Génération d’organoïdes cérébraux à partir de cellules souches pluripotentes induites dans des mini-bioréacteurs faits maison

Résumé

Nous décrivons ici un protocole pour générer des organoïdes cérébraux à partir de cellules souches pluripotentes induites par l’homme (CSI). Pour obtenir des organoïdes cérébraux en grande quantité et de haute qualité, nous utilisons des mini-bioréacteurs faits maison.

Résumé

L’organoïde cérébral dérivé de l’iPSC est une technologie prometteuse pour la modélisation in vitro des pathologies du système nerveux et le dépistage des médicaments. Cette technologie a émergé récemment. Il en est encore à ses balbutiements et a encore certaines limites non résolues. Les protocoles actuels ne permettent pas d’obtenir des organoïdes de manière suffisamment cohérente pour la découverte de médicaments et les études précliniques. La maturation des organoïdes peut prendre jusqu’à un an, poussant les chercheurs à lancer plusieurs processus de différenciation simultanément. Il impose des coûts supplémentaires pour le laboratoire en termes d’espace et d’équipement. En outre, les organoïdes cérébraux ont souvent une zone nécrotique au centre, qui souffre d’une carence en nutriments et en oxygène. Par conséquent, la plupart des protocoles actuels utilisent un système de circulation pour le milieu de culture afin d’améliorer la nutrition.

Pendant ce temps, il n’y a pas de systèmes dynamiques peu coûteux ou de bioréacteurs pour la culture d’organoïdes. Cet article décrit un protocole pour la production d’organoïdes cérébraux dans des mini-bioréacteurs compacts et peu coûteux fabriqués à la maison. Ce protocole permet d’obtenir des organoïdes de haute qualité en grande quantité.

Introduction

Les modèles humains dérivés de l’iPSC sont largement utilisés dans les études des troubles neurodéveloppementaux et neurodégénératifs¹. Au cours de la dernière décennie, les modèles de tissus cérébraux 3D, appelés organoïdes cérébraux, ont essentiellement complété les cultures neuronales 2D traditionnelles². Les organoïdes récapitulent dans une certaine mesure l’architecture 3D du cerveau embryonnaire et permettent une modélisation plus précise. De nombreux protocoles sont publiés pour la génération d’organoïdes représentant différentes régions du cerveau : cortex cérébral^3,4,5,cervelet^6,mésencéphale, cerveau antérieur, hypothalamus^7,8,9et hippocampe^10. Il y a eu de multiples exemples d’utilisation d’organoïdes pour étudier les maladies du système nerveux humain¹¹. En outre, les organoïdes ont été mis en œuvre dans les découvertes de médicaments¹² et utilisés dans des études sur les maladies infectieuses, y compris le SARS-Cov-2^13,14.

Les organoïdes cérébraux peuvent atteindre plusieurs millimètres de diamètre. Ainsi, la zone interne de l’organoïde peut souffrir d’hypoxie ou de malnutrition et éventuellement devenir nécrotique. Par conséquent, de nombreux protocoles incluent des bioréacteurs spéciaux^8,des agitateurs ou des systèmes microfluidiques^15. Ces dispositifs peuvent nécessiter de grands volumes de milieux de culture cellulaire coûteux. En outre, le coût d’un tel équipement est généralement élevé. Certains bioréacteurs sont constitués de nombreuses pièces mécaniques qui les rendent difficiles à stériliser pour les réutiliser.

La plupart des protocoles souffrent de « l’effet batch »¹⁶, qui génère une variabilité significative entre les organoïdes obtenus à partir des cSI identiques. Cette variabilité entrave les tests de dépistage de drogues ou les études précliniques nécessitant une uniformité. Le rendement élevé des organoïdes suffisant pour sélectionner des organoïdes de taille uniforme peut résoudre partiellement ce problème.

Le facteur temps est également un problème important. Matsui et al. (2018) ont montré que les organoïdes cérébraux ont besoin d’au moins six mois pour atteindre^{la maturité 17.} Trujillo et al. (2019) ont également démontré que l’activité électrophysiologique ne se produisait dans les organoïdes qu’après six mois de culture^18. En raison du long temps de maturation des organoïdes, les chercheurs lancent souvent une nouvelle différenciation avant de terminer la précédente. De multiples processus parallèles de différenciation nécessitent des dépenses, des équipements et des espaces de laboratoire supplémentaires.

Nous avons récemment développé un mini bioréacteur qui résout principalement les problèmes mentionnés ci-dessus¹⁹. Ce bioréacteur fait maison se compose d’une boîte de Petri à très faible adhérence ou non traitée avec un bouton en plastique au centre. Ce bouton en plastique empêche l’encombrement des organoïdes et leur conglutination au centre de la boîte de Pétri, qui est causée par la rotation du shaker. Cet article décrit comment ce mini bioréacteur maison peu coûteux et simple permet de générer des organoïdes cérébraux de haute qualité en grande quantité.

Protocole

NOTE : Utiliser la technique stérile tout au long du protocole, à l’exception des étapes 1.2 et 1.3. Réchauffer tous les milieux de culture et les solutions à 37 °C avant de les appliquer sur les cellules ou les organoïdes. Cultivez des cellules dans un incubateur à CO₂ à 37 °C dans 5 % de CO₂ et 80 % d’humidité. Le schéma de protocole est illustré à la figure 1.

1. Transformer les boîtes de Petri en mini-bioréacteurs

1. Couper des tubes centrifuges stériles de 15 mL dans des anneaux de 7 à 8 mm de hauteur; autoclavez les anneaux.
2. Casser les boîtes de Petri à faible adhérence, non traitées ou microbiologiques en miettes. Dissoudre environ 1 g de miettes de plastique dans 10 mL de chloroforme pendant la nuit pour préparer du plastique liquide.
   ATTENTION : Travailler dans une hotte aspirante.
3. Vérifier que le plastique liquide résultant est suffisamment visqueux pour le pipetage; sa goutte conserve une forme sphérique et ne se propage pas à la surface. S’il est très liquide, ajoutez plus de miettes de plastique. S’il est épais, ajoutez du chloroforme.
4. Faites un bouton en plastique au centre d’une boîte de Petri stérile à ultra-faible adhérence de 6 cm. Il existe deux façons également appropriées, comme détaillé ci-dessous.
   1. Placez l’anneau en plastique autoclavé au centre et déposez le plastique liquide à l’intérieur de l’anneau.
   2. Sans anneau en plastique, déposez le plastique liquide au centre de la boîte de Pétri.
5. Laissez la vaisselle ouverte pendant 2-3 h dans une hotte à écoulement laminaire jusqu’à ce qu’elle soit complètement séchée. Traitez les plats séchés avec un rayonnement ultraviolet pendant 15-20 min.

2. Induction de la différenciation neuronale des CS IPC

1. Cultiver des CSPe dans le milieu des cellules souches pluripotentes jusqu’à 75-90% de confluence dans des boîtes de Petri de 35 mm pré-recouvertes d’une matrice constituée de protéines extracellulaires.
2. Préparez un A-SR moyen. Voir le tableau 1 pour plus de détails.
3. Aspirer le milieu de culture et ajouter 2 mL de milieu A-SR au jour 0 de la différenciation.
4. Préparer le milieu A (voir tableau 2).
5. Cultivez des cellules en milieu A pendant deux semaines à partir des jours 2 à 14, en les rafraîchissants dans des boîtes de Pétri tous les deux jours.

3. La formation de sphéroïdes à partir de cellules précurseurs neuroépithéliales au jour 14

1. Au jour 14, fabriquer des sphéroïdes à partir de cellules précurseurs neuroépithéliales à l’aide d’une plaque de culture spéciale de 24 puits contenant environ 1 200 micropuits dans chaque puits(figure 2C). Suivez la procédure ci-dessous.
   REMARQUE: À ce stade de différenciation, une boîte de Petri de 35 mm contient généralement 3 à 3,5 x 10⁶ cellules précurseurs neuroépithéliales. Ainsi, une boîte de Petri de 35 mm avec des cellules précurseurs neuroépithéliales est suffisante pour 3 à 4 puits de plaque de culture de 24 puits avec des micropuits.
2. Préparer une plaque de culture de 24 puits avec des micropuits : À chaque puits, ajouter 1 mL de milieu A. Centrifuger brièvement à 1 300 x g pendant 5 min dans un rotor à godet oscillant équipé d’un support de plaque. Contrôlez au microscope qu’il n’y a pas de bulles dans les micropuits.
3. Préparer le milieu B (Tableau 3).
4. Retirer le milieu de la boîte de Pétri avec des cellules précurseurs neuroépithéliales; laver les cellules avec 2 mL de DMEM/F12. Pour le détachement cellulaire, traiter les cellules avec 1,5 mL de solution d’EDTA de 0,48 mM préparée dans du PBS. Contrôlez le détachement de la cellule au microscope.
5. Récoltez les cellules dans un tube de 15 mL. Ajouter 5 mL de DMEM/F12 dans le tube pour laver les cellules. Centrifuger à 200 x g pendant 5 min. Retirer le surnageant et ressuspender les cellules dans 2 mL de milieu B.
6. Vérifiez la concentration cellulaire et la viabilité par coloration Trypan Blue et un hémocytomètre. Calculer le volume de suspension nécessaire pour contenir 1 x 10⁶ cellules viables au total.
7. Transférer la suspension cellulaire contenant 1 x 10 6 cellules dans^chaque puits d’une plaque de 24 puits avec des micropuits. Ajouter le milieu B jusqu’à 2 mL dans chaque puits, pipeter doucement les cellules de haut en bas plusieurs fois, et centrifuger brièvement 100 x g pendant 1 min pour capturer les cellules dans les micropuits.
   REMARQUE: Le nombre de cellules par puits ne doit pas dépasser 1 x 10⁶. Sinon, les sphéroïdes des micropuits voisins fusionnent.
8. Vérifiez au microscope que les cellules sont réparties uniformément dans les micropuits. Répétez le pipetage et la centrifugation si les cellules sont réparties de manière inégale.
9. Incuber la plaque pendant la nuit pour laisser les cellules s’agréger en sphéroïdes.

4. Obtention et culture d’organoïdes

1. Le lendemain matin (Jour 15), vérifiez la qualité des sphéroïdes au microscope. Assurez-vous qu’ils sont transparents et lisses, s’ils sont sains (Figure 2A, B). Recueillez soigneusement les sphéroïdes de chaque puits dans un tube de 15 mL, laissez les sphéroïdes précipiter par gravité pendant 2-3 minutes, puis retirez le surnageant.
2. Ajouter aux sphéroïdes 2 mL de la matrice décongelée pendant le même temps sur la glace. Mélanger doucement par pipetage et incuber à température ambiante pendant 30 min.
3. Pour laver l’excès de matrice, ajouter au tube 8 mL de milieu B. Pipette doucement, puis centrifuger le tube pendant 1 min à 100 x g.
   REMARQUE: Ne pas dépasser le temps et la vitesse de centrifugation pour éviter l’agrégation irréversible des sphéroïdes.
4. Retirez le surnageant. Ajouter au tube 2 mL de milieu B, pipeter doucement. Répartir la suspension sphéroïde entre deux mini-bioréacteurs, contenant chacun 4 mL de milieu B. Placer les mini-bioréacteurs dans une boîte de Petri de 15 cm pour éviter l’évaporation de l’eau et éviter la contamination.
5. Mettez la boîte de Petri avec des mini-bioréacteurs sur un agitateur orbital. Cultivez les organoïdes à une vitesse de rotation de 70-75 tr / min.
6. Le jour 16, préparez le milieu C (tableau 4).
7. Transférer les organoïdes dans un tube de 15 mL. Pendant 5 min, laissez-les tomber au fond, aspirez le surnageant, ajoutez 5 mL de milieu C. Retournez les organoïdes dans les mini-bioréacteurs.
   REMARQUE: Veillez à ne pas perdre les sphéroïdes, qui sont transparents et à peine visibles.
8. Cultivez les sphéroïdes en C moyen pendant deux semaines, en rafraîchissant le milieu tous les deux jours. À la fin de ces deux semaines, laissez environ 100 sphéroïdes par mini bioréacteur pour la culture suivante. Congeler les sphéroïdes excessifs dans un milieu de congélation dans de l’azote liquide.
9. Le jour 30, préparez le milieu D (Tableau 5).
10. Changez le milieu de culture en milieu D, qui est un milieu de maturation. Rafraîchir le milieu de culture tous les 2-3 jours pendant trois semaines, puis utiliser le milieu D sans BDNF et GDNF.

Résultats

Le schéma de protocole est illustré à la figure 1. Le protocole comprenait cinq milieux dans lesquels les CSPe se différenciaient en organoïdes cérébraux pendant au moins un mois. La différenciation a commencé puis les CSPe ont atteint la confluence de 75 à 90 %(Figure 2A,B). Les premiers signes de différenciation vers les neurones ont été observés aux jours 10 à 11 de la culture de l’iPSC dans le milieu A lorsque les cellules o...

Discussion

Le protocole décrit comporte deux étapes cruciales permettant la génération d’organoïdes de haute qualité de taille uniforme. Tout d’abord, les organoïdes se développent à partir de sphéroïdes qui sont presque identiques en nombre de cellules et en maturité cellulaire. Deuxièmement, les bioréacteurs faits maison fournissent à chaque organoïde un environnement uniforme, où les organoïdes ne s’encombrent pas ou ne collent pas ensemble.

La qualité cellulaire et l’état ...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
Advanced DMEM/F-12	Gibco	12634010	DMEM/F-12
AggreWell400	STEMCELL Technologies Inc	34425	24-well culture plate with microwells
B-27 Supplement	Gibco	17504044	Neuronal supplement B
GlutaMAX Supplement	Gibco	35050061	200 mM L-alanyl-L-glutamine
Human BDNF	Miltenyi Biotec	130-096-285
Human FGF-2	Miltenyi Biotec	130-093-839
Human GDNF	Miltenyi Biotec	130-096-290
KnockOut Serum Replacement	Gibco	10828028	Serum replacement
mTESR1	STEMCELL Technologies Inc	85850	Pliripotent stem cell medium
N2 Supplement	Gibco	17502001
Neurobasal Medium	Gibco	21103049	Basal medium for neuronal cell maintenance
Penicillin-Streptomycin Solution	Gibco	15140130
Plasmocin	InvivoGen	ant-mpt-1	Antimicrobials
Purmorphamine	EMD Millipore	540220
StemMACS Y27632	Miltenyi Biotec	130-106-538	Y27632
StemMACS Dorsomorphin	Miltenyi Biotec	130-104-466	Dorsomorphin
StemMACS LDN-193189	Miltenyi Biotec	130-106-540	LDN-193189
StemMACS SB431542	Miltenyi Biotec	130-106-543	SB431542
Trypan Blue Solution	Gibco	15250061
Versen solution	Gibco	15040066	0.48 mM EDTA in PBS
β-mercaptoethanol	Gibco	31350010