Gehirnorganoid-Erzeugung aus induzierten pluripotenten Stammzellen in hausgemachten Mini-Bioreaktoren

Zusammenfassung

Hier beschreiben wir ein Protokoll zur Erzeugung von Hirnorganoiden aus humanen induzierten pluripotenten Stammzellen (iPS-Zellen). Um Gehirnorganoide in großen Mengen und von hoher Qualität zu erhalten, verwenden wir hausgemachte Mini-Bioreaktoren.

Zusammenfassung

Das iPSC-abgeleitete Gehirnorganoid ist eine vielversprechende Technologie für die In-vitro-Modellierung der Pathologien des Nervensystems und das Drogenscreening. Diese Technologie ist in letzter Zeit entstanden. Es steckt noch in den Kinderschuhen und hat einige noch ungelöste Einschränkungen. Die derzeitigen Protokolle erlauben es nicht, Organoide konsistent genug für die Entdeckung von Medikamenten und präklinische Studien zu erhalten. Die Reifung von Organoiden kann bis zu einem Jahr dauern, was die Forscher dazu veranlasst, mehrere Differenzierungsprozesse gleichzeitig zu starten. Es verursacht zusätzliche Kosten für das Labor in Bezug auf Platz und Ausstattung. Darüber hinaus haben Hirnorganoide oft eine nekrotische Zone im Zentrum, die an Nährstoff- und Sauerstoffmangel leidet. Daher verwenden die meisten aktuellen Protokolle ein zirkulierendes System für Kulturmedium, um die Ernährung zu verbessern.

Mittlerweile gibt es keine kostengünstigen dynamischen Systeme oder Bioreaktoren für die Organoidkultivierung. Dieses Papier beschreibt ein Protokoll zur Herstellung von Gehirnorganoiden in kompakten und kostengünstigen hausgemachten Mini-Bioreaktoren. Dieses Protokoll ermöglicht die Gewinnung hochwertiger Organoide in großen Mengen.

Einleitung

Humane iPSC-abgeleitete Modelle werden häufig in den Studien zu neurologischen Entwicklungs- und neurodegenerativen Erkrankungen verwendet¹. In den letzten zehn Jahren ergänzten 3D-Hirngewebemodelle, sogenannte Hirnorganoide, im Wesentlichen traditionelle 2D-neuronale Kulturen². Die Organoide rekapitulieren bis zu einem gewissen Grad die 3D-Architektur des embryonalen Gehirns und ermöglichen eine präzisere Modellierung. Viele Protokolle werden für die Erzeugung von Organoiden veröffentlicht, die verschiedene Gehirnregionen repräsentieren: Großhirnrinde^3,4,5, Kleinhirn⁶, Mittelhirn, Vorderhirn, Hypothalamus^7,8,9und Hippocampus¹⁰. Es gab mehrere Beispiele für die Verwendung von Organoiden zur Untersuchung von Erkrankungen des menschlichen Nervensystems¹¹. Außerdem wurden die Organoide in Arzneimittelentdeckungen¹² implementiert und in Studien zu Infektionskrankheiten verwendet, einschließlich SARS-Cov-2^13,14.

Die Hirnorganoide können bis zu mehreren Millimetern Durchmesser erreichen. So kann die innere Zone des Organoids an Hypoxie oder Unterernährung leiden und schließlich nekrotisch werden. Daher umfassen viele Protokolle spezielle Bioreaktoren^8,Shaker oder mikrofluidische Systeme^15. Diese Geräte benötigen möglicherweise große Mengen teurer Zellkulturmedien. Auch die Kosten für solche Geräte sind in der Regel hoch. Einige Bioreaktoren bestehen aus vielen mechanischen Teilen, die es schwierig machen, sie für die Wiederverwendung zu sterilisieren.

Die meisten Protokolle leiden unter dem "Batch-Effekt"¹⁶, der eine signifikante Variabilität zwischen den Organoiden erzeugt, die aus den identischen iPS-Zellen gewonnen werden. Diese Variabilität behindert Drogentests oder präklinische Studien, die Einheitlichkeit erfordern. Die hohe Ausbeute an Organoiden, die ausreicht, um Organoide von einheitlicher Größe auszuwählen, kann dieses Problem teilweise lösen.

Der Zeitfaktor ist ebenfalls ein erhebliches Problem. Matsui et al. (2018) zeigten, dass Gehirnorganoide mindestens sechs Monate benötigen, um die Reife zu erreichen¹⁷. Trujillo et al. (2019) zeigten auch, dass elektrophysiologische Aktivität in Organoiden erst nach sechsMonaten der Kultivierung auftrat¹⁸. Aufgrund der langen Organoidreifungszeit starten die Forscher oft eine neue Differenzierung, bevor sie die vorherige abschließen. Mehrere parallele Differenzierungsprozesse erfordern zusätzliche Kosten, Ausrüstung und Laborfläche.

Wir haben kürzlich einen Mini-Bioreaktor entwickelt, der hauptsächlich die oben genannten Probleme^{löst 19}. Dieser hausgemachte Bioreaktor besteht aus einer extrem niedrigen Haftung oder einer unbehandelten Petrischale mit einem Kunststoffknopf in der Mitte. Dieser Kunststoffknopf verhindert das Überfüllen von Organoiden und deren Verklebung in der Mitte der Petrischale, die durch die Rotation des Shakers verursacht wird. Dieser Artikel beschreibt, wie dieser kostengünstige und einfache hausgemachte Mini-Bioreaktor die Erzeugung hochwertiger Gehirnorganoide in großen Mengen ermöglicht.

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Protokoll

ANMERKUNG : Verwenden Sie sterile Technik während des gesamten Protokolls, mit Ausnahme der Schritte 1.2 und 1.3. Erwärmen Sie alle Kulturmedien und Lösungen auf 37 °C, bevor Sie sie auf Zellen oder Organoide auftragen. Kultivieren Sie Zellen in_einem CO 2-Inkubator bei 37 °C bei 5%_CO2 bei 80% Luftfeuchtigkeit. Das Protokollschema ist in Abbildung 1 dargestellt.

1. Petrischalen in Mini-Bioreaktoren verwandeln

1. Schneiden Sie sterile 15-ml-Zentrifugenröhrchen in Ringe von 7-8 mm Höhe; Autoklavieren Sie die Ringe.
2. Adhäsionsarme, unbehandelte oder mikrobiologische Petrischalen in Krümel aufbrechen. Lösen Sie etwa 1 g Kunststoffkrümel über Nacht in 10 ml Chloroform auf, um flüssigen Kunststoff herzustellen.
   ACHTUNG: Arbeiten Sie in einem Abzug.
3. Überprüfen Sie, ob der resultierende flüssige Kunststoff viskos genug für das Pipettieren ist; sein Tropfen behält eine kugelförmige Form bei und breitet sich nicht auf der Oberfläche aus. Wenn es sehr flüssig ist, fügen Sie weitere Plastikkrümel hinzu. Wenn es dick ist, fügen Sie Chloroform hinzu.
4. Machen Sie einen Kunststoffknopf in der Mitte einer sterilen 6-cm-Petrischale mit extrem niedriger Haftung. Es gibt zwei gleichermaßen geeignete Wege, wie unten beschrieben.
   1. Legen Sie den autoklavierten Kunststoffring auf die Mitte und lassen Sie den flüssigen Kunststoff auf die Innenseite des Rings fallen.
   2. Lassen Sie den flüssigen Kunststoff ohne Plastikring auf die Mitte der Petrischale fallen.
5. Lassen Sie das Geschirr für 2-3 h in einer Laminar-Flow-Haube offen, bis sie vollständig getrocknet ist. Behandeln Sie das getrocknete Geschirr mit ultravioletter Strahlung für 15-20 min.

2. Induktion der neuronalen Differenzierung von iPS-Zellen

1. Kultivieren Sie iPS-Zellen im Medium für pluripotente Stammzellen bis zu 75-90% Konfluenz in 35 mm Petrischalen, die mit einer Matrix aus extrazellulären Proteinen vorbeschichtet sind.
2. Bereiten Sie Medium A-SR vor. Weitere Informationen finden Sie in Tabelle 1.
3. Aspirieren Sie das Kultivierungsmedium und geben Sie am Tag 0 der Differenzierung 2 ml A-SR-Medium hinzu.
4. Medium A vorbereiten (siehe Tabelle 2).
5. Kultivieren Sie Zellen in Medium A für zwei Wochen von Tag 2-14, erfrischendes Medium in Petrischalen jeden zweiten Tag.

3. Die Bildung von Sphäroiden aus neuroepithelialen Vorläuferzellen an Tag 14

1. Stellen Sie an Tag 14 Sphäroide aus neuroepithelialen Vorläuferzellen her, indem Sie eine spezielle 24-Well-Kulturplatte verwenden, die ungefähr 1.200 Mikrobohrungen in jeder Vertiefung enthält (Abbildung 2C). Befolgen Sie das unten angegebene Verfahren.
   HINWEIS: In diesem Differenzierungsstadium enthält eine 35 mm Petrischale üblicherweise 3 - 3,5 x 10⁶ neuroepitheliale Vorläuferzellen. Somit reicht eine 35 mm Petrischale mit neuroepithelialen Vorläuferzellen für 3 - 4 Vertiefungen der 24-Well-Kulturplatte mit Mikrotiterlöchern.
2. Bereiten Sie eine 24-Well-Kulturplatte mit Mikrobohrungen vor: Zu jeder Vertiefung 1 ml Medium A. Zentrifuge kurz bei 1.300 x g für 5 min in schwingendem Eimerrotor mit Plattenhalter. Kontrollieren Sie unter dem Mikroskop, dass es keine Blasen in Mikrotrossen gibt.
3. Bereiten Sie das Medium B vor (Tabelle 3).
4. Entfernen Sie das Medium aus der Petrischale mit neuroepithelialen Vorläuferzellen; Waschen Sie die Zellen mit 2 ml DMEM/F12. Für die Zellablösung behandeln Sie die Zellen mit 1,5 ml 0,48 mM EDTA-Lösung, die in PBS hergestellt wird. Kontrollieren Sie die Zellablösung unter dem Mikroskop.
5. Ernten Sie die Zellen in einem 15-ml-Röhrchen. Fügen Sie 5 ml DMEM / F12 in das Röhrchen hinzu, um die Zellen zu waschen. Zentrifuge bei 200 x g für 5 min. Entfernen Sie den Überstand und resuspendieren Sie die Zellen in 2 ml Medium B.
6. Überprüfen Sie die Zellkonzentration und Lebensfähigkeit durch Trypan Blue Färbung und ein Hämozytometer. Berechnen Sie das Volumen der Suspension, die benötigt wird, um insgesamt 1 x^{10 6} lebensfähige Zellen zu enthalten.
7. Die Zellsuspension mit 1 x 10⁶ Zellen wird in jede Vertiefung einer 24-Well-Platte mit Mikrobohrungen überführt. Geben Sie Medium B bis zu 2 ml in jede Vertiefung, pipettieren Sie die Zellen mehrmals vorsichtig nach oben und unten und zentrifugieren Sie kurz 100 x g für 1 min, um die Zellen in den Mikrobohrungen einzufangen.
   HINWEIS: Die Anzahl der Zellen pro Vertiefung sollte 1 x 10⁶nicht überschreiten. Andernfalls verschmelzen Sphäroide aus benachbarten Mikrobohrungen.
8. Überprüfen Sie unter dem Mikroskop, ob die Zellen gleichmäßig in Mikrotrinnen verteilt sind. Pipettieren und Zentrifugieren wiederholen, wenn die Zellen ungleichmäßig verteilt sind.
9. Inkubieren Sie die Platte über Nacht, damit sich die Zellen in Sphäroiden ansammeln können.

4. Gewinnung und Kultivierung von Organoiden

1. Überprüfen Sie am nächsten Morgen (Tag 15) die Qualität der Sphäroide unter dem Mikroskop. Stellen Sie sicher, dass sie transparent und glatt sind, wenn sie gesund sind (Abbildung 2A, B). Sammeln Sie die Sphäroide vorsichtig aus jeder Vertiefung in einem 15-ml-Rohr, lassen Sie die Sphäroide 2-3 min lang durch schwerkraft ausfallen und entfernen Sie dann den Überstand.
2. Fügen Sie zu den Sphäroide 2 ml der Matrix hinzu, die während der gleichen Zeit auf Eis aufgetaut wurde. Durch Pipettieren vorsichtig mischen und bei Raumtemperatur 30 min inkubieren.
3. Um den Überschuss der Matrix zu waschen, fügen Sie dem Röhrchen 8 ml Medium B hinzu. Vorsichtig pipettieren, dann das Röhrchen für 1 min bei 100 x gzentrifugieren.
   HINWEIS: Überschreiten Sie nicht die Zeit und die Geschwindigkeit der Zentrifugation, um die irreversible Aggregation von Sphäroide zu vermeiden.
4. Entfernen Sie den Überstand. In das Röhrchen 2 mL Medium B geben, vorsichtig pipettieren. Teilen Sie die Sphäroidsuspension auf zwei Mini-Bioreaktoren auf, die jeweils 4 ml Medium B enthalten. Legen Sie die Mini-Bioreaktoren in eine 15 cm lange Petrischale, um die Verdunstung von Wasser zu verhindern und eine Kontamination zu vermeiden.
5. Legen Sie die Petrischale mit Mini-Bioreaktoren auf einen Orbitalschüttler. Kultivieren Sie die Organoide mit einer Rotationsrate von 70-75 U / min.
6. Bereiten Sie an Tag 16 Medium C vor (Tabelle 4).
7. Übertragen Sie die Organoide in eine 15-ml-Röhre. Lassen Sie sie für 5 min auf den Boden fallen, aspirieren Sie den Überstand, fügen Sie 5 ml Medium C hinzu.
   HINWEIS: Achten Sie darauf, die Sphäroide, die transparent und kaum sichtbar sind, nicht zu verlieren.
8. Kultivieren Sie Sphäroide in Medium C für zwei Wochen und erfrischen Sie das Medium alle zwei Tage. Lassen Sie am Ende dieser zwei Wochen etwa 100 Sphäroide pro Mini-Bioreaktor für die anschließende Kultivierung. Gefrieren Sie überschüssige Sphäroide in einem gefrierenden Medium in flüssigem Stickstoff.
9. Bereiten Sie am Tag 30 Medium D vor (Tabelle 5).
10. Ändern Sie das Kultivierungsmedium in Medium D, das ein Reifemedium ist. Erfrischen Sie das Kultivierungsmedium alle 2-3 Tage für drei Wochen und verwenden Sie dann medium D ohne BDNF und GDNF.

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Ergebnisse

Das Protokollschema ist in Abbildung 1 dargestellt. Das Protokoll umfasste fünf Medien, in denen sich iPS-Zellen während mindestens eines Monats in Gehirnorganoide differenzierten. Die Differenzierung wurde gestartet, dann erreichten iPS-Zellen den 75-90%igen Zusammenfluss (Abbildung 2A,B). Die ersten Anzeichen einer Differenzierung in Richtung Neuronen wurden an den Tagen 10-11 der iPSC-Kultivierung in Medium A beobachtet, als zellen begannen...

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Diskussion

Das beschriebene Protokoll besteht aus zwei entscheidenden Schritten, die die Erzeugung hochwertiger Organoide einheitlicher Größe ermöglichen. Erstens wachsen die Organoide aus Sphäroiden, die in Zellzahl und Zellreife nahezu identisch sind. Zweitens bieten die selbstgebauten Bioreaktoren jedem Organoid eine einheitliche Umgebung, in der sich Organoide nicht drängen oder zusammenkleben.

Die Zellqualität und der Zustand der Zellreifung sind für die Durchführung des Protokolls unerläss...

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Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
Advanced DMEM/F-12	Gibco	12634010	DMEM/F-12
AggreWell400	STEMCELL Technologies Inc	34425	24-well culture plate with microwells
B-27 Supplement	Gibco	17504044	Neuronal supplement B
GlutaMAX Supplement	Gibco	35050061	200 mM L-alanyl-L-glutamine
Human BDNF	Miltenyi Biotec	130-096-285
Human FGF-2	Miltenyi Biotec	130-093-839
Human GDNF	Miltenyi Biotec	130-096-290
KnockOut Serum Replacement	Gibco	10828028	Serum replacement
mTESR1	STEMCELL Technologies Inc	85850	Pliripotent stem cell medium
N2 Supplement	Gibco	17502001
Neurobasal Medium	Gibco	21103049	Basal medium for neuronal cell maintenance
Penicillin-Streptomycin Solution	Gibco	15140130
Plasmocin	InvivoGen	ant-mpt-1	Antimicrobials
Purmorphamine	EMD Millipore	540220
StemMACS Y27632	Miltenyi Biotec	130-106-538	Y27632
StemMACS Dorsomorphin	Miltenyi Biotec	130-104-466	Dorsomorphin
StemMACS LDN-193189	Miltenyi Biotec	130-106-540	LDN-193189
StemMACS SB431542	Miltenyi Biotec	130-106-543	SB431542
Trypan Blue Solution	Gibco	15250061
Versen solution	Gibco	15040066	0.48 mM EDTA in PBS
β-mercaptoethanol	Gibco	31350010