Магнитный пинцет в формате микропланшета

Резюме

В данной статье мы описываем использование нового анализа на микропланшетах для обеспечения механических манипуляций с биомолекулами при выполнении ансамблевых биохимических анализов. Это достигается с помощью крышки микропланшета, модифицированной с помощью магнитов для создания нескольких статических магнитных пинцетов поперек микропланшета.

Аннотация

Механобиология описывает, как физические силы и механические свойства биологического материала влияют на физиологию и болезни. Как правило, эти подходы представляют собой ограниченные одномолекулярные методы, что ограничивает их доступность. Чтобы удовлетворить эту потребность, был разработан микропланшетный анализ, который позволяет проводить механические манипуляции при выполнении стандартных биохимических анализов. Это достигается с помощью магнитов, встроенных в крышку микропланшета для создания нескольких магнитных пинцетов. В этом формате сила воздействует на биомолекулы, соединенные с парамагнитными шариками, эквивалентными типичному магнитному пинцету. Исследование демонстрирует применение этого инструмента с анализами на основе FRET для мониторинга конформаций белков. Тем не менее, этот подход широко применим к различным биологическим системам, начиная от измерения ферментативной активности и заканчивая активацией сигнальных путей в живых клетках.

Введение

Механобиология фокусируется на понимании того, как распространение физических сил внутри и между клетками регулирует клеточную активность ^1,2 и как это коррелирует с организацией и динамикой как белков, так и клеток.

Измерения силы на отдельных молекулах показали, как сила используется в биологических системах, от отдельных белков до целых клеток и тканей 3,4,5,6,7. Эти сложные эксперименты требуют специализированного оборудования и технических знаний. И наоборот, стандартные биохимические анализы могут быть выполнены с более высокой производительностью в легкодоступном коммерческом оборудовании.

В данном исследовании описывается механобиологический анализ, который^{позволяет проводить} манипуляции с помощью магнитных пинцеров и биохимические анализы 8. Магниты размещены на напечатанной на 3D-принтере крышке микропланшета (рис. 1A-D), что позволяет использовать коммерческие считыватели пластин для проведения анализов. Сила прикладывается к исследуемой биомолекуле путем связывания молекулы с парамагнитными частицами. Затем магниты оказывают натяжение на молекулу. Изменение расстояния между частицами и магнитами регулирует силу, приложенную к биомолекуле (рис. 1E).

Мы представляем использование этого анализа с использованием молекулярного мотора на основе актина, миозина VI. Миозин VI регулируется внутримолекулярным обратным сворачиванием⁹. Было показано, что миозин VI существует в аутоингибированном состоянии, при этом связывание партнерских белков, таких как NDP52, запускает разворачивание миозина VI^10,11. Для проведения этих анализов мы будем использовать двойную меченую конструкцию хвостового домена миозина VI с N-концевым GFP и C-концевым RFP, в результате чего обратное сворачивание белка генерирует флуоресцентный резонансный перенос энергии (FRET) между GFP и RFP. N-конец также несет метку биотинилирования для иммобилизации белка на поверхности. Мы используем этот анализ в сочетании с измерениями FRET, чтобы показать, как сила может влиять на обратное сворачивание миозина VI.

протокол

Образцы белков, необходимые для этого эксперимента, и список реагентов можно найти в Таблице материалов. Эквивалентные белки должны быть получены для того, чтобы система исследования пользователя могла измерить изменения конформации.

1. 3D магнитная крышка с принтом

1. Спроектируйте крышку микропланшета для размещения магнитов внутри 24-луночного микропланшета. Пример файла САПР можно скачать с GitHub¹². Измерения показаны на рисунке 1.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Высота пьедестала может быть изменена, чтобы изменить расстояние между магнитами и поверхностью, чтобы изменить приложенную силу. Кроме того, конечная сила, действующая на частицу, зависит от размера частицы и зазора между парой магнитов. Уравнения для расчета приложенной силы для частиц размером 1 мкм и 2,8 мкм с зазорами 0,5 мм, 1 мм и 2 мм приведены в Dos Santos et ^al.8. Для описанных здесь экспериментов с частицами размером 2,8 мкм и зазором 2 мм используйте уравнение 1.
   Уравнение 1:
2. 3D-печать крышки микропланшета с использованием полиэтилентерефталатгликоля (PETG) на системе 3D-принтера.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Используйте принтер с разрешением слоя 0,02 мм для обеспечения точности и воспроизводимости. Влияние точности принтера обсуждалось в Dos Santos et ^al.8.
3. Прикрепите пары 5 мм кубических неодимовых магнитов N42 с помощью клея к пьедесталам так, чтобы магнитные полюса были ориентированы так, чтобы создать поле, направленное к нижней части микропластины.
4. Оставьте по крайней мере 1 позицию пустой, чтобы она действовала как регулятор без магнита.
5. Хранить в герметичной упаковке достаточного размера, чтобы можно было легко установить и снять крышку.

2. Модификация поверхности микропланшетов

1. Возьмите чистый необработанный микропланшет со стеклянным дном на 24 лунки.
2. Промойте лунки 3 раза 500 мкл промывочного буфера (50 мМ Tris-HCl (pH 7,5) и 50 mM NaCl) при комнатной температуре.
3. Добавьте 200 мкл биотина-BSA (0,2 мг/мл) в буфер для промывки и оставьте его в покое на 15 минут при комнатной температуре.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Биотин-БСА используется как для пассивации, так и для прикрепления. Можно использовать другие стратегии пассивации и прикрепления поверхности. При первом использовании и оптимизации концентрация биотина-БСА может варьироваться до 1 мг/мл.
4. Промойте лунки 3 раза 500 μл промывочного буфера.
5. Добавьте 200 мкл стрептавидина (20 мкг/мл) в буфер для стирки и оставьте в покое на 15 минут при комнатной температуре.
   ПРИМЕЧАНИЕ: При первом применении концентрация стрептавидина может варьироваться до 1 мг/мл.
6. Удалите раствор, а затем промойте лунки 3 раза с помощью промывочного буфера.
7. Накройте лунки 500 μл промывочного буфера.
8. Хранить при температуре 4 °C до использования. Тарелки следует использовать в тот же день.

3. Подготовка образца: иммобилизация белка

1. Дайте микропланшету с модифицированной поверхностью нагреться до комнатной температуры.
2. Промойте лунки 500 μл промывочного буфера.
3. Добавьте 100 нМ биотин-eGFP-Myosin VI Tail-mRFP (исходный образец белка) и инкубируйте в течение 15 минут при комнатной температуре в промывном буфере.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Этот пример белка получен в соответствии с описанием Dos Santos et ^al.8. Концентрации и время инкубации могут варьироваться в зависимости от белка.
4. Промойте лунки 3 раза 500 μл промывочного буфера.
5. Настройте считыватель пластин для записи спектров флуоресценции для GFP (возбуждение 490 нм и излучение 510-600 нм) и RFP (возбуждение 560 нм и излучение 580-650 нм) для подтверждения наличия гибридных белков.
6. Если наблюдается недостаток белка, увеличьте концентрацию на шаге 3.3.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Плохое связывание может быть связано с недостаточным связыванием биотина-БСА и/или стрептавидина, и, следовательно, их количество может быть увеличено в 10 раз.
7. Если возможно, проведите измерение с помощью сканирования лунки, чтобы определить, связан ли гибридный белок с микропланшетом (Рисунок 2).
   ПРИМЕЧАНИЕ: Это измерение будет записывать интенсивность флуоресценции в определенных точках микропланшетной лунки. Он покажет, связан ли белок через лунку.
8. Убедитесь, что сигнал равномерный (в пределах 5%) в центре лунки, где происходит измерение анализа.

4. Подготовка магнитных шариков

1. Вихревой флакон из 2,8 мкм парамагнитных шариков с рекомбинантным белком А (Таблица материалов) в течение 30 с для ресуспендирования шариков.
2. Перенесите объем, соответствующий 1 мг парамагнитных шариков, в пробирку объемом 1,5 мл.
3. Поместите трубку в магнитный изолятор (Таблица материалов), а затем удалите надосадочную жидкость.
4. Суспендируйте шарики в 200 мкл PBS, осторожно дозируя раствор вверх и вниз.
5. Поместите трубку в магнитный изолятор, а затем извлеките надосадочную жидкость.
6. Повторите шаг стирки 3 раза.
7. Разведите 10 мкг антитела Anti-RFP в 200 мкл PBS.
8. Изолируйте шарики в магнитном изоляторе, а затем повторно суспендируйте в растворе антитела.
9. Вращайтесь со скоростью 20 об/мин в течение 10 минут при комнатной температуре на настольном ротаторе.
10. Поместите трубку в магнитный изолятор и удалите надосадочную жидкость.
11. Стирайте 3 раза в PBS.
12. Ресуспендируйте шарики в 200 μл буфера для стирки.
13. Чтобы подтвердить иммобилизацию антител на бусинах, инкубируйте бусины, загруженные антителами, с раствором белка-синтеза >1 мкМ RFP.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Визуально подтвердите, выделен ли белок с помощью шариков.
14. В качестве альтернативы можно измерить интенсивность флуоресценции надосадочной жидкости (возбуждение 560 нм и излучение 580-650 нм) для RFP в флуоресцентном спектрометре.

5. Подготовка образца: Крепление борта

1. Добавьте 10 мкг парамагнитного слияния шариков и антител, разведенных в буфере для промывки (200 мкл), в лунки микропланшетов, связанных с белками.
2. Не размещайте бусины в одну контрольную лунку, чтобы проверить влияние бусин на флуоресцентный сигнал. Подготовьте контрольный образец без антител, чтобы определить любые неспецифические взаимодействия с шариками.
3. Инкубируйте микропланшет при комнатной температуре в течение 30 минут.
4. Промойте лунки 3 раза 500 μл промывочного буфера.
5. Если это доступно на месте, убедитесь, что шарики привязаны к поверхности на светлопольном микроскопе. Если шариков не хватает, увеличьте концентрацию на шаге 5,1 до 500 мкг/мл.

6. Сбор данных

1. Поместите микропланшет без крышки в люминесцентный считыватель пластин при температуре 25 °C.
2. Настройте планшетный ридер для записи спектров флуоресценции для GFP (возбуждение 490 нм и излучение 510-600 нм) и RFP (возбуждение 560 нм и излучение 580-650 нм) для подтверждения наличия гибридных белков.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Измерьте/запишите спектры флуоресценции через нижнюю часть микропланшета, чтобы поместить крышку сверху. Поэтому следует выбрать подходящий считыватель микропланшетов.
3. Запишите флуоресцентный спектр FRET (возбуждение 490 нм и излучение 510-650 нм) или контролируйте флуоресценцию на длинах волн 510 нм и 610 нм с возбуждением на длине волны 490 нм. Это настраивается в соответствии с рекомендациями производителя.
4. Извлеките микропланшет из считывателя и установите магнитную крышку.
5. Вернитесь к считывателю планшетов и оставьте образец на 2 минуты.
6. Повторите измерение FRET, как в шаге 6.3.

7. Анализ данных

1. Экспортируйте данные для импорта в таблицу (например, Excel).
2. Вручную извлеките данные для донорской GFP на длине волны 510 нм и акцепторной RFP на длине волны 610 нм.
3. Рассчитайте относительный FRET с помощью уравнения 2 для каждого условия.
   Уравнение 2:
   A: интенсивность акцептора (RFP 610 нм), D: интенсивность донора (GFP 510 нм).
   ПРИМЕЧАНИЕ: Используйте рекомбинантный RFP при тех же условиях возбуждения и излучения для контроля фонового возбуждения акцептора.

Результаты

На рисунке 2 показан пример измерения с помощью сканирования скважины, в котором интенсивность флуоресценции GFP была зарегистрирована с интервалом в 1 мм по всей лунке микропланшета. Типичные измерения флуоресценции выполняются в центральном положен?...

Обсуждение

Такой подход позволяет легко применять измерения на основе силы в микропланшете с помощью считывателей флуоресцентных пластин. Важно отметить, что этот формат анализа предполагает, что существует функциональный белок, когда он связан с поверхностью. Таким образом, п...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
24 well glass-bottom microplate	Cellvis	P24-1.5H-N	Multiple sources are available. Unless needed, it is best to avoid treated surfaces and we use Imaging grade glass N1.5.
Anti-RFP antibody	Abcam	ab290	Multiple sources are available but must ensure there is minimal reactivity with GFP.
Bench top light microscope	Optika	IM-3
Bench top Rotator	Cole-Palmer-Stuart	SB3
Biotin-BSA	Sigma Aldrich	A8549
CAD Software - Sketch Up Educator	Sketch Up		Alternative CAD softwares can be used. Users should ensure the file formats are compatiable with their 3D printer.
Dynabeads Protein A	Fisher Scientific	10746713	2.8 µm paramagnetic beads with recombinant Protein A
Impact contact adhesive	EVO-STIK
MagnaRack magnetic separation rack	ThermoFisher Scientific	CS15000	Magnetic Isolator
NaCl	Fisher Scientific	10316943
Neodymium N42 5mm cube Magnets	Supermagnete	W-05-N
Plate Reader - ClarioStar	BMG Labtech		All plate reader systems can be used where measurements are possible from under the microplate. The magnet lid excludes standard measurements from above
Streptavidin	Sigma Aldrich	189730
Tris-HCl	Fisher Scientific	10142400
Ultimaker PETG Filament	Ultimaker
Ultimaker S3 - 3D printer	Ultimaker