마이크로플레이트 형식의 마그네틱 핀셋

요약

여기에서는 앙상블 생화학적 분석을 수행하는 동안 생체 분자의 기계적 조작을 가능하게 하는 새로운 마이크로플레이트 분석의 사용에 대해 설명합니다. 이는 자석으로 수정된 마이크로플레이트 덮개를 사용하여 마이크로플레이트를 가로질러 여러 개의 정적 자기 핀셋을 생성함으로써 달성됩니다.

초록

기계생물학은 생물학적 물질의 물리적 힘과 기계적 특성이 생리학과 질병에 어떻게 기여하는지 설명합니다. 일반적으로 이러한 접근법은 제한된 단일 분자 방법이므로 가용성이 제한됩니다. 이러한 요구를 해결하기 위해 표준 생화학 분석을 수행하는 동안 기계적 조작을 가능하게 하는 마이크로플레이트 분석이 개발되었습니다. 이는 마이크로플레이트 덮개에 통합된 자석을 사용하여 여러 개의 자기 핀셋을 생성함으로써 달성됩니다. 이 형식에서는 상자성 구슬에 연결된 생체 분자에 힘이 가해지며, 이는 일반적인 자기 핀셋과 같습니다. 이 연구는 단백질 구조를 모니터링하기 위해 FRET 기반 분석과 함께 이 도구를 적용하는 방법을 보여줍니다. 그러나 이 접근 방식은 효소 활성 측정에서 살아있는 세포의 신호 경로 활성화에 이르기까지 다양한 생물학적 시스템에 광범위하게 적용할 수 있습니다.

서문

기계생물학은 세포 내부 및 세포 사이의 물리적 힘의 전파가 세포 활동을 어떻게 조절하는지, ^1,2 그리고 이것이 단백질과 세포의 조직 및 역학과 어떤 상관관계가 있는지 이해하는 데 중점을 둡니다.

단일 분자 힘 측정은 단일 단백질에서 전체 세포 및 조직에 이르기까지 생물학적 시스템에서 힘이 어떻게 사용되는지 밝혀졌습니다 3,4,5,6,7. 이러한 까다로운 실험에는 특수 장비와 기술 전문 지식이 필요합니다. 반대로, 표준 생화학 분석은 쉽게 구할 수 있는 상용 장비에서 더 높은 처리량으로 수행할 수 있습니다.

여기에서 이 연구는 자기 핀셋 기반 조작과 생화학적 분석을 함께 수행할 수 있는 기계생물학 분석에 대해 설명합니다⁸. 자석은 3D 프린팅된 마이크로플레이트 뚜껑(그림 1A-D)에 배치되어 분석에 상업용 플레이트 리더를 사용할 수 있습니다. 힘은 분자를 상자성 입자에 결합하여 관심 있는 생체 분자에 가해집니다. 그런 다음 자석은 분자 전체에 장력을 가합니다. 입자와 자석 사이의 거리를 변경하면 생체 분자 전체에 가해지는 힘이 조정됩니다(그림 1E).

우리는 액틴 기반 분자 모터인 Myosin VI를 사용하여 이 분석의 사용을 나타냅니다. Myosin VI는 분자 내 백폴딩(backfolding)에 의해 조절됩니다⁹. Myosin VI는 NDP52와 같은 파트너 단백질의 결합이 myosin VI^10,11의 풀림을 유발하는 자동 억제 상태로 존재하는 것으로 나타났습니다. 이러한 분석을 수행하기 위해 N-말단 GFP 및 C-말단 RFP가 있는 미오신 VI 꼬리 도메인의 이중 표지 구조를 사용하여 단백질의 백폴딩이 GFP와 RFP 사이에 형광 공명 에너지 전달(FRET)을 생성합니다. N-terminus는 또한 표면의 단백질을 고정시키기 위해 biotinylation 태그를 가지고 있습니다. 우리는 이 분석을 FRET 측정과 함께 사용하여 힘이 myosin VI 백폴딩에 어떤 영향을 미칠 수 있는지 보여줍니다.

프로토콜

이 실험에 필요한 샘플 단백질과 시약 목록은 Table of Materials에서 확인할 수 있습니다. 형태 변화를 측정하기 위해 사용자의 연구 시스템에 대해 등가 단백질을 생산해야 합니다.

1. 3D 인쇄 된 마그네틱 뚜껑

1. 24웰 마이크로플레이트 내에 자석을 수용할 수 있도록 마이크로플레이트 뚜껑을 설계합니다. 예제 CAD 파일은 GitHub¹²에서 다운로드할 수 있습니다. 측정값은 그림 1에 나와 있습니다.
   참고: 받침대의 높이를 변경하여 자석과 표면 사이의 거리를 변경하여 적용된 힘을 변경할 수 있습니다. 또한, 입자에 가해지는 최종 힘은 입자 크기와 한 쌍의 자석 사이의 간격에 따라 달라집니다. 0.5mm, 1mm 및 2mm 간격에서 1μm 및 2.8μm 입자에 대한 가해진 힘을 계산하는 방정식은 Dos Santos et ^al.8에 나와 있습니다. 2.8μm 입자와 2mm 갭을 사용한 실험의 경우 방정식 1을 사용합니다.
   방정식 1:
2. 3D 프린터 시스템에서 PETG(Polyethylene Terephthalate Glycol)를 사용하여 마이크로플레이트 뚜껑을 3D 프린팅합니다.
   참고: 레이어 해상도가 0.02mm인 프린터를 사용하여 정확성과 재현성을 확보하십시오. 프린터 정확도의 영향은 Dos Santos et ^al.8에서 논의되었습니다.
3. 접착제를 사용하여 5mm 큐브 네오디뮴 N42 자석 쌍을 받침대에 부착하고 자극이 마이크로플레이트의 바닥을 향하도록 자기장을 생성하도록 방향을 지정합니다.
4. 자석이 없는 컨트롤로 작동하려면 최소 1개의 위치를 비워 두십시오.
5. 뚜껑을 쉽게 놓고 제거할 수 있을 만큼 충분한 크기의 밀봉된 용기에 보관하십시오.

2. 마이크로플레이트 표면 개질

1. 처리되지 않은 깨끗한 유리 바닥 24웰 마이크로플레이트를 준비합니다.
2. 실온에서 500μL의 세척 버퍼(50mM Tris-HCl(pH 7.5) 및 50mM NaCl)로 웰을 3번 세척합니다.
3. 세척 완충액에 200μL의 비오틴-BSA(0.2mg/mL)를 넣고 실온에서 15분 동안 그대로 둡니다.
   참고: 비오틴-BSA는 패시베이션과 부착 모두에 사용됩니다. 다른 패시베이션 및 표면 부착 전략을 사용할 수 있습니다. 최초 사용 및 최적화를 위해 비오틴-BSA의 농도는 최대 1mg/mL까지 다양할 수 있습니다.
4. 500μL의 세척 버퍼로 웰을 3번 세척합니다.
5. 세척 버퍼에 스트렙타비딘 200μL(20μg/mL)를 넣고 실온에서 15분 동안 그대로 둡니다.
   참고: 처음 사용하는 경우 스트렙타비딘의 농도는 최대 1mg/mL까지 다양할 수 있습니다.
6. 용액을 제거한 다음 세척 버퍼로 웰을 3번 세척합니다.
7. 웰을 500μL의 세척 버퍼로 덮습니다.
8. 사용할 준비가 될 때까지 4 °C에서 보관하십시오. 접시는 같은 날에 사용해야 합니다.

3. 샘플 준비: 단백질 고정화

1. 표면 변형 마이크로플레이트가 실온에 도달하도록 합니다.
2. 500μL의 세척 버퍼로 웰을 세척합니다.
3. 100nM 비오틴-eGFP-Myosin VI Tail-mRFP(스톡 샘플 단백질)를 추가하고 세척 버퍼에서 실온에서 15분 동안 배양합니다.
   참고: 이 예시 단백질은 Dos Santos et ^al.8에 기술된 대로 생산됩니다. 농도 및 배양 시간은 단백질에 따라 달라질 수 있습니다.
4. 500μL의 세척 버퍼로 웰을 3번 세척합니다.
5. 융합 단백질의 존재를 확인하기 위해 GFP(여기 490nm 및 방출 510-600nm) 및 RFP(여기 560nm 및 방출 580-650nm)에 대한 형광 스펙트럼을 기록하도록 플레이트 리더를 설정합니다.
6. 단백질이 부족하면 3.3단계에서 농도를 높입니다.
   참고: 결합 불량은 부적절한 비오틴-BSA 및/또는 스트렙타비딘 결합과 관련이 있을 수 있으므로 양이 10배 증가할 수 있습니다.
7. 가능한 경우 웰 스캔(well-scan) 측정을 수행하여 융합 단백질이 마이크로플레이트를 가로질러 결합되어 있는지 확인합니다(그림 2).
   알림: 이 측정은 마이크로플레이트 웰의 특정 지점에서 형광 강도를 기록합니다. 단백질이 우물을 가로질러 결합되어 있는지 확인할 수 있습니다.
8. 분석 측정이 이루어지는 웰 중앙에서 신호가 균일한지(5% 이내) 확인합니다.

4. 마그네틱 비드 준비

1. 2.8μm 상자성 비드의 바이알을 재조합 단백질 A(Table of Materials)로 30초 동안 소용돌이하여 비드를 재현탁합니다.
2. 상자성 비드 1mg에 해당하는 부피를 1.5mL 튜브로 옮깁니다.
3. 튜브를 자기 절연체(Table of Materials)에 놓고 상등액을 제거합니다.
4. 용액을 위아래로 부드럽게 피펫팅하여 200μL의 PBS에 비드를 재현탁합니다.
5. 자기 절연체에 튜브를 놓고 상등액을 제거합니다.
6. 세탁 단계를 3회 반복합니다.
7. 10μg의 Anti-RFP 항체를 200μL의 PBS에 희석합니다.
8. magnetic isolator에서 비드를 분리한 다음 항체 용액에 재현탁합니다.
9. 벤치탑 회전기에서 실온에서 20분 동안 10rpm으로 회전합니다.
10. 자기 절연체에 튜브를 놓고 상층액을 제거합니다.
11. PBS에서 3번 세척합니다.
12. 비드를 200μL의 세척 버퍼에 재현탁합니다.
13. 비드의 항체 고정화를 확인하기 위해 항체가 로드된 비드를 >1μM RFP 융합 단백질 용액으로 배양합니다.
    참고: 단백질이 비드에 의해 분리되어 있는지 육안으로 확인합니다.
14. 또는 형광 분광계에서 RFP에 대한 상등액의 형광 강도(여기 560nm 및 방출 580-650nm)를 측정합니다.

5. 샘플 준비: 비드 부착

1. 세척 버퍼(200μL)에 희석된 상자성 비드-항체 융합 10μg을 단백질 결합 마이크로플레이트 웰에 추가합니다.
2. 형광 신호에 대한 구슬의 효과를 확인하기 위해 하나의 컨트롤 웰에 구슬을 배치하지 마십시오. 비드와의 비특이적 상호 작용을 확인하기 위해 항체가 없는 대조군 샘플을 준비합니다.
3. 마이크로플레이트를 실온에서 30분 동안 배양합니다.
4. 500μL의 세척 버퍼로 웰을 3번 세척합니다.
5. 현지에서 사용할 수 있는 경우 비드가 명시야 현미경의 표면에 결합되어 있는지 확인합니다. 비드가 부족한 경우 5.1단계에서 농도를 500μg/mL로 높입니다.

6. 데이터 수집

1. 뚜껑이 없는 마이크로플레이트를 25°C의 형광판 리더에 넣습니다.
2. 융합 단백질의 존재를 확인하기 위해 GFP(여기 490nm 및 방출 510-600nm) 및 RFP(여기 560nm 및 방출 580-650nm)에 대한 형광 스펙트럼을 기록하도록 플레이트 리더를 설정합니다.
   알림: 마이크로플레이트 하단을 통해 형광 스펙트럼을 측정/기록하여 뚜껑을 위에 놓습니다. 따라서 적절한 마이크로플레이트 리더를 선택해야 합니다.
3. FRET 형광 스펙트럼(여기 490nm 및 방출 510-650nm)을 기록하거나 490nm에서 여기로 510nm 및 610nm에서 형광을 모니터링합니다. 이는 제조업체의 지침에 따라 설정됩니다.
4. 리더에서 마이크로플레이트를 제거하고 마그네틱 뚜껑을 추가합니다.
5. 플레이트 리더로 돌아가서 샘플을 2분 동안 그대로 둡니다.
6. 6.3단계와 같이 FRET 측정을 반복합니다.

7. 데이터 분석

1. 스프레드시트(예: Excel)로 가져올 데이터를 내보냅니다.
2. 510nm에서 Donor GFP 및 610nm에서 acceptor RFP에 대한 데이터를 수동으로 추출합니다.
3. 각 조건에 대해 수식 2를 사용하여 상대 FRET를 계산합니다.
   방정식 2:
   A: 수용체 강도(RFP 610nm), D: 도너 강도(GFP 510nm).
   참고: 동일한 여기 및 방출 조건에서 재조합 RFP를 사용하여 수용체의 배경 여기를 제어합니다.

결과

그림 2 는 GFP의 형광 강도가 마이크로플레이트 웰 전체에서 1mm 간격으로 기록된 웰 스캔 측정의 예를 보여줍니다. 일반적인 형광 측정은 마이크로플레이트 웰의 중앙 위치( 그림 2의 위치 8,8)에서 수행됩니다. 따라서 이 위치에 결합된 단백질이 있는 것이 중요합니다. 그림 2에서 볼 수 있듯이 강도는 반경...

토론

이 접근 방식을 사용하면 형광판 판독기를 사용하여 force-based 측정을 microplate에 쉽게 적용할 수 있습니다. 중요한 것은 이 분석 형식이 표면에 결합할 때 기능적 단백질이 있다고 가정한다는 것입니다. 따라서 단백질 활성이 있는지 확인하기 위해 이러한 측정을 시작하기 전에 사전 지식이 필요합니다. 또한 상자성 비드 및 표면에 대한 분자의 결합이 각 시스템에 맞게 최...

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
24 well glass-bottom microplate	Cellvis	P24-1.5H-N	Multiple sources are available. Unless needed, it is best to avoid treated surfaces and we use Imaging grade glass N1.5.
Anti-RFP antibody	Abcam	ab290	Multiple sources are available but must ensure there is minimal reactivity with GFP.
Bench top light microscope	Optika	IM-3
Bench top Rotator	Cole-Palmer-Stuart	SB3
Biotin-BSA	Sigma Aldrich	A8549
CAD Software - Sketch Up Educator	Sketch Up		Alternative CAD softwares can be used. Users should ensure the file formats are compatiable with their 3D printer.
Dynabeads Protein A	Fisher Scientific	10746713	2.8 µm paramagnetic beads with recombinant Protein A
Impact contact adhesive	EVO-STIK
MagnaRack magnetic separation rack	ThermoFisher Scientific	CS15000	Magnetic Isolator
NaCl	Fisher Scientific	10316943
Neodymium N42 5mm cube Magnets	Supermagnete	W-05-N
Plate Reader - ClarioStar	BMG Labtech		All plate reader systems can be used where measurements are possible from under the microplate. The magnet lid excludes standard measurements from above
Streptavidin	Sigma Aldrich	189730
Tris-HCl	Fisher Scientific	10142400
Ultimaker PETG Filament	Ultimaker
Ultimaker S3 - 3D printer	Ultimaker