1.3. לחמם את כל מדיה תרבותית ופתרונות ל 37 °C (7 °F) לפני החלת על תאים או organoids. לטפח תאים באינקובטור CO2 ב 37 °C ב 5% CO2 על 80% לחות. ערכת הפרוטוקול מוצגת באיור 1.

1. הפיכת מנות פטרי למיני ביו-ריאקטורים

  1. לחתוך סטרילי 15 mL צינורות צנטריפוגות בטבעות של 7-8 מ"מ גובה; תבודד את הטבעות באופן אוטומטי.
  2. לשבור דבק נמוך, לא מטופל או מנות פטרי מיקרוביולוגיות לפירורים. ממיסים כ 1 גרם של פירורי פלסטיק ב 10 מ"ל של כלורופורם לילה כדי להכין פלסטיק נוזלי.
    זהירות: תעבדו במכסה המנוע.
  3. בדוק כי הפלסטיק הנוזלי המתקבל הוא צמיג מספיק עבור pipetting; הטיפה שלו שומרת על צורה כדורית ואינה מתפשטת על פני השטח. אם הוא נוזלי מאוד, מוסיפים עוד פירורי פלסטיק. אם הוא עבה, ואז להוסיף כלורופורם.
  4. הכינו ידית פלסטיק במרכז צלחת פטרי סטרילית אולטרה-נמוכה 6 ס"מ. ישנן שתי דרכים מתאימות באותה מידה, כמפורט להלן.
    1. שים את טבעת הפלסטיק autoclaved על המרכז ושחרר את הפלסטיק הנוזלי לחלק הפנימי של הטבעת.
    2. ללא טבעת פלסטיק, זרוק את הפלסטיק הנוזלי על מרכז צלחת פטרי.
  5. משאירים את הכלים פתוחים במשך 2-3 שעות במכסה זרימה למינאר עד התייבשות מלאה. לטפל את הכלים היבשים עם קרינה אולטרה סגולה במשך 15-20 דקות.

2. אינדוקציה של בידול עצבי של IPSCs

  1. לטפח iPSCs במדיום עבור תאי גזע pluripotent עד 75-90% מפגש ב 35 מ"מ פטרי מנות מראש עם מטריצה המורכב חלבונים חוץ תאיים.
  2. הכן בינוני A-SR. ראה טבלה 1 לקבלת פרטים.
  3. שאפו את מדיום הטיפוח והוסיפו 2 מ"ל של מדיום A-SR ביום 0 של בידול.
  4. הכן בינוני A (ראה טבלה 2).
  5. לטפח תאים בינוני A במשך שבועיים בימים 2-14, מדיום מרענן במנות פטרי כל יומיים.

3. היווצרות של כדורי מתאי הקדמה נוירו-אפיתל ביום 14

  1. ביום ה-14, הכינו כדוריות מתאי מבשר נוירו-אפיתל באמצעות לוחית תרבית מיוחדת בת 24 בארות המכילה כ-1,200 מיקרווולים בכל באר(איור 2C). בצע את ההליך שניתן להלן.
    הערה: בשלב זה בידול, צלחת פטרי 35 מ"מ בדרך כלל מכיל 3 - 3.5 x 106 תאי מבשר נוירו-אפיטליאלי. לכן, צלחת פטרי אחת 35 מ"מ עם תאים מקדימים neuroepithelial מספיק עבור 3 - 4 בארות של צלחת תרבית 24-well עם microwells.
  2. הכן צלחת תרבית 24-well עם microwells: לכל באר, להוסיף 1 מ"ל של בינוני A. צנטריפוגה לזמן קצר ב 1,300 x g במשך 5 דקות רוטור דלי מתנדנד מצויד מחזיק צלחת. שליטה מתחת למיקרוסקופ שאין בועות במיקרווולים.
  3. הכן את ה- B הבינוני (טבלה 3).
  4. הסר את המדיום מצלחת פטרי עם תאים מקדימים neuroepithelial; לשטוף את התאים עם 2 מ"ל של DMEM / F12. עבור ניתוק התא, לטפל בתאים עם 1.5 מ"ל של פתרון EDTA 0.48 mM מוכן PBS. שלוט בניתוק התא מתחת למיקרוסקופ.
  5. לקצור את התאים לתוך צינור 15 מ"ל. הוסף 5 מ"ל של DMEM / F12 בצינור כדי לשטוף את התאים. צנטריפוגה ב 200 x g במשך 5 דקות. הסר את תאי supernatant ו resuspend ב 2 מ"ל של B בינוני.
  6. בדוק את ריכוז התא ואת הכדאיות על ידי טריפן כחול כתמים המוציטומטר. חשב את נפח ההשעיה הדרוש כדי להכיל 1 x 106 תאים קיימא בסך הכל.
  7. העבר את ההשעיה התא המכיל 1 x 106 תאים לתוך כל באר של צלחת 24-well עם microwells. הוסף B בינוני עד 2 מ"ל לתוך כל באר, בעדינות pipette תאים למעלה ולמטה מספר פעמים, וצנטריפוגה לזמן קצר 100 x g במשך 1 דקות כדי ללכוד תאים ב microwells.
    הערה: מספר התאים לבאר לא יעלה על 1 x 106. אחרת, כדורי ספירואידים ממיקרווולים שכנים מתמזגים.
  8. בדוק מתחת למיקרוסקופ שהתאים מופצים באופן שווה במיקרווולים. חזור על צנרת וצנטריפוגה אם התאים מופצים בצורה לא אחידה.
  9. לדגור את הצלחת בן לילה כדי לאפשר לתאים להצטבר בפרואידים.

4. השגת וטיפוח של organoids

  1. למחרת בבוקר (יום 15), לבדוק את איכות כדורי מתחת למיקרוסקופ. ודא שהם שקופים וחלקים, אם בריאים(איור 2A,B). בזהירות לאסוף את כדורי מכל באר לתוך צינור 15 מ"ל, להשאיר את כדורי לזרז על ידי כוח המשיכה במשך 2-3 דקות, ולאחר מכן להסיר את supernatant.
  2. מוסיפים לספרואידים 2 מ"ל של המטריצה שהופשרה באותו הזמן על קרח. מערבבים בעדינות על ידי צנרת ודגרה בטמפרטורת החדר במשך 30 דקות.
  3. כדי לשטוף עודף של המטריצה, להוסיף לצינור 8 מ"ל של בינוני B. Pipette בעדינות, ולאחר מכן צנטריפוגה הצינור במשך 1 דקות ב 100 x גרם.
    הערה: אל תחרגו מהזמן והמהירות של צנטריפוגה כדי למנוע צבירה בלתי הפיכה של כדוריות.
  4. הסר את סופר-טבעי. מוסיפים לצינור 2 מ"ל של B בינוני, פיפטה בעדינות. לפצל את ההשעיה כדורית בין שני bioreactors מיני, כל אחד המכיל 4 מ"ל של בינוני B. מניחים את bioreactors מיני לתוך צלחת פטרי 15 ס"מ כדי למנוע אידוי של מים כדי למנוע זיהום.
  5. שים את צלחת פטרי עם bioreactors מיני על שייקר מסלולית. לטפח את organoids בקצב סיבוב של 70-75 סל"ד.
  6. ביום ה -16, להכין בינוני C(טבלה 4).
  7. מעבירים את האורגנוידים לצינור 15 מ"ל. במשך 5 דקות, תן להם ליפול לתחתית, לשאוף supernatant, להוסיף 5 מ"ל של C בינוני. להחזיר את organoids לתוך bioreactors מיני.
    הערה: היזהר לא לאבד את כדורי, אשר שקופים ובקושי גלויים.
  8. מטפחים כדוריות בגודל C בינוני במשך שבועיים, מרעננים את המדיום כל יומיים. בסוף השבועיים האלה, השאירו כ-100 כדורי ספירה למיני ביו-ריאקטור לטיפוח הבא. להקפיא כדוריות מוגזמות במדיום קפוא בחנקן נוזלי.
  9. ביום 30, הכן בינוני D(טבלה 5).
  10. שנה את הטיפוח מדיום לבינוני D, שהוא מדיום התבגרות. רענן את המדיום לטיפוח כל 2-3 ימים במשך שלושה שבועות, ולאחר מכן השתמש בינוני D ללא BDNF ו- GDNF.

תוצאות

ערכת הפרוטוקול מוצגת באיור 1. הפרוטוקול כלל חמש מדיה שבה IPSCs נבדלו לאורגנואידים במוח במהלך חודש אחד לפחות. ההבחנה החלה ואז IPSCs הגיעו למפגש של 75-90%(איור 2A,B). הסימנים הראשונים של בידול כלפי נוירונים נצפו בימים 10-11 של טיפוח iPSC במצב בינוני A כאשר תאים החלו ...

Discussion

הפרוטוקול המתואר כולל שני שלבים מכריעים המאפשרים יצירת אורגנוידים באיכות גבוהה בגודל אחיד. ראשית, האורגנוידים גדלים מפרואידים שהם כמעט זהים במספר התא ובבגרות התא. שנית, הביו-ראקטורים תוצרת בית מספקים לכל אורגנויד סביבה אחידה, שבה האורגנוידים אינם מצטופפים או נשארים זה לזה.

Disclosures

למחברים אין מה לחשוף.

Acknowledgements

עבודה זו נתמכה על ידי מענק 075-15-2019-1669 ממשרד המדע וההשכלה הגבוהה של הפדרציה הרוסית (ניתוח RT-PCR) ועל ידי מענק מס '19-15-00425 מקרן המדע הרוסית (לכל עבודה אחרת). המחברים מודים גם לפאבל בליצ'קוב על עזרתו בעריכת הווידאו. דמויות בכתב היד נוצרו עם BioRender.com.

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
Advanced DMEM/F-12Gibco12634010DMEM/F-12
AggreWell400STEMCELL Technologies Inc3442524-well culture plate with microwells
B-27 SupplementGibco17504044Neuronal supplement B
GlutaMAX SupplementGibco35050061200 mM L-alanyl-L-glutamine
Human BDNFMiltenyi Biotec130-096-285
Human FGF-2Miltenyi Biotec130-093-839
Human GDNFMiltenyi Biotec130-096-290
KnockOut Serum ReplacementGibco10828028Serum replacement
mTESR1STEMCELL Technologies Inc85850Pliripotent stem cell medium
N2 SupplementGibco17502001
Neurobasal MediumGibco21103049Basal medium for neuronal cell maintenance
Penicillin-Streptomycin SolutionGibco15140130
PlasmocinInvivoGenant-mpt-1Antimicrobials
PurmorphamineEMD Millipore540220
StemMACS Y27632Miltenyi Biotec130-106-538Y27632
StemMACS DorsomorphinMiltenyi Biotec130-104-466Dorsomorphin
StemMACS LDN-193189Miltenyi Biotec130-106-540LDN-193189
StemMACS SB431542Miltenyi Biotec130-106-543SB431542
Trypan Blue SolutionGibco15250061
Versen solutionGibco150400660.48 mM EDTA in PBS
β-mercaptoethanolGibco31350010

References

  1. Marchetto, M. C., Winner, B., Gage, F. H. Pluripotent stem cells in neurodegenerative and neurodevelopmental diseases. Human Molecular Genetics. 19, 71-76 (2010).
  2. Lee, C. T., Bendriem, R. M., Wu, W. W., Shen, R. F. 3D brain Organoids derived from pluripotent stem cells: promising experimental models for brain development and neurodegenerative disorders. Journal of Biomedical Science. 24 (1), 1-12 (2017).
  3. Kadoshima, T., et al. Self-organization of axial polarity, inside out layer pattern, and species-specific progenitor dynamics in human ES cell-derived neocortex. Proceedings of the National Academy of Sciences U.S.A. 110 (50), 20284 (2013).
  4. Lancaster, M. A., et al. Cerebral organoids model human brain development and microcephaly. Nature. 501 (7467), 373-379 (2013).
  5. Xiang, Y., et al. Fusion of regionally specified hPSC derived organoids models human brain development and interneuron migration. Cell Stem Cell. 21, 383-398 (2017).
  6. Muguruma, K., Nishiyama, A., Kawakami, H., Hashimoto, K., Sasai, Y. Self-organization of polarized cerebellar tissue in 3D culture of human pluripotent stem cells. Cell Reports. 10 (4), 537-550 (2015).
  7. Qian, X., et al. Brain region specific organoids using mini bioreactors for modeling ZIKV exposure. Cell. 165 (5), 1238-1254 (2016).
  8. Qian, X., et al. Generation of human brain region specific organoids using a miniaturized spinning bioreactor. Nature Protocols. 13 (3), 565-580 (2018).
  9. Jo, J., et al. Midbrain like organoids from human pluripotent stem cells contain functional dopaminergic and neuro melanin producing neurons. Cell Stem Cell. 19 (2), 248-257 (2016).
  10. Sakaguchi, H., et al. Generation of functional hippocampal neurons from self-organizing human embryonic stem cell derived dorsomedial telencephalic tissue. Nature Communication. 6 (1), 8896 (2015).
  11. Di Lullo, E., Kriegstein, A. R. The use of brain organoids to investigate neural development and disease. Nature Reviews Neuroscience. 18 (10), 573-584 (2017).
  12. Chen, K. G., et al. Pluripotent stem cell platforms for drug discovery. Trends in Molecular Medicine. 24 (9), 805-820 (2018).
  13. Dang, J., et al. Zika virus depletes neural progenitors in human cerebral organoids through activation of the innate immune receptor TLR3. Cell Stem Cell. 19 (2), 258-265 (2016).
  14. Tiwari, S. K., Wang, S., Smith, D., Carlin, A. F., Rana, T. M. Revealing tissue-specific SARS-CoV-2 infection and host responses using human stem cell-derived lung and cerebral organoids. Stem Cell Reports. 16 (3), 437-445 (2021).
  15. Ao, Z., et al. One-stop microfluidic assembly of human brain organoids to model prenatal cannabis exposure. Analytical Chemistry. 92 (6), 4630-4638 (2020).
  16. Di Nardo, P., Parker, G. C. Stem cell standardization. Stem Cells Development. 20 (3), 375-377 (2011).
  17. Jo, J., Xiao, Y., et al. Midbrain like organoids from human pluripotent stem cells contain functional dopaminergic and neuro melanin producing neurons. Cell Stem Cell. 19 (2), 248-257 (2016).
  18. Matsui, T. K., et al. Six-month cultured cerebral organoids from human ES cells contain matured neural cells. Neuroscience Letters. 670, 75-82 (2018).
  19. Trujillo, C. A., et al. Complex oscillatory waves emerging from cortical organoids model early human brain network development. Cell Stem Cell. 25 (4), 558-569 (2019).
  20. Eremeev, A. V., et al. Necessity Is the mother of invention” or inexpensive, reliable, and reproducible protocol for generating organoids. Biochemistry (Moscow). 84 (3), 321-328 (2019).
  21. Qian, X., et al. Generation of human brain region–specific organoids using a miniaturized spinning bioreactor. Nature Protocols. 13, 565-580 (2018).
  22. Matsui, T. K., Tsuru, Y., Hasegawa, K., Kuwako, K. I. Vascularization of human brain organoids. Stem Cells. 39 (8), 1017-1024 (2021).
  23. Hall, G. N., et al. Patterned, organoid-based cartilaginous implants exhibit zone specific functionality forming osteochondral-like tissues in vivo. Biomaterials. 273, 120820 (2021).
  24. Zachos, N. C., et al. Human enteroids/colonoids and intestinal organoids functionally recapitulate normal intestinal physiology and pathophysiology. Journal of Biological Chemistry. 291, 3759-3766 (2016).
  25. Eremeev, A., et al. Cerebral organoids—challenges to establish a brain prototype. Cells. 10 (7), 1790 (2021).
  26. Kadoshima, T., et al. Self-organization of axial polarity, inside-out layer pattern, and species-specific progenitor dynamics in human ES Cell-derived neocortex. Proceedings of the National Academy of Sciences U. S. A. 110, 20284-20289 (2013).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

178

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved