Yazarlar
Bize Ulaşın

Oturum Aç

Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliği gereklidir. Oturum açın veya ücretsiz deneme sürümünü başlatın.

Bu Makalede

  • Özet
  • Özet
  • Giriş
  • Protokol
  • Sonuçlar
  • Tartışmalar
  • Açıklamalar
  • Teşekkürler
  • Malzemeler
  • Referanslar
  • Yeniden Basımlar ve İzinler

Özet

Burada, insan kaynaklı pluripotent kök hücrelerden (iPSC' ler) beyin organoidleri üretmek için bir protokol açıklıyoruz. Beyin organoidlerini büyük miktarlarda ve yüksek kalitede elde etmek için ev yapımı mini biyoreaktörler kullanıyoruz.

Özet

iPSC türevi beyin organoidi, sinir sisteminin patolojilerini ve ilaç taramasını modellemek için umut verici bir teknolojidir. Bu teknoloji son zamanlarda ortaya çıktı. Henüz emekleme aşamasındadır ve henüz çözülmemiş bazı sınırlamaları vardır. Mevcut protokoller organoid elde etmenin ilaç keşfi ve preklinik çalışmalar için yeterince tutarlı olmasına izin vermemektedir. Organoidlerin olgunlaşması bir yıla kadar sürebilir ve araştırmacıları aynı anda birden fazla farklılaşma süreci başlatmaya itebilir. Laboratuvar için alan ve ekipman açısından ek maliyetler getirmektedir. Ek olarak, beyin organoidleri genellikle merkezde besin ve oksijen eksikliğinden muzdarip nekrotik bir bölgeye sahiptir. Bu nedenle, mevcut protokollerin çoğu beslenmeyi iyileştirmek için kültür ortamı için dolaşım sistemi kullanır.

Bu arada organoid yetiştiriciliği için ucuz dinamik sistemler veya biyoreaktörler yoktur. Bu makalede, kompakt ve ucuz ev yapımı mini biyoreaktörlerde beyin organoidleri üretmek için bir protokol açıklanmaktadır. Bu protokol, büyük miktarlarda yüksek kaliteli organoidlerin elde etmeyi sağlar.

Giriş

İnsan iPSC türevi modeller nörogelişimsel ve nörodejeneratif bozuklukların çalışmalarında yaygın olarak kullanılmaktadır1. Son on yılda, beyin organoidleri olarak adlandırılan 3D beyin dokusu modelleri, esasen geleneksel 2D nöronal kültürleri tamamlamıştır2. Organoidler embriyonik beynin 3D mimarisini bir dereceye kadar yeniden kaplar ve daha hassas modellemeye izin verir. Farklı beyin bölgelerini temsil eden organoidlerin üretimi için birçok protokol yayınlanır: serebral korteks3,4,5, beyincik6, orta beyin, forebrain, hipotalamus 7,8,9ve hipokampus10. İnsan sinir sistemi hastalıklarını incelemek için organoid kullanmanın birden fazla örneği olmuştur11. Ayrıca, organoidler ilaç keşiflerinde uygulandı 12 ve SARS-Cov-213 ,14dahil olmak üzere bulaşıcı hastalıkların çalışmalarında kullanıldı.

Beyin organoidlerinin çapı birkaç milimetreye kadar ulaşabilir. Bu nedenle, organoidin iç bölgesi hipoksi veya yetersiz beslenmeden muzdarip olabilir ve sonunda nekrotik hale gelebilir. Bu nedenle, birçok protokol özel biyoreaktörler8, çalkalayıcılar veya mikroakışkan sistemler15içerir. Bu aygıtlar büyük hacimli pahalı hücre kültürü ortamı gerektirebilir. Ayrıca, bu tür ekipmanların maliyeti genellikle yüksektir. Bazı biyoreaktörler, yeniden kullanım için sterilize etmelerini zorlaştıran birçok mekanik parçadan oluşur.

Çoğu protokol "toplu etkiden"muzdariptir 16Özdeş iPSC'lerden elde edilen organoidler arasında önemli değişkenlik oluşturur. Bu değişkenlik, tekdüzelik gerektiren ilaç testlerini veya preklinik çalışmaları engeller. Tekdüze boyutta organoidleri seçecek kadar yüksek organoid verimi bu sorunu kısmen çözebilir.

Zaman faktörü de önemli bir sorundur. Matsui ve ark. (2018) beyin organoidlerinin olgunluğa ulaşmak için en az altı ay gerektirdiğini gösterdi17. Trujillo ve ark. (2019) ayrıca organoidlerde elektrofizyolojik aktivitenin sadece altı aylık ekimden sonra meydana geldiğini göstermiştir18. Uzun organoid olgunlaşma süresi nedeniyle, araştırmacılar genellikle bir öncekini tamamlamadan önce yeni bir farklılaşma başlatırlar. Birden fazla paralel farklılaşma süreci ek masraflar, ekipman ve laboratuvar alanı gerektirir.

Son zamanlarda esas olarak yukarıda belirtilen sorunları çözen bir mini biyoreaktör geliştirdik19. Bu ev yapımı biyoreaktör, merkezinde plastik bir düğme bulunan ultra düşük yapışma veya işlenmemiş Petri kabından oluşur. Bu plastik düğme, çalkalayıcının dönmesinden kaynaklanan Petri kabının merkezinde organoidlerin kalabalıklaşmasını ve tıkanmasını önler. Bu makale, bu ucuz ve basit ev yapımı mini biyoreaktörün büyük miktarlarda yüksek kaliteli beyin organoidleri üretmeye nasıl izin verdiğini açıklamaktadır.

Protokol

NOT : 1.2 ve 1.3 adımları hariç olmak üzere protokol boyunca steril teknik kullanın. Hücrelere veya organoidlere uygulamadan önce tüm kültür ortamlarını ve çözeltilerini 37 °C'ye ısıtın. %80 nem üzerinde%5 CO 2'de 37 °C'de bir CO2 inkübatöründe hücre yetiştirin. Protokol şeması Şekil 1'de gösterilmiştir.

1. Petri kaplarını mini biyoreaktörlere dönüştürmek

  1. Steril 15 mL santrifüj tüplerini 7-8 mm yüksekliğinde halkalar halinde kesin; halkaları otoklavla.
  2. Düşük yapışmalı, işlenmemiş veya mikrobiyolojik Petri kaplarını kırıntılara ayırın. Sıvı plastik hazırlamak için yaklaşık 1 g plastik kırıntıyı 10 mL kloroformda bir gecede çözün.
    DİkKAT: Duman kaputunda çalışın.
  3. Elde eden sıvı plastiğin pipetleme için yeterince viskoz olup olmadığını kontrol edin; damlası küresel bir form tutar ve yüzeye yayılmaz. Çok sıvıysa, daha fazla plastik kırıntı ekleyin. Kalınsa, kloroform ekleyin.
  4. Steril ultra düşük yapışma 6 cm Petri kabının ortasına plastik bir düğme yapın. Aşağıda ayrıntılı olarak belirtildiği gibi eşit derecede uygun iki yol vardır.
    1. Otomatik kapatılmış plastik halkayı ortaya koyun ve sıvı plastiği halkanın içine bırakın.
    2. Herhangi bir plastik halka olmadan, sıvı plastiği Petri kabının ortasına bırakın.
  5. Bulaşıkları kurutulana kadar laminer akış davlumbazında 2-3 saat açık bırakın. Kurutulmuş yemekleri 15-20 dakika ultraviyole radyasyonla tedavi edin.

2. iPSC'lerin nöronal farklılaşması indüksiyonu

  1. Hücre dışı proteinlerden oluşan bir matrisle önceden kaplanmış 35 mm Petri kaplarında% 75-90'a kadar pluripotent kök hücreler için ortamda iPSC'ler yetiştirin.
  2. Orta A-SR hazırlayın. Ayrıntılar için Tablo 1'e bakın.
  3. Yetiştirme ortamını epire edin ve 0.
  4. Orta A'ya hazırlanın (bkz. Tablo 2).
  5. Hücreleri 2-14.

3. 14. Günde nöroepithelial öncül hücrelerden sferoid oluşumu

  1. 14. Günde, her kuyuda yaklaşık 1.200 mikrowell içeren özel bir 24 kuyu kültür plakası kullanarak nöroepithelial öncü hücrelerden sferoidler yapın (Şekil 2C). Aşağıda verilen prosedürü izleyin.
    NOT: Bu farklılaşma aşamasında, 35 mm Petri kabı genellikle 3 - 3,5 x 106 nöroepithelial öncül hücre içerir. Bu nedenle, nöroepithelial öncü hücrelere sahip bir adet 35 mm Petri kabı, mikrowells ile 24 kuyulu kültür plakasının 3 - 4 kuyusu için yeterlidir.
  2. Mikrowells ile 24 kuyulu bir kültür plakası hazırlayın: Her kuyuya, plaka tutucu ile donatılmış sallanan kova rotorunda 5 dakika boyunca 1.300 x g'da kısa bir süre 1 mL orta A. Santrifüj ekleyin. Mikroskop altında mikrowelllerde kabarcık olmadığını kontrol edin.
  3. Orta B'ye hazırlanın (Tablo 3).
  4. Ortamı nöroepithelial öncü hücrelerle Petri kabından çıkarın; hücreleri 2 mL DMEM/F12 ile yıkayın. Hücre müfrezesi için, PBS'de hazırlanan 1,5 mL 0,48 mM EDTA çözeltisi ile hücreleri tedavi edin. Mikroskop altında hücre müfrezesini kontrol edin.
  5. Hücreleri 15 mL'lik bir tüpe toplar. Hücreleri yıkamak için tüpe 5 mL DMEM/F12 ekleyin. 5 dakika boyunca 200 x g'da santrifüj. Süpernatant ve resuspend hücreleri 2 mL orta B'de çıkarın.
  6. Trypan Blue boyama ve hemositometre ile hücre konsantrasyonu ve canlılığını kontrol edin. Toplamda 1 x 106 uygulanabilir hücre içermesi için gereken süspansiyon hacmini hesaplayın.
  7. 1 x 106 hücre içeren hücre süspansiyonunun mikrowells ile 24 kuyulu bir plakanın her kuyusuna aktarın. Her kuyuya 2 mL'ye kadar orta B ekleyin, hücreleri birkaç kez hafifçe yukarı ve aşağı borulayın ve mikrowelllerdeki hücreleri yakalamak için 1 dakika boyunca kısa bir süre 100 x g santrifüjleyin.
    NOT: Kuyu başına hücre sayısı 1 x 106'yıgeçmemelidir. Aksi takdirde, komşu mikrowelllerden gelen küreseller kaynaşır.
  8. Mikroskop altında hücrelerin mikrowelllerde eşit olarak dağıtılıp dağıtılmadığını kontrol edin. Hücreler eşit olmayan şekilde dağıtılırsa pipetleme ve santrifüjlemeyi tekrarlayın.
  9. Hücrelerin küresellerde toplanmasına izin vermek için plakayı bir gecede kuluçkaya yatırın.

4. Organoidlerin eldei ve yetiştirilmesi

  1. Ertesi sabah (15. gün), mikroskop altında küresellerin kalitesini kontrol edin. Sağlıklıysa şeffaf ve pürüzsüz olduklarından emin olun (Şekil 2A,B). Küreselleri her kuyudan 15 mL'lik bir tüpe dikkatlice toplayın, küreselleri 2-3 dakika yerçekimi ile çökeltmek üzere bırakın ve ardından süpernatantı çıkarın.
  2. Sferoidlere 2 mL matrisin buz üzerinde aynı anda çözülmüş ekleyin. Pipetleme ile hafifçe karıştırın ve oda sıcaklığında 30 dakika kuluçkaya yatırın.
  3. Matrisin fazlalığını yıkamak için, tüpe 8 mL orta B. Pipet ekleyin, ardından tüpü 100 x g'da1 dakika santrifüjleyin.
    NOT: Küresellerin geri döndürülemez toplanmasını önlemek için santrifüjleme süresini ve hızını aşmayın.
  4. Üsttekini çıkarın. Tüpe 2 mL orta B, pipet yavaşça ekleyin. Küresel süspansiyonu, her biri 4 mL orta B içeren iki mini biyoreaktör arasında bölün.
  5. Petri kabını mini biyoreaktörlerle bir yörünge çalkalayıcıya koyun. Organoidleri 70-75 rpm dönme hızında yetiştirin.
  6. 16. günde orta C(Tablo 4) hazırlayın.
  7. Organoidleri 15 mL tüpe aktarın. 5 dakika boyunca, dibe düşmelerine izin verin, süpernatantı aspire edin, 5 mL orta C ekleyin.
    NOT: Şeffaf ve zar zor görülebilen küreselleri kaybetmemeye dikkat edin.
  8. Sferoidleri iki hafta boyunca orta C'de yetiştirin ve ortamı her iki günde bir yenileyin. Bu iki haftanın sonunda, aşağıdaki ekim için mini biyoreaktör başına yaklaşık 100 küresel bırakın. Sıvı nitrojende donma ortamında aşırı küreselleri dondurun.
  9. 30. günde orta D 'yi hazırlayın (Tablo 5).
  10. Yetiştirme ortamını olgunlaşma ortamı olan orta D olarak değiştirin. Üç hafta boyunca her 2-3 günde bir ekim ortamını yenileyin, ardından BDNF ve GDNF olmadan orta D kullanın.

Sonuçlar

Protokol şeması Şekil 1'de gösterilmiştir. Protokol, iPSC'lerin en az bir ay boyunca beyin organoidlerine farklılaştırılmış beş medyayı içeriyordu. Farklılaşma başladı, daha sonra iPSC'ler% 75-90 izdihama ulaştı (Şekil 2A, B). Nöronlara karşı farklılaşmanın ilk belirtileri, hücrelerin "rozetler" halinde kümelenmeye başladığı orta A'da iPSC ekiminin 10-11 günlerinde gözlenmiştir (Şekil 2C)...

Tartışmalar

Açıklanan protokol, tek tip boyutta yüksek kaliteli organoidlerin üretilmesine izin vermek için iki önemli adıma sahiptir. İlk olarak, organoidler hücre sayısı ve hücre olgunluğunda neredeyse aynı olan küresellerden büyür. İkincisi, ev yapımı biyoreaktörler her organoide, organoidlerin kalabalıklaşmadığı veya birbirine yapışmadığı tek tip bir ortam sağlar.

Hücre kalitesi ve hücre olgunlaşmasının durumu protokolü gerçekleştirmek için gereklidir. Nöronal...

Açıklamalar

Yazarların açıklayacak bir şeyi yok.

Teşekkürler

Bu çalışma, Rusya Federasyonu Bilim ve Yükseköğretim Bakanlığı'ndan 075-15-2019-1669 hibesi (RT-PCR analizi) ve Rusya Bilim Vakfı'ndan 19-15-00425 sayılı hibe ile desteklendi (diğer tüm çalışmalar için). Yazarlar ayrıca Pavel Belikov'a video düzenleme konusundaki yardımları için teşekkür etti. El yazmasındaki figürler BioRender.com ile oluşturulmuştur.

Malzemeler

NameCompanyCatalog NumberComments
Advanced DMEM/F-12Gibco12634010DMEM/F-12
AggreWell400STEMCELL Technologies Inc3442524-well culture plate with microwells
B-27 SupplementGibco17504044Neuronal supplement B
GlutaMAX SupplementGibco35050061200 mM L-alanyl-L-glutamine
Human BDNFMiltenyi Biotec130-096-285
Human FGF-2Miltenyi Biotec130-093-839
Human GDNFMiltenyi Biotec130-096-290
KnockOut Serum ReplacementGibco10828028Serum replacement
mTESR1STEMCELL Technologies Inc85850Pliripotent stem cell medium
N2 SupplementGibco17502001
Neurobasal MediumGibco21103049Basal medium for neuronal cell maintenance
Penicillin-Streptomycin SolutionGibco15140130
PlasmocinInvivoGenant-mpt-1Antimicrobials
PurmorphamineEMD Millipore540220
StemMACS Y27632Miltenyi Biotec130-106-538Y27632
StemMACS DorsomorphinMiltenyi Biotec130-104-466Dorsomorphin
StemMACS LDN-193189Miltenyi Biotec130-106-540LDN-193189
StemMACS SB431542Miltenyi Biotec130-106-543SB431542
Trypan Blue SolutionGibco15250061
Versen solutionGibco150400660.48 mM EDTA in PBS
β-mercaptoethanolGibco31350010

Referanslar

  1. Marchetto, M. C., Winner, B., Gage, F. H. Pluripotent stem cells in neurodegenerative and neurodevelopmental diseases. Human Molecular Genetics. 19, 71-76 (2010).
  2. Lee, C. T., Bendriem, R. M., Wu, W. W., Shen, R. F. 3D brain Organoids derived from pluripotent stem cells: promising experimental models for brain development and neurodegenerative disorders. Journal of Biomedical Science. 24 (1), 1-12 (2017).
  3. Kadoshima, T., et al. Self-organization of axial polarity, inside out layer pattern, and species-specific progenitor dynamics in human ES cell-derived neocortex. Proceedings of the National Academy of Sciences U.S.A. 110 (50), 20284 (2013).
  4. Lancaster, M. A., et al. Cerebral organoids model human brain development and microcephaly. Nature. 501 (7467), 373-379 (2013).
  5. Xiang, Y., et al. Fusion of regionally specified hPSC derived organoids models human brain development and interneuron migration. Cell Stem Cell. 21, 383-398 (2017).
  6. Muguruma, K., Nishiyama, A., Kawakami, H., Hashimoto, K., Sasai, Y. Self-organization of polarized cerebellar tissue in 3D culture of human pluripotent stem cells. Cell Reports. 10 (4), 537-550 (2015).
  7. Qian, X., et al. Brain region specific organoids using mini bioreactors for modeling ZIKV exposure. Cell. 165 (5), 1238-1254 (2016).
  8. Qian, X., et al. Generation of human brain region specific organoids using a miniaturized spinning bioreactor. Nature Protocols. 13 (3), 565-580 (2018).
  9. Jo, J., et al. Midbrain like organoids from human pluripotent stem cells contain functional dopaminergic and neuro melanin producing neurons. Cell Stem Cell. 19 (2), 248-257 (2016).
  10. Sakaguchi, H., et al. Generation of functional hippocampal neurons from self-organizing human embryonic stem cell derived dorsomedial telencephalic tissue. Nature Communication. 6 (1), 8896 (2015).
  11. Di Lullo, E., Kriegstein, A. R. The use of brain organoids to investigate neural development and disease. Nature Reviews Neuroscience. 18 (10), 573-584 (2017).
  12. Chen, K. G., et al. Pluripotent stem cell platforms for drug discovery. Trends in Molecular Medicine. 24 (9), 805-820 (2018).
  13. Dang, J., et al. Zika virus depletes neural progenitors in human cerebral organoids through activation of the innate immune receptor TLR3. Cell Stem Cell. 19 (2), 258-265 (2016).
  14. Tiwari, S. K., Wang, S., Smith, D., Carlin, A. F., Rana, T. M. Revealing tissue-specific SARS-CoV-2 infection and host responses using human stem cell-derived lung and cerebral organoids. Stem Cell Reports. 16 (3), 437-445 (2021).
  15. Ao, Z., et al. One-stop microfluidic assembly of human brain organoids to model prenatal cannabis exposure. Analytical Chemistry. 92 (6), 4630-4638 (2020).
  16. Di Nardo, P., Parker, G. C. Stem cell standardization. Stem Cells Development. 20 (3), 375-377 (2011).
  17. Jo, J., Xiao, Y., et al. Midbrain like organoids from human pluripotent stem cells contain functional dopaminergic and neuro melanin producing neurons. Cell Stem Cell. 19 (2), 248-257 (2016).
  18. Matsui, T. K., et al. Six-month cultured cerebral organoids from human ES cells contain matured neural cells. Neuroscience Letters. 670, 75-82 (2018).
  19. Trujillo, C. A., et al. Complex oscillatory waves emerging from cortical organoids model early human brain network development. Cell Stem Cell. 25 (4), 558-569 (2019).
  20. Eremeev, A. V., et al. Necessity Is the mother of invention” or inexpensive, reliable, and reproducible protocol for generating organoids. Biochemistry (Moscow). 84 (3), 321-328 (2019).
  21. Qian, X., et al. Generation of human brain region–specific organoids using a miniaturized spinning bioreactor. Nature Protocols. 13, 565-580 (2018).
  22. Matsui, T. K., Tsuru, Y., Hasegawa, K., Kuwako, K. I. Vascularization of human brain organoids. Stem Cells. 39 (8), 1017-1024 (2021).
  23. Hall, G. N., et al. Patterned, organoid-based cartilaginous implants exhibit zone specific functionality forming osteochondral-like tissues in vivo. Biomaterials. 273, 120820 (2021).
  24. Zachos, N. C., et al. Human enteroids/colonoids and intestinal organoids functionally recapitulate normal intestinal physiology and pathophysiology. Journal of Biological Chemistry. 291, 3759-3766 (2016).
  25. Eremeev, A., et al. Cerebral organoids—challenges to establish a brain prototype. Cells. 10 (7), 1790 (2021).
  26. Kadoshima, T., et al. Self-organization of axial polarity, inside-out layer pattern, and species-specific progenitor dynamics in human ES Cell-derived neocortex. Proceedings of the National Academy of Sciences U. S. A. 110, 20284-20289 (2013).

Yeniden Basımlar ve İzinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya resimlerini yeniden kullanma izni talebi

Izin talebi

Daha Fazla Makale Keşfet

Geli imSel BiyolojiSay 178

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Gizlilik

Kullanım Şartları

İlkeler

Bize Ulaşın

KÜTÜPHANEYE TAVSİYE ET

JoVE HABER BÜLTENLERİ

Araştırma

Eğitim

Yazarlar

Kütüphaneciler

JoVE Hakkında

Telif Hakkı © 2020 MyJove Corporation. Tüm hakları saklıdır