Génération d’organoïdes cérébraux à partir de cellules souches pluripotentes induites dans des mini-bioréacteurs faits maison

Résumé

Nous décrivons ici un protocole pour générer des organoïdes cérébraux à partir de cellules souches pluripotentes induites par l’homme (CSI). Pour obtenir des organoïdes cérébraux en grande quantité et de haute qualité, nous utilisons des mini-bioréacteurs faits maison.

Résumé

L’organoïde cérébral dérivé de l’iPSC est une technologie prometteuse pour la modélisation in vitro des pathologies du système nerveux et le dépistage des médicaments. Cette technologie a émergé récemment. Il en est encore à ses balbutiements et a encore certaines limites non résolues. Les protocoles actuels ne permettent pas d’obtenir des organoïdes de manière suffisamment cohérente pour la découverte de médicaments et les études précliniques. La maturation des organoïdes peut prendre jusqu’à un an, poussant les chercheurs à lancer plusieurs processus de différenciation simultanément. Il impose des coûts supplémentaires pour le laboratoire en termes d’espace et d’équipement. En outre, les organoïdes cérébraux ont souvent une zone nécrotique au centre, qui souffre d’une carence en nutriments et en oxygène. Par conséquent, la plupart des protocoles actuels utilisent un système de circulation pour le milieu de culture afin d’améliorer la nutrition.

Pendant ce temps, il n’y a pas de systèmes dynamiques peu coûteux ou de bioréacteurs pour la culture d’organoïdes. Cet article décrit un protocole pour la production d’organoïdes cérébraux dans des mini-bioréacteurs compacts et peu coûteux fabriqués à la maison. Ce protocole permet d’obtenir des organoïdes de haute qualité en grande quantité.

Introduction

Les modèles humains dérivés de l’iPSC sont largement utilisés dans les études des troubles neurodéveloppementaux et neurodégénératifs¹. Au cours de la dernière décennie, les modèles de tissus cérébraux 3D, appelés organoïdes cérébraux, ont essentiellement complété les cultures neuronales 2D traditionnelles². Les organoïdes récapitulent dans une certaine mesure l’architecture 3D du cerveau embryonnaire et permettent une modélisation plus précise. De nombreux protocoles sont publiés pour la génération d’organoïdes représentant différentes régions du cerveau : cortex cérébral^3,

Protocole

NOTE : Utiliser la technique stérile tout au long du protocole, à l’exception des étapes 1.2 et 1.3. Réchauffer tous les milieux de culture et les solutions à 37 °C avant de les appliquer sur les cellules ou les organoïdes. Cultivez des cellules dans un incubateur à CO₂ à 37 °C dans 5 % de CO₂ et 80 % d’humidité. Le schéma de protocole est illustré à la figure 1.

1. Transformer les boîtes de Petri en mini-bioréacteurs

1. Couper des tubes centrifuges stériles de 15 mL dans des anneaux de 7 à 8 mm de hauteur; autoclavez les anneaux.
2. Casser les boîtes de Petr....

Résultats

Le schéma de protocole est illustré à la figure 1. Le protocole comprenait cinq milieux dans lesquels les CSPe se différenciaient en organoïdes cérébraux pendant au moins un mois. La différenciation a commencé puis les CSPe ont atteint la confluence de 75 à 90 %(Figure 2A,B). Les premiers signes de différenciation vers les neurones ont été observés aux jours 10 à 11 de la culture de l’iPSC dans le milieu A lorsque les cellules o.......

Discussion

Le protocole décrit comporte deux étapes cruciales permettant la génération d’organoïdes de haute qualité de taille uniforme. Tout d’abord, les organoïdes se développent à partir de sphéroïdes qui sont presque identiques en nombre de cellules et en maturité cellulaire. Deuxièmement, les bioréacteurs faits maison fournissent à chaque organoïde un environnement uniforme, où les organoïdes ne s’encombrent pas ou ne collent pas ensemble.

La qualité cellulaire et l’état .......

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
Advanced DMEM/F-12	Gibco	12634010	DMEM/F-12
AggreWell400	STEMCELL Technologies Inc	34425	24-well culture plate with microwells
B-27 Supplement	Gibco	17504044	Neuronal supplement B
GlutaMAX Supplement	Gibco	35050061	200 mM L-alanyl-L-glutamine
Human BDNF	Miltenyi Biotec	130-096-285
Human FGF-2	Miltenyi Biotec	130-093-839
Human GDNF	Miltenyi Biotec	130-096-290
KnockOut Serum Replacement	Gibco	10828028	Serum replacement
mTESR1	STEMCELL Technologies Inc	85850	Pliripotent stem cell medium
N2 Supplement	Gibco	17502001
Neurobasal Medium	Gibco	21103049	Basal medium for neuronal cell maintenance
Penicillin-Streptomycin Solution	Gibco	15140130
Plasmocin	InvivoGen	ant-mpt-1	Antimicrobials
Purmorphamine	EMD Millipore	540220
StemMACS Y27632	Miltenyi Biotec	130-106-538	Y27632
StemMACS Dorsomorphin	Miltenyi Biotec	130-104-466	Dorsomorphin
StemMACS LDN-193189	Miltenyi Biotec	130-106-540	LDN-193189
StemMACS SB431542	Miltenyi Biotec	130-106-543	SB431542
Trypan Blue Solution	Gibco	15250061
Versen solution	Gibco	15040066	0.48 mM EDTA in PBS
β-mercaptoethanol	Gibco	31350010