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요약

여기에서 우리는 인간 유도한 다능성 줄기 세포 (iPSCs)에서 두뇌 유기체를 생성하기 위한 프로토콜을 기술합니다. 다량의 뇌 오르가노이드와 고품질의 뇌 오르가노이드를 얻기 위해, 우리는 집에서 만든 미니 생물 반응기를 사용합니다.

초록

iPSC 유래 뇌 오르가노이드는 신경계 및 약물 검진의 병리를 모델링하는 시험관 내 유망한 기술입니다. 이 기술은 최근에 등장했습니다. 아직 초기 단계에 있으며 아직 해결되지 않은 몇 가지 제한이 있습니다. 현재 프로토콜은 약물 발견 및 전임상 연구를 위해 오르가노이드를 얻는 것이 충분히 일관되지 않습니다. 오르가노이드의 성숙은 1 년까지 걸릴 수 있습니다, 동시에 여러 분화 프로세스를 시작하는 연구원을 밀어. 그것은 공간과 장비의 측면에서 실험실에 대한 추가 비용을 부과한다. 또한, 뇌 오르가노이드는 종종 중앙에 괴사 영역을 가지고, 이는 영양소와 산소 결핍으로 고통. 따라서, 대부분의 현재 프로토콜은 영양을 개선하기 위해 배양 매체에 대한 순환 시스템을 사용합니다.

한편, 오르가노이드 재배를 위한 저렴한 동적 시스템이나 생물 반응기는 없습니다. 이 논문은 컴팩트하고 저렴한 수제 미니 바이오 리액터에서 뇌 오르가노이드를 생산하기위한 프로토콜을 설명합니다. 이 프로토콜은 대량으로 고품질 의 오르가노이드를 얻을 수 있습니다.

서문

인간 iPSC 유래 모델은 신경 발달 및 신경 퇴행성 질환1의연구에서 널리 사용된다. 지난 10 년 동안, 3D 뇌 조직 모델, 소위 뇌 오르가노이드, 본질적으로 전통적인 2D 신경 문화를 보완2. 오르가노이드는 배아 뇌의 3D 아키텍처를 어느 정도 재구성하고 보다 정확한 모델링을 허용합니다. 대뇌 피질3,4,5,소뇌6,중뇌, 전뇌, 시상하부7,8,9,해마10: 많은 프로토콜은 다른 뇌 영역을 나타내는 오르가노이드의 생성을 위해 게시된다. 인간 신경계 질환을 연구하기 위해 오르가노이드를 사용하는 여러 가지 예가있었다(11). 또한, 오르가노이드는 약물발견(12)에서 구현되었고 SARS-Cov-213,14를포함한 전염병 연구에 사용되었다.

뇌 오르가노이드는 직경이 최대 몇 밀리미터에 달할 수 있습니다. 따라서 오르가노이드의 내부 영역은 저산소증이나 영양실조로 고생하고 결국 괴사가 될 수 있습니다. 따라서, 많은 프로토콜은 특수 생물 반응기8,셰이커, 또는 미세 유체시스템(15)을포함한다. 이러한 장치는 고가의 세포 배양 매체의 대량을 요구할 수 있다. 또한 이러한 장비의 비용은 일반적으로 높습니다. 일부 생물 반응기는 재사용을 위해 살균하기 어렵게 만드는 많은 기계적 부품으로 구성됩니다.

대부분의 프로토콜은 동일한 iPSC에서 얻은 오르가노이드 간에 상당한 변동성을 생성하는 "배치 효과"16으로인해 어려움을 겪습니다. 이 가변성은 균일성을 요구하는 약물 검사 또는 전임상 연구를 방해합니다. 균일 한 크기의 오르가노이드를 선택할 만큼 충분히 오르가노이드의 높은 수율은 부분적으로이 문제를 해결할 수 있습니다.

시간 계수도 중요한 문제입니다. 마쓰이 외(2018)는 뇌 오르가노이드가 성숙도17에도달하기 위해서는 최소 6개월이 필요하다는 것을 보여주었다. Trujillo 외(2019)는 또한 전기생리활성이 6개월간의 재배 후18일후에만 오르가노이드에서 발생했다는 것을 입증하였다. 긴 오르가노이드 성숙 시간으로 인해 연구자들은 종종 이전 을 완료하기 전에 새로운 차별화를 시작합니다. 차별화의 여러 병렬 프로세스에는 추가 비용, 장비 및 실험실 공간이 필요합니다.

최근에는 19위에 언급된 문제를 주로 해결하는 미니 바이오반응기를개발했습니다. 이 집에서 만든 생물 반응기는 중앙에 플라스틱 노브가있는 초저 접착 또는 처리되지 않은 페트리 접시로 구성되어 있습니다. 이 플라스틱 노브는 셰이커의 회전에 의해 발생하는 페트리 접시의 중심에 오르가노이드의 혼잡과 그들의 응축을 방지합니다. 이 논문은 이 저렴하고 간단한 수제 미니 바이오 리액터가 어떻게 고품질의 뇌 오르가노이드를 대량으로 생성할 수 있는지 설명합니다.

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프로토콜

참고 : 1.2 단계와 1.3 단계를 제외하고 프로토콜 전체에 멸균 기술을 사용합니다. 세포 나 오르가노이드에 적용하기 전에 모든 배양 매체와 솔루션을 37 °C로 따뜻하게하십시오. CO2 인큐베이터에서 80% 습도에 따라 5% CO2에서 37°C에서 세포를 재배합니다. 프로토콜 구성표는 그림 1에표시됩니다.

1. 페트리 접시를 미니 바이오 반응기로 변환

  1. 높이 7-8mm의 고리에 멸균 15 mL 원심분리기 튜브를 잘라; 링을 자동 복제합니다.
  2. 낮은 접착, 치료되지 않은 또는 미생물 페트리 접시를 부스러기로 나누기. 액체 플라스틱을 준비하기 위해 밤새 10mL의 클로로포름에 플라스틱 부스러기 1 g을 녹입니다.
    주의: 연기 후드에서 작업합니다.
  3. 결과 액체 플라스틱이 파이펫팅에 충분히 점성이 있는지 확인하십시오. 그 드롭구형 형태를 유지하고 표면에 확산되지 않습니다. 매우 액체인 경우 플라스틱 부스러기를 더 추가합니다. 두꺼운 경우 클로로폼을 추가합니다.
  4. 멸균 초저 접착 6cm 페트리 접시의 중앙에 플라스틱 손잡이를 만드십시오. 아래에 자세히 설명된 두 가지 적절한 방법이 있습니다.
    1. 오토클레이브 플라스틱 링을 중앙에 놓고 액체 플라스틱을 링 안쪽에 놓습니다.
    2. 플라스틱 링없이 페트리 접시의 중앙에 액체 플라스틱을 떨어 뜨립니다.
  5. 건조될 때까지 라미나르 플로우 후드에 2-3시간 동안 요리를 열어 둡니다. 말린 요리는 15-20 분 동안 자외선으로 처리하십시오.

2. iPSC의 신경 분화 유도

  1. 다능성 줄기 세포를 위한 매체에서 iPSCs를 35mm 페트리 접시에 세포외 단백질로 구성된 매트릭스로 미리 코팅하여 최대 75-90% 결합하도록 경배합니다.
  2. 중간 크기 A-SR을 준비합니다. 자세한 내용은 표 1을 참조하십시오.
  3. 재배 배지를 흡인하고 0일째에 A-SR 배지2mL를 첨가한다.
  4. 중간 크기 A를 준비합니다(표 2참조).
  5. 2-14일부터 2주 동안 중간 크기의 A에서 세포를 재배하고, 페트리 요리에 매번 상쾌한 매체를 재배합니다.

3. 14일째에 신경피상전구체 세포에서 스페로이드형성

  1. 14일째되는 날, 각우물(도 2C)에약 1,200마이크로웰을 함유한 특수 24웰 배양판을 사용하여 신경전구체로부터 스페로이드를 만듭니다. 아래에 주어진 절차를 따르십시오.
    참고 : 이 분화 단계에서 35mm 페트리 접시에는 보통 3 -3.5 x 106 신경 전구체 세포가 들어 있습니다. 따라서, 신경전구체 세포를 가진 35mm 페트리 접시 1개는 마이크로웰이 있는 24웰 배양판의 3-4웰에 충분합니다.
  2. 마이크로웰이 장착된 24웰 배양 판을 준비: 각 웰에 1mL의 중간 A. 원심분리기를 1,300 x g에 5분 간 간단히 추가합니다. 마이크로웰에 거품이 없다는 현미경의 밑에 통제합니다.
  3. 중간 값 B(표 3)를준비합니다.
  4. 신경 피상화 전구체 세포와 페트리 접시에서 배지를 제거; DMEM/F12의 2mL로 셀을 세척합니다. 세포 분리의 경우, PBS에서 제조된 0.48 mM EDTA 용액의 1.5mL로 세포를 치료한다. 현미경의 밑에 세포 분리를 통제합니다.
  5. 세포를 15mL 튜브로 수확합니다. 세포를 세척하기 위해 튜브에 DMEM / F125 mL을 추가합니다. 원심 분리기 200 x g에서 5 분 동안. 중간 형 B의 2 mL에서 상체를 제거하고 세포를 다시 중단합니다.
  6. Trypan Blue 염색 및 혈종계에 의해 세포 농도 및 생존가능성을 확인하십시오. 총 1 x 106 실행 가능한 셀을 포함하는 데 필요한 서스펜션의 양을 계산합니다.
  7. 마이크로웰이 있는 24웰 플레이트의 각 웰에 1 x 106 세포를 포함하는 세포 현탁액을 전달합니다. 중간 크기 B를 각 우물에 최대 2mL로 추가하고, 부드럽게 파이펫 셀을 여러 번 내리고, 원심분리기는 1분 동안 짧게 100 x g씩 미세웰에서 세포를 포획합니다.
    참고: 웰당 셀 수는 1 x 106을초과해서는 안 됩니다. 그렇지 않으면, 이웃 마이크로웰에서 스페로이드퓨즈.
  8. 세포가 마이크로웰에 고르게 분포되어 있다는 현미경의 밑에 확인하십시오. 세포가 고르지 않게 분포되는 경우 파이프팅 및 원심분리를 반복합니다.
  9. 세포를 스페로이드로 집계할 수 있도록 밤새 플레이트를 배양합니다.

4. 오르가노이드의 획득 및 재배

  1. 다음날 아침(15일)은 현미경으로 스페로이드의 품질을 확인합니다. 건강하다면 투명하고 매끄러운지 확인하십시오(그림2A,B). 각 우물에서 15mL 튜브로 스페로이드를 조심스럽게 수집하고, 스페로이드를 2-3분 동안 중력에 의해 침전한 다음 상체를 제거합니다.
  2. 얼음에 동시에 해동 매트릭스의 스페로이드 2 mL에 추가합니다. 피펫팅으로 부드럽게 섞고 실온에서 30분 동안 배양합니다.
  3. 매트릭스의 과잉을 세척하려면, 튜브에 중간 값 B. 파이펫을 부드럽게 추가 한 다음 100 x g에서1 분 동안 튜브를 원심 분리합니다.
    참고: 스페로이드의 돌이킬 수 없는 응집을 피하기 위해 원심 분리의 시간과 속도를 초과하지 마십시오.
  4. 상부체를 제거합니다. 튜브에 중간 B, 파이펫을 부드럽게 넣습니다. 스페로이드 현탁액을 2개의 미니 바이오 반응기로 분할하여 각각 4mL의 중간 B를 함유하고 있으며, 미니 바이오액터를 15cm 페트리 접시에 놓아 물의 증발을 방지하고 오염을 방지합니다.
  5. 페트리 접시에 미니 바이오 리액터를 궤도 셰이커에 놓습니다. 70-75 rpm의 회전 속도로 오르가노이드를 재배합니다.
  6. 16일째에 중간C(표 4)를준비한다.
  7. 오가노이드를 15mL 튜브로 옮기습니다. 5 분 동안, 그들은 바닥에 떨어질 수 있도록, 슈퍼 나티를 흡인, 중간 C. 미니 생물 반응기에 오르가노이드를 반환의 5 mL을 추가.
    참고: 투명하고 거의 보이지 않는 스페로이드를 잃지 않도록 주의하십시오.
  8. 중간 C에서 2 주 동안 스페로이드를 재배하고 2 일마다 배지를 상쾌하게합니다. 이 2 주 말에, 다음 재배를 위해 미니 생물 반응기 당 약 100 스페로이드를 둡니다. 액체 질소의 동결 배지에 과도한 스페로이드를 동결합니다.
  9. 30일째에 중간D(표 5)를준비합니다.
  10. 성숙 배지인 중간 D로 재배 매체를 변경한다. 3 주 동안 2-3 일마다 재배 배지를 새로 고친 다음 BDNF 및 GDNF없이 중간 D를 사용합니다.

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결과

프로토콜 구성표는 그림 1에표시됩니다. 프로토콜에는 iPSC가 적어도 한 달 동안 뇌 오르가노이드로 분화된 5개의 미디어가 포함되어 있습니다. 차별화는 iPSC가 75-90%의합류(그림 2A,B)에도달한 후 시작되었다. 세포가 "로제트"(도2C)로클러스터되기 시작했을 때 중간 A에서 iPSC 재배의 일 10-11일에 신경을 향한 분화의 첫 ?...

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토론

설명된 프로토콜에는 균일한 크기의 고품질 오르가노이드생성을 허용하는 두 가지 중요한 단계가 있습니다. 첫째, 오르가노이드는 세포 수와 세포 성숙도에서 거의 동일한 스페로이드에서 증가합니다. 둘째, 집에서 만든 생물 반응기는 각 오르가노이드가 군중이나 함께 붙어 있지 않는 균일 한 환경을 제공합니다.

세포 의 질과 세포 성숙의 상태는 프로토콜을 수행하는 데 ?...

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공개

저자는 공개 할 것이 없습니다.

감사의 말

이 작품은 러시아 연방 과학 고등 교육부 (RT-PCR 분석)의 보조금 075-15-2019-1669 및 러시아 과학 재단 (다른 모든 작업에 대한)에서 19-15-00425 호를 지원했습니다. 저자는 또한 비디오 편집에 대한 그의 도움에 대한 파벨 벨리코프에게 감사드립니다. 원고의 수치는 BioRender.com 함께 만들어졌습니다.

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자료

NameCompanyCatalog NumberComments
Advanced DMEM/F-12Gibco12634010DMEM/F-12
AggreWell400STEMCELL Technologies Inc3442524-well culture plate with microwells
B-27 SupplementGibco17504044Neuronal supplement B
GlutaMAX SupplementGibco35050061200 mM L-alanyl-L-glutamine
Human BDNFMiltenyi Biotec130-096-285
Human FGF-2Miltenyi Biotec130-093-839
Human GDNFMiltenyi Biotec130-096-290
KnockOut Serum ReplacementGibco10828028Serum replacement
mTESR1STEMCELL Technologies Inc85850Pliripotent stem cell medium
N2 SupplementGibco17502001
Neurobasal MediumGibco21103049Basal medium for neuronal cell maintenance
Penicillin-Streptomycin SolutionGibco15140130
PlasmocinInvivoGenant-mpt-1Antimicrobials
PurmorphamineEMD Millipore540220
StemMACS Y27632Miltenyi Biotec130-106-538Y27632
StemMACS DorsomorphinMiltenyi Biotec130-104-466Dorsomorphin
StemMACS LDN-193189Miltenyi Biotec130-106-540LDN-193189
StemMACS SB431542Miltenyi Biotec130-106-543SB431542
Trypan Blue SolutionGibco15250061
Versen solutionGibco150400660.48 mM EDTA in PBS
β-mercaptoethanolGibco31350010

참고문헌

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