ملاقط مغناطيسية في شكل صفيحة دقيقة

Summary

هنا ، نصف استخدام مقايسة صفيحة دقيقة جديدة لتمكين التلاعب الميكانيكي بالجزيئات الحيوية أثناء إجراء فحوصات كيميائية حيوية جماعية. يتم تحقيق ذلك باستخدام غطاء صفيحة دقيقة معدل بمغناطيس لإنشاء ملاقط مغناطيسية ثابتة متعددة عبر الصفيحة الدقيقة.

Abstract

يصف علم الأحياء الميكانيكي كيف تساهم القوى الفيزيائية والخصائص الميكانيكية للمادة البيولوجية في علم وظائف الأعضاء والمرض. عادة ما تكون هذه الأساليب عبارة عن طرق محدودة أحادية الجزيء ، مما يحد من توافرها. لتلبية هذه الحاجة ، تم تطوير اختبار صفيحة دقيقة تتيح التلاعب الميكانيكي أثناء إجراء فحوصات كيميائية حيوية قياسية. يتم تحقيق ذلك باستخدام مغناطيسات مدمجة في غطاء صفيحة دقيقة لإنشاء ملاقط مغناطيسية متعددة. في هذا الشكل ، تمارس القوة عبر الجزيئات الحيوية المتصلة بالخرز المغناطيسي ، أي ما يعادل الملقط المغناطيسي النموذجي. توضح الدراسة تطبيق هذه الأداة مع المقايسات القائمة على FRET لمراقبة مطابقات البروتين. ومع ذلك ، فإن هذا النهج قابل للتطبيق على نطاق واسع على الأنظمة البيولوجية المختلفة التي تتراوح من قياس النشاط الأنزيمي إلى تنشيط مسارات الإشارات في الخلايا الحية.

Introduction

يركز علم الأحياء الميكانيكي على فهم كيف ينظم انتشار القوى الفيزيائية داخل الخلايا وبينها النشاط الخلوي^1،2 وكيف يرتبط ذلك بتنظيم وديناميكيات كل من البروتينات والخلايا.

كشفت قياسات قوة الجزيء الواحد عن كيفية استخدام القوة في الأنظمة البيولوجية ، من البروتينات المفردة إلى الخلايا والأنسجة الكاملة^{3،4،5،6،7}. تتطلب هذه التجارب الصعبة معدات متخصصة وخبرة تقنية. على العكس من ذلك ، يمكن إجراء فحوصات كيميائية حيوية قياسية بإنتاجية أعلى في المعدات التجارية المتاحة بسهولة.

هنا ، تصف الدراسة اختبار علم الأحياء الميكانيكي الذي يتيح إجراء التلاعب القائم على الملقط المغناطيسي والمقايسات الكيميائية الحيوية معا⁸. يتم وضع المغناطيس على غطاء صفيحة دقيقة مطبوعة ثلاثية الأبعاد (الشكل 1A-D) ، مما يتيح استخدام قارئات الألواح التجارية للمقايسات. يتم تطبيق القوة عبر الجزيء الحيوي المعني عن طريق اقتران الجزيء بالجسيمات المغناطيسية. ثم يمارس المغناطيس توترا عبر الجزيء. يؤدي تغيير المسافة بين الجسيمات والمغناطيس إلى ضبط القوة المبذولة عبر الجزيء الحيوي (الشكل 1E).

نحن نمثل استخدام هذا الاختبار باستخدام المحرك الجزيئي القائم على الأكتين ، Myosin VI. يتم تنظيم Myosin VI عن طريق الطي الخلفي داخل الجزيئات⁹. ثبت أن الميوسين السادس موجود في حالة تثبيط تلقائي ، حيث يؤدي ارتباط البروتينات الشريكة ، مثل NDP52 ، إلى ظهور الميوسين السادس^10،11. لإجراء هذه الفحوصات ، سنستخدم بنية مزدوجة التسمية لمجال ذيل الميوسين VI مع Gfp الطرفي N و C-Terminal RFP حيث يولد الطي الخلفي للبروتين نقل طاقة الرنين الفلوري (FRET) بين GFP و RFP. تحمل المحطة N أيضا علامة البيوتينيل لتثبيت البروتين على السطح. نستخدم هذا الاختبار مع قياسات FRET لإظهار كيف يمكن للقوة أن تؤثر على طي الميوسين السادس للخلف.

Protocol

تم العثور على عينة من البروتينات المطلوبة لهذه التجربة وقائمة الكواشف في جدول المواد. يجب إنتاج بروتينات مكافئة لنظام دراسة المستخدم لقياس تغيرات التشكل.

غطاء مغناطيسي مطبوع 1. 3D

1. صمم غطاء صفيحة دقيقة لإيواء المغناطيس داخل صفيحة دقيقة 24 بئرا. يمكن تنزيل مثال لملف CAD من GitHub¹². القياسات موضحة في الشكل 1.
   ملاحظة: يمكن تغيير ارتفاع قاعدة التمثال لتغيير المسافة بين المغناطيس والسطح لتغيير القوة المطبقة. بالإضافة إلى ذلك ، تعتمد القوة النهائية التي تمارس على الجسيم على حجم الجسيمات والفجوة بين زوج المغناطيس. معادلات لحساب القوة المطبقة لجسيمات 1 ميكرومتر و 2.8 ميكرومتر عند فجوات 0.5 مم و 1 مم و 2 مم مذكورة في دوس سانتوس ^{وآخرون8}. بالنسبة للتجارب الموضحة هنا مع جسيمات 2.8 ميكرومتر وفجوة 2 مم ، استخدم المعادلة 1.
   المعادلة 1:
2. طباعة ثلاثية الأبعاد غطاء صفيحة دقيقة باستخدام البولي إيثيلين تيريفثاليت جلايكول (PETG) على نظام طابعة ثلاثية الأبعاد.
   ملاحظة: استخدم طابعة بدقة طبقة تبلغ 0.02 مم لتمكين الدقة وقابلية التكرار. تمت مناقشة تأثير دقة الطابعة في Dos Santos et ^al.8.
3. قم بإرفاق أزواج من مغناطيس النيوديميوم N42 المكعب مقاس 5 مم باستخدام مادة لاصقة على الركائز مع توجيه الأقطاب المغناطيسية لإنشاء المجال الموجه نحو الجزء السفلي من الصفيحة الدقيقة.
4. اترك وضعا واحدا على الأقل فارغا ليكون بمثابة عنصر تحكم بدون مغناطيس.
5. يحفظ في وعاء محكم الغلق بحجم كاف لوضع الغطاء وإزالته بسهولة.

2. تعديل سطح الصفيحة الدقيقة

1. خذ صفيحة زجاجية نظيفة غير معالجة ذات قاع زجاجي 24 بئر.
2. اغسل الآبار 3x باستخدام 500 ميكرولتر من محلول الغسيل (50 ملي مولار Tris-HCl (درجة الحموضة 7.5) و 50 ملي كلوريد الصوديوم) في درجة حرارة الغرفة.
3. أضف 200 ميكرولتر من البيوتين BSA (0.2 مجم / مل) في مخزن الغسيل واتركه دون إزعاج لمدة 15 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.
   ملاحظة: يستخدم البيوتين-BSA لكل من التخميل والمرفق. يمكن استخدام استراتيجيات التخميل وربط السطح الأخرى. للاستخدام والتحسين لأول مرة ، يمكن أن يختلف تركيز البيوتين BSA حتى 1 مجم / مل.
4. اغسل الآبار 3 مرات باستخدام 500 ميكرولتر من محلول الغسيل.
5. أضف 200 ميكرولتر من الستربتافيدين (20 ميكروغرام / مل) في مخزن الغسيل واتركه دون إزعاج لمدة 15 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.
   ملاحظة: للاستخدام لأول مرة ، يمكن أن يختلف تركيز الستربتافيدين حتى 1 مجم / مل.
6. قم بإزالة المحلول ثم اغسل الآبار 3x باستخدام محلول الغسيل.
7. قم بتغطية الآبار ب 500 ميكرولتر من محلول الغسيل.
8. يحفظ في درجة حرارة 4 درجات مئوية حتى يصبح جاهزا للاستخدام. يجب استخدام اللوحات في نفس اليوم.

3. إعداد العينة: تثبيت البروتين

1. اسمح للصفيحة الدقيقة المعدلة بالسطح بالوصول إلى درجة حرارة الغرفة.
2. اغسل الآبار ب 500 ميكرولتر من محلول الغسيل.
3. أضف 100 نانومتر من البيوتين-eGFP-Myosin VI Tail-mRFP (بروتين عينة المخزون) واحتضنه لمدة 15 دقيقة في درجة حرارة الغرفة في مخزن الغسيل.
   ملاحظة: يتم إنتاج هذا المثال من البروتين كما هو موضح من قبل دوس سانتوس وآخرون ⁸. يمكن أن تختلف أوقات التركيزات والحضانات حسب البروتين.
4. اغسل الآبار 3 مرات باستخدام 500 ميكرولتر من محلول الغسيل.
5. قم بإعداد قارئ اللوحة لتسجيل أطياف التألق ل GFP (الإثارة 490 نانومتر والانبعاث 510-600 نانومتر) و RFP (الإثارة 560 نانومتر والانبعاث 580-650 نانومتر) لتأكيد وجود بروتينات الاندماج.
6. إذا كان هناك نقص في البروتين ، فقم بزيادة التركيز في الخطوة 3.3.
   ملاحظة: يمكن أن يرتبط الارتباط الضعيف بعدم كفاية ارتباط البيوتين BSA و / أو الستربتافيدين ، وبالتالي ، يمكن زيادة الكميات بمقدار 10 أضعاف.
7. إذا أمكن ، قم بإجراء قياس جيد لتحديد ما إذا كان بروتين الاندماج مرتبطا عبر الصفيحة الدقيقة (الشكل 2).
   ملاحظة: سيسجل هذا القياس شدة التألق في نقاط محددة عبر بئر الصفيحة الدقيقة. سيكشف ما إذا كان البروتين مرتبطا عبر البئر.
8. تأكد من أن الإشارة موحدة (في حدود 5٪) في وسط البئر حيث يحدث قياس الفحص.

4. إعداد حبة مغناطيسية

1. دوامة قارورة من 2.8 ميكرومتر حبات مغناطيسية مع البروتين المؤتلف أ (جدول المواد) لمدة 30 ثانية لإعادة تعليق الخرز.
2. انقل الحجم المقابل ل 1 ملغ من الخرز المغناطيسي إلى أنبوب 1.5 مل.
3. ضع الأنبوب في عازل مغناطيسي (جدول المواد) ثم قم بإزالة المادة الطافية.
4. أعد تعليق الخرزات في 200 ميكرولتر من PBS عن طريق سحب المحلول برفق لأعلى ولأسفل.
5. ضع الأنبوب في العازل المغناطيسي ثم قم بإزالة المادة الطافية.
6. كرر خطوة الغسيل 3x.
7. تمييع 10 ميكروغرام من الجسم المضاد لطلب تقديم العروض في 200 ميكرولتر من PBS.
8. اعزل الخرزات في المعزل المغناطيسي ثم أعد تعليقها في محلول الجسم المضاد.
9. قم بالتدوير عند 20 دورة في الدقيقة لمدة 10 دقائق في درجة حرارة الغرفة على دوار على طاومة.
10. ضع الأنبوب في العازل المغناطيسي وقم بإزالة المادة الطافية.
11. اغسل 3x في PBS.
12. أعد تعليق الخرزات في 200 ميكرولتر من محلول الغسيل.
13. لتأكيد تجميد الأجسام المضادة على الخرزات ، قم باحتضان الخرزات المحملة بالأجسام المضادة بمحلول >1 ميكرومتر بروتين اندماج RFP.
    ملاحظة: تأكد بصريا مما إذا كان البروتين معزولا بواسطة الخرز.
14. بدلا من ذلك ، قم بقياس شدة التألق للطافية (الإثارة 560 نانومتر والانبعاث 580-650 نانومتر) لطلب تقديم العروض في مطياف الفلورة.

5. إعداد العينة: مرفق حبة

1. أضف 10 ميكروغرام من اندماج الأجسام المضادة للحبة المغناطيسية المخفف في مخزن الغسيل (200 ميكرولتر) إلى آبار الصفيحة الدقيقة المرتبطة بالبروتين.
2. لا تضع الخرز في بئر تحكم واحد للتحقق من تأثير الخرز على إشارة الفلورسنت. قم بإعداد عينة تحكم بدون أجسام مضادة لتحديد أي تفاعلات غير محددة مع الخرز.
3. احتضان الصفيحة الدقيقة في درجة حرارة الغرفة لمدة 30 دقيقة.
4. اغسل الآبار 3 مرات باستخدام 500 ميكرولتر من محلول الغسيل.
5. إذا كانت متوفرة محليا ، فتحقق من أن الخرزات مرتبطة بالسطح على مجهر المجال الساطع. إذا كان هناك نقص في الخرز ، فقم بزيادة التركيز في الخطوة 5.1 إلى 500 ميكروغرام / مل.

6. الحصول على البيانات

1. ضع الصفيحة الدقيقة ، بدون غطاء ، في قارئ لوحة الفلورسنت عند 25 درجة مئوية.
2. قم بإعداد قارئ اللوحة لتسجيل أطياف التألق ل GFP (الإثارة 490 نانومتر والانبعاث 510-600 نانومتر) و RFP (الإثارة 560 نانومتر والانبعاث 580-650 نانومتر) لتأكيد وجود بروتينات الاندماج.
   ملاحظة: قم بقياس / تسجيل أطياف التألق من خلال الجزء السفلي من الصفيحة الدقيقة لوضع الغطاء في الأعلى. لذلك ، يجب اختيار قارئ دقيق مناسب.
3. سجل طيف مضان FRET (إثارة 490 نانومتر وانبعاث 510-650 نانومتر) ، أو راقب التألق عند 510 نانومتر و 610 نانومتر مع الإثارة عند 490 نانومتر. يتم إعداد هذا وفقا لإرشادات الشركة المصنعة.
4. قم بإزالة الصفيحة الدقيقة من القارئ وأضف الغطاء المغناطيسي.
5. ارجع إلى قارئ اللوحة واترك العينة لمدة 2 دقيقة.
6. كرر قياس FRET ، كما في الخطوة 6.3.

7. تحليل البيانات

1. تصدير البيانات للاستيراد إلى جدول بيانات (على سبيل المثال، Excel).
2. استخرج البيانات يدويا ل GFP للمتبرع عند 510 نانومتر وطلب تقديم العروض عند 610 نانومتر.
3. احسب FRET النسبي باستخدام المعادلة 2 لكل شرط.
   المعادلة 2:
   أ: شدة المستقبل (RFP 610 نانومتر) ، د: شدة المتبرع (GFP 510 نانومتر).
   ملاحظة: استخدم طلب تقديم العروض المؤتلف في ظل نفس ظروف الإثارة والانبعاث للتحكم في إثارة الخلفية للمتقبل.

النتائج

يوضح الشكل 2 مثالا على قياس المسح الضوئي جيدا حيث تم تسجيل شدة التألق ل GFP على فترات 1 مم عبر بئر الصفيحة الدقيقة. يتم إجراء قياسات التألق النموذجية في الموضع المركزي لبئر الصفيحة الدقيقة (الموضع 8,8 في الشكل 2) ؛ لذلك ، من المهم أن يكون هناك بر...

Discussion

يتيح هذا النهج تطبيق القياسات القائمة على القوة بسهولة في صفيحة دقيقة باستخدام قارئات الألواح الفلورية. الأهم من ذلك ، يفترض تنسيق الفحص هذا وجود بروتين وظيفي عندما يكون مرتبطا بسطح. لذلك ، هناك حاجة إلى معرفة مسبقة قبل الشروع في هذه القياسات للتأكد من وجود نشاط بروتيني....

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
24 well glass-bottom microplate	Cellvis	P24-1.5H-N	Multiple sources are available. Unless needed, it is best to avoid treated surfaces and we use Imaging grade glass N1.5.
Anti-RFP antibody	Abcam	ab290	Multiple sources are available but must ensure there is minimal reactivity with GFP.
Bench top light microscope	Optika	IM-3
Bench top Rotator	Cole-Palmer-Stuart	SB3
Biotin-BSA	Sigma Aldrich	A8549
CAD Software - Sketch Up Educator	Sketch Up		Alternative CAD softwares can be used. Users should ensure the file formats are compatiable with their 3D printer.
Dynabeads Protein A	Fisher Scientific	10746713	2.8 µm paramagnetic beads with recombinant Protein A
Impact contact adhesive	EVO-STIK
MagnaRack magnetic separation rack	ThermoFisher Scientific	CS15000	Magnetic Isolator
NaCl	Fisher Scientific	10316943
Neodymium N42 5mm cube Magnets	Supermagnete	W-05-N
Plate Reader - ClarioStar	BMG Labtech		All plate reader systems can be used where measurements are possible from under the microplate. The magnet lid excludes standard measurements from above
Streptavidin	Sigma Aldrich	189730
Tris-HCl	Fisher Scientific	10142400
Ultimaker PETG Filament	Ultimaker
Ultimaker S3 - 3D printer	Ultimaker