Magnetische Pinzette im Mikroplattenformat

Zusammenfassung

Hier beschreiben wir die Verwendung eines neuartigen Mikrotiterplatten-Assays, um die mechanische Manipulation von Biomolekülen bei der Durchführung von biochemischen Ensemble-Assays zu ermöglichen. Dies wird durch die Verwendung eines Mikrotiterplattendeckels erreicht, der mit Magneten modifiziert ist, um mehrere statische magnetische Pinzetten auf der Mikroplatte zu erzeugen.

Zusammenfassung

Die Mechanobiologie beschreibt, wie die physikalischen Kräfte und mechanischen Eigenschaften von biologischem Material zu Physiologie und Krankheit beitragen. In der Regel handelt es sich bei diesen Ansätzen um begrenzte Einzelmolekülmethoden, was ihre Verfügbarkeit einschränkt. Um diesem Bedarf gerecht zu werden, wurde ein Mikrotiterplatten-Assay entwickelt, der eine mechanische Manipulation bei gleichzeitiger Durchführung biochemischer Standardassays ermöglicht. Dies wird durch Magnete erreicht, die in einen Mikroplattendeckel integriert sind, um mehrere magnetische Pinzetten herzustellen. Bei diesem Format wird die Kraft auf Biomoleküle ausgeübt, die mit paramagnetischen Kügelchen verbunden sind, was einer typischen magnetischen Pinzette entspricht. Die Studie zeigt die Anwendung dieses Werkzeugs mit FRET-basierten Assays zur Überwachung von Proteinkonformationen. Dieser Ansatz ist jedoch auf verschiedene biologische Systeme anwendbar, die von der Messung der enzymatischen Aktivität bis hin zur Aktivierung von Signalwegen in lebenden Zellen reichen.

Einleitung

Die Mechanobiologie konzentriert sich auf das Verständnis, wie die Ausbreitung physikalischer Kräfte innerhalb und zwischen Zellen die zelluläre Aktivität reguliert ^1,2 und wie dies mit der Organisation und Dynamik von Proteinen und Zellen korreliert.

Einzelmolekül-Kraftmessungen haben gezeigt, wie Kraft in biologischen Systemen genutzt wird, von einzelnen Proteinen bis hin zu ganzen Zellen und Geweben 3,4,5,6,7. Diese anspruchsvollen Experimente erfordern spezielle Ausrüstung und technisches Know-how. Umgekehrt können biochemische Standard-Assays mit höherem Durchsatz in leicht verfügbaren kommerziellen Geräten durchgeführt werden.

Hier beschreibt die Studie einen mechanobiologischen Assay, der es ermöglicht, magnetische Pinzetten-basierte Manipulation und biochemische Assays zusammen durchzuführen⁸. Die Magnete sind auf einem 3D-gedruckten Mikroplattendeckel platziert (Abbildung 1A-D), was die Verwendung kommerzieller Plattenleser für die Assays ermöglicht. Die Kraft wird auf das interessierende Biomolekül ausgeübt, indem das Molekül an paramagnetische Partikel gekoppelt wird. Die Magnete üben dann eine Spannung auf das Molekül aus. Durch Ändern des Abstands zwischen den Partikeln und den Magneten wird die auf das Biomolekül ausgeübte Kraft angepasst (Abbildung 1E).

Wir stellen die Verwendung dieses Assays unter Verwendung des aktinbasierten molekularen Motors Myosin VI dar. Myosin VI wird durch intramolekulare Rückfaltung^{reguliert 9}. Es wurde gezeigt, dass Myosin VI in einem autoinhibierten Zustand vorliegt, wobei die Bindung von Partnerproteinen, wie z.B. NDP52, die Entfaltung von Myosin VI auslöst^10,11. Um diese Assays durchzuführen, werden wir ein dual-markiertes Konstrukt der Myosin-VI-Schwanzdomäne mit einem N-terminalen GFP und einem C-terminalen RFP verwenden, wobei die Rückfaltung des Proteins einen Fluoreszenz-Resonanz-Energietransfer (FRET) zwischen GFP und RFP erzeugt. Der N-Terminus trägt auch eine Biotinylierungsmarkierung, um das Protein auf der Oberfläche zu immobilisieren. Wir verwenden diesen Assay in Kombination mit FRET-Messungen, um zu zeigen, wie sich die Kraft auf die Rückfaltung von Myosin VI auswirken kann.

Protokoll

Die für dieses Experiment benötigten Probenproteine und eine Liste der Reagenzien finden Sie in der Materialtabelle. Äquivalente Proteine sollten für das Studiensystem des Benutzers hergestellt werden, um Konformationsänderungen zu messen.

1. 3D bedruckter Magnetdeckel

1. Entwerfen Sie einen Mikrotiterplattendeckel, um die Magnete in einer 24-Well-Mikroplatte unterzubringen. Eine Beispiel-CAD-Datei kann von GitHub¹² heruntergeladen werden. Die Messungen sind in Abbildung 1 dargestellt.
   HINWEIS: Die Höhe des Sockels kann geändert werden, um den Abstand zwischen Magneten und Oberfläche zu ändern und die ausgeübte Kraft zu ändern. Darüber hinaus hängt die endgültige Kraft, die auf das Partikel ausgeübt wird, von der Partikelgröße und dem Spalt zwischen dem Magnetpaar ab. Gleichungen zur Berechnung der aufgewendeten Kraft für 1 μm und 2,8 μm Partikel bei Abständen von 0,5 mm, 1 mm und 2 mm sind in Dos Santos et ^al.8 angegeben. Für die hier beschriebenen Experimente mit 2,8 μm Partikeln und einem Abstand von 2 mm wird Gleichung 1 verwendet.
   Gleichung 1:
2. Drucken Sie einen Mikrotiterplattendeckel mit Polyethylenterephthalatglykol (PETG) in 3D auf einem 3D-Druckersystem.
   HINWEIS: Verwenden Sie einen Drucker mit einer Schichtauflösung von 0,02 mm, um Genauigkeit und Reproduzierbarkeit zu gewährleisten. Der Einfluss der Druckergenauigkeit wurde in Dos Santos et ^al.8 diskutiert.
3. Befestigen Sie Paare von 5-mm-Würfel-Neodym-N42-Magneten mit Klebstoff an den Sockeln, wobei die magnetischen Pole so ausgerichtet sind, dass das Feld auf den Boden der Mikroplatte gerichtet ist.
4. Lassen Sie mindestens 1 Position leer, um als magnetlose Steuerung zu fungieren.
5. In einem verschlossenen Behälter aufbewahren, der groß genug ist, um den Deckel leicht zu platzieren und zu entfernen.

2. Oberflächenmodifikation von Mikrotiterplatten

1. Nehmen Sie eine saubere, unbehandelte 24-Well-Mikroplatte mit Glasboden.
2. Waschen Sie die Wells 3x mit 500 μL Waschpuffer (50 mM Tris-HCl (pH 7,5) und 50 mM NaCl) bei Raumtemperatur.
3. Geben Sie 200 μl Biotin-BSA (0,2 mg/ml) in den Waschpuffer und lassen Sie ihn 15 min lang bei Raumtemperatur ungestört.
   HINWEIS: Biotin-BSA wird sowohl für die Passivierung als auch für die Befestigung verwendet. Andere Passivierungs- und Oberflächenbefestigungsstrategien können verwendet werden. Für die Erstanwendung und Optimierung kann die Konzentration von Biotin-BSA auf bis zu 1 mg/ml variiert werden.
4. Waschen Sie die Wells 3x mit 500 μL Waschpuffer.
5. Geben Sie 200 μl Streptavidin (20 μg/ml) in den Waschpuffer und lassen Sie ihn 15 Minuten lang bei Raumtemperatur ungestört.
   HINWEIS: Bei erstmaliger Anwendung kann die Konzentration von Streptavidin auf bis zu 1 mg/ml variiert werden.
6. Entfernen Sie die Lösung und waschen Sie die Vertiefungen dann 3x mit Waschpuffer.
7. Decken Sie die Vertiefungen mit 500 μl Waschpuffer ab.
8. Bis zur Verwendung bei 4 °C lagern. Die Platten sollten am selben Tag verwendet werden.

3. Probenvorbereitung: Protein-Immobilisierung

1. Lassen Sie die oberflächenmodifizierte Mikroplatte Raumtemperatur erreichen.
2. Waschen Sie die Vertiefungen mit 500 μl Waschpuffer.
3. 100 nM Biotin-eGFP-Myosin VI Tail-mRFP (Stammprobenprotein) zugeben und 15 min bei Raumtemperatur in Waschpuffer inkubieren.
   HINWEIS: Dieses Beispielprotein wird wie von Dos Santos et ^al.8 beschrieben produziert. Konzentrationen und Inkubationszeiten können je nach Protein variieren.
4. Waschen Sie die Wells 3x mit 500 μL Waschpuffer.
5. Richten Sie den Platten-Reader so ein, dass Fluoreszenzspektren für GFP (Anregung 490 nm und Emission 510-600 nm) und RFP (Anregung 560 nm und Emission 580-650 nm) aufgezeichnet werden, um das Vorhandensein der Fusionsproteine zu bestätigen.
6. Bei Proteinmangel ist die Konzentration bei Schritt 3.3 zu erhöhen.
   HINWEIS: Eine schlechte Bindung könnte mit einer unzureichenden Biotin-BSA- und/oder Streptavidin-Bindung zusammenhängen, weshalb die Mengen um das 10-fache erhöht werden können.
7. Wenn möglich, führen Sie eine Well-Scan-Messung durch, um festzustellen, ob das Fusionsprotein über die Mikroplatte gebunden ist (Abbildung 2).
   HINWEIS: Bei dieser Messung wird die Fluoreszenzintensität an bestimmten Punkten in der Mikrotiterplattenvertiefung aufgezeichnet. Es wird sich zeigen, ob das Protein über die Vertiefung gebunden ist.
8. Stellen Sie sicher, dass das Signal in der Mitte des Wells, in dem die Assay-Messung stattfindet, gleichmäßig (innerhalb von 5 %) ist.

4. Vorbereitung der magnetischen Beads

1. Wirbeln Sie das Fläschchen mit 2,8 μm paramagnetischen Kügelchen mit rekombinantem Protein A (Table of Materials) 30 s lang vortexen, um die Kügelchen zu resuspendieren.
2. Übertragen Sie das Volumen, das 1 mg paramagnetischen Kügelchen entspricht, in ein 1,5-ml-Röhrchen.
3. Legen Sie das Rohr in einen magnetischen Isolator (Materialtabelle) und entfernen Sie dann den Überstand.
4. Resuspendieren Sie die Kügelchen in 200 μl PBS, indem Sie die Lösung vorsichtig auf und ab pipettieren.
5. Setzen Sie das Röhrchen in den magnetischen Isolator ein und entfernen Sie dann den Überstand.
6. Wiederholen Sie den Waschschritt 3x.
7. Verdünnen Sie 10 μg Anti-RFP-Antikörper in 200 μl PBS.
8. Isolieren Sie die Kügelchen im magnetischen Isolator und resuspendieren Sie sie dann in der Antikörperlösung.
9. Drehen Sie sich 10 Minuten lang bei Raumtemperatur bei 20 U/min auf einem Tischrotator.
10. Setzen Sie das Röhrchen in den magnetischen Isolator ein und entfernen Sie den Überstand.
11. 3x in PBS waschen.
12. Resuspendieren Sie die Kügelchen in 200 μl Waschpuffer.
13. Um die Immobilisierung der Antikörper auf den Beads zu bestätigen, inkubieren Sie die mit Antikörpern beladenen Kügelchen mit einer Lösung aus >1 μM RFP-Fusionsprotein.
    HINWEIS: Bestätigen Sie visuell, ob das Protein durch die Kügelchen isoliert wird.
14. Alternativ können Sie die Fluoreszenzintensität des Überstands (Anregung 560 nm und Emission 580-650 nm) für RFP in einem Fluoreszenzspektrometer messen.

5. Probenvorbereitung: Raupenbefestigung

1. Geben Sie 10 μg der paramagnetischen Bead-Antikörper-Fusion, verdünnt in Waschpuffer (200 μl), in die proteingebundenen Mikrotiterplatten-Wells.
2. Platzieren Sie die Kügelchen nicht in einer Kontrollvertiefung, um die Auswirkungen der Beads auf das Fluoreszenzsignal zu überprüfen. Bereiten Sie eine Kontrollprobe ohne Antikörper vor, um unspezifische Wechselwirkungen mit den Kügelchen zu bestimmen.
3. Inkubieren Sie die Mikroplatte 30 Minuten lang bei Raumtemperatur.
4. Waschen Sie die Wells 3x mit 500 μL Waschpuffer.
5. Falls lokal verfügbar, überprüfen Sie mit einem Hellfeldmikroskop, ob die Kügelchen an die Oberfläche gebunden sind. Fehlt es an Kügelchen, erhöhen Sie die Konzentration in Schritt 5.1 auf 500 μg/ml.

6. Datenerfassung

1. Legen Sie die Mikroplatte ohne Deckel bei 25 °C in einen fluoreszierenden Plattenreader.
2. Richten Sie den Plattenreader so ein, dass Fluoreszenzspektren für GFP (Anregung 490 nm und Emission 510-600 nm) und RFP (Anregung 560 nm und Emission 580-650 nm) aufgezeichnet werden, um das Vorhandensein der Fusionsproteine zu bestätigen.
   HINWEIS: Messen/zeichnen Sie die Fluoreszenzspektren durch die Unterseite der Mikroplatte auf, um den Deckel darauf zu setzen. Daher sollte ein geeigneter Mikroplatten-Reader ausgewählt werden.
3. Aufzeichnung eines FRET-Fluoreszenzspektrums (Anregung 490 nm und Emission 510-650 nm) oder Überwachung der Fluoreszenz bei 510 nm und 610 nm mit Anregung bei 490 nm. Dies wird nach den Vorgaben des Herstellers eingerichtet.
4. Nehmen Sie die Mikroplatte aus dem Reader und setzen Sie den magnetischen Deckel auf.
5. Kehren Sie zum Plattenlesegerät zurück und lassen Sie die Probe 2 Minuten lang stehen.
6. Wiederholen Sie die FRET-Messung wie in Schritt 6.3.

7. Datenanalyse

1. Exportieren Sie die Daten für den Import in eine Tabelle (z. B. Excel).
2. Extrahieren Sie manuell die Daten für Donor-GFP bei 510 nm und Akzeptor-RFP bei 610 nm.
3. Berechnen Sie die relative FRET mit Gleichung 2 für jede Bedingung.
   Gleichung 2:
   A: Akzeptorintensität (RFP 610 nm), D: Donorintensität (GFP 510 nm).
   HINWEIS: Verwenden Sie den rekombinanten RFP unter den gleichen Anregungs- und Emissionsbedingungen, um die Hintergrundanregung des Akzeptors zu steuern.

Ergebnisse

Abbildung 2 zeigt ein Beispiel für eine Well-Scan-Messung, bei der die Fluoreszenzintensität von GFP in Abständen von 1 mm über die Mikrotiterplatten-Vertiefung aufgezeichnet wurde. Typische Fluoreszenzmessungen werden in der Mittelposition der Mikrotiterplattenvertiefung durchgeführt (Position 8,8 in Abbildung 2); Es ist daher wichtig, dass sich an dieser Stelle gebundenes Protein befindet. Wie in Abbi...

Diskussion

Dieser Ansatz ermöglicht es, kraftbasierte Messungen in einer Mikroplatte mit Hilfe von Fluoreszenzplatten-Readern einfach durchzuführen. Wichtig ist, dass bei diesem Assay-Format davon ausgegangen wird, dass ein funktionsfähiges Protein vorhanden ist, wenn es an eine Oberfläche gebunden ist. Daher sind vor Beginn dieser Messungen Vorkenntnisse erforderlich, um sicherzustellen, dass die Proteinaktivität vorhanden ist. Es ist auch von Vorteil, sicherzustellen, dass die Bindung der Mo...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
24 well glass-bottom microplate	Cellvis	P24-1.5H-N	Multiple sources are available. Unless needed, it is best to avoid treated surfaces and we use Imaging grade glass N1.5.
Anti-RFP antibody	Abcam	ab290	Multiple sources are available but must ensure there is minimal reactivity with GFP.
Bench top light microscope	Optika	IM-3
Bench top Rotator	Cole-Palmer-Stuart	SB3
Biotin-BSA	Sigma Aldrich	A8549
CAD Software - Sketch Up Educator	Sketch Up		Alternative CAD softwares can be used. Users should ensure the file formats are compatiable with their 3D printer.
Dynabeads Protein A	Fisher Scientific	10746713	2.8 µm paramagnetic beads with recombinant Protein A
Impact contact adhesive	EVO-STIK
MagnaRack magnetic separation rack	ThermoFisher Scientific	CS15000	Magnetic Isolator
NaCl	Fisher Scientific	10316943
Neodymium N42 5mm cube Magnets	Supermagnete	W-05-N
Plate Reader - ClarioStar	BMG Labtech		All plate reader systems can be used where measurements are possible from under the microplate. The magnet lid excludes standard measurements from above
Streptavidin	Sigma Aldrich	189730
Tris-HCl	Fisher Scientific	10142400
Ultimaker PETG Filament	Ultimaker
Ultimaker S3 - 3D printer	Ultimaker