Mikroplaka formatında manyetik cımbız

Özet

Burada, topluluk biyokimyasal tahlilleri gerçekleştirirken biyomoleküllerin mekanik manipülasyonunu sağlamak için yeni bir mikroplaka tahlilinin kullanımını açıklıyoruz. Bu, mikroplaka boyunca birden fazla statik manyetik cımbız oluşturmak için mıknatıslarla modifiye edilmiş bir mikroplaka kapağı kullanılarak elde edilir.

Özet

Mekanobiyoloji, biyolojik materyalin fiziksel kuvvetlerinin ve mekanik özelliklerinin fizyolojiye ve hastalığa nasıl katkıda bulunduğunu açıklar. Tipik olarak, bu yaklaşımlar, kullanılabilirliklerini kısıtlayan sınırlı tek moleküllü yöntemlerdir. Bu ihtiyacı karşılamak için, standart biyokimyasal tahlilleri gerçekleştirirken mekanik manipülasyonu mümkün kılan bir mikroplaka tahlili geliştirilmiştir. Bu, birden fazla manyetik cımbız oluşturmak için bir mikroplaka kapağına yerleştirilmiş mıknatıslar kullanılarak elde edilir. Bu formatta, tipik bir manyetik cımbızlayana eşdeğer olan paramanyetik boncuklara bağlı biyomoleküller boyunca kuvvet uygulanır. Çalışma, bu aracın protein konformasyonlarını izlemek için FRET bazlı tahlillerle uygulanmasını göstermektedir. Bununla birlikte, bu yaklaşım, enzimatik aktivitenin ölçülmesinden canlı hücrelerdeki sinyal yollarının aktivasyonuna kadar farklı biyolojik sistemlere yaygın olarak uygulanabilir.

Giriş

Mekanobiyoloji, hücreler içinde ve arasında fiziksel kuvvetlerin yayılmasının hücresel aktiviteyi ^1,2 nasıl düzenlediğini ve bunun hem proteinlerin hem de hücrelerin organizasyonu ve dinamikleri ile nasıl ilişkili olduğunu anlamaya odaklanır.

Tek moleküllü kuvvet ölçümleri, tek proteinlerden tüm hücrelere ve dokulara^{kadar biyolojik} sistemlerde kuvvetin nasıl kullanıldığını ortaya koymuştur 3,4,5,6,7. Bu zorlu deneyler, özel ekipman ve teknik uzmanlık gerektirir. Tersine, standart biyokimyasal tahliller, kolayca bulunabilen ticari ekipmanlarda daha yüksek verimde gerçekleştirilebilir.

Burada, çalışma, manyetik cımbız tabanlı manipülasyon ve biyokimyasal tahlillerin birlikte gerçekleştirilmesini sağlayan bir mekanobiyoloji testini açıklamaktadır⁸. Mıknatıslar, 3D baskılı bir mikroplaka kapağına yerleştirilir (Şekil 1A-D), bu da tahliller için ticari plaka okuyucuların kullanılmasını sağlar. Molekülü paramanyetik parçacıklara bağlayarak ilgilenilen biyomolekül boyunca kuvvet uygulanır. Mıknatıslar daha sonra molekül boyunca gerilim uygular. Parçacıklar ve mıknatıslar arasındaki mesafeyi değiştirmek, biyomolekül boyunca uygulanan kuvveti ayarlar (Şekil 1E).

Bu testin kullanımını, aktin bazlı moleküler motor olan Myosin VI kullanarak temsil ediyoruz. Miyozin VI, molekül içi geri katlanma⁹ ile düzenlenir. Miyozin VI'nın otomatik olarak inhibe edilmiş bir durumda var olduğu gösterilmiştir, bu sayede NDP52 gibi ortak proteinlerin bağlanması, miyozin VI^10,11'in açılmasını tetikler. Bu tahlilleri gerçekleştirmek için, bir N-terminal GFP ve bir C-Terminal RFP ile miyozin VI kuyruk alanının çift etiketli bir yapısını kullanacağız, bu sayede proteinin geri katlanması GFP ve RFP arasında Floresan Rezonans Enerji Transferi (FRET) oluşturur. N-terminali ayrıca proteini yüzeyde hareketsiz hale getirmek için bir biyotinilasyon etiketi taşır. Bu testi, kuvvetin miyozin VI geri katlanmasını nasıl etkileyebileceğini göstermek için FRET ölçümleriyle birlikte kullanıyoruz.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protokol

Bu deney için gerekli olan örnek proteinler ve reaktiflerin bir listesi Malzeme Tablosunda bulunur. Konformasyon değişikliklerini ölçmek için kullanıcının çalışma sistemi için eşdeğer proteinler üretilmelidir.

1. 3D baskılı manyetik kapak

1. Mıknatısları 24 oyuklu bir mikroplaka içinde barındırmak için bir mikroplaka kapağı tasarlayın. Örnek bir CAD dosyası GitHub^12'den indirilebilir. Ölçümler Şekil 1'de gösterilmiştir.
   NOT: Uygulanan kuvveti değiştirmek için mıknatıslar ve yüzey arasındaki mesafeyi değiştirmek için kaidenin yüksekliği değiştirilebilir. Ek olarak, parçacığa uygulanan son kuvvet, parçacık boyutuna ve mıknatıs çifti arasındaki boşluğa bağlıdır. 0,5 mm, 1 mm ve 2 mm boşluklarda 1 μm ve 2,8 μm parçacıklar için uygulanan kuvveti hesaplamak için denklemler Dos Santos ve ^ark.8'de verilmiştir. Burada 2.8 μm parçacıklar ve 2 mm'lik bir boşlukla açıklanan deneyler için Denklem 1'i kullanın.
   Denklem 1:
2. 3D yazıcı sisteminde Polietilen Tereftalat Glikol (PETG) kullanarak bir mikroplaka kapağını 3D yazdırın.
   NOT: Doğruluğu ve tekrarlanabilirliği sağlamak için 0,02 mm katman çözünürlüğüne sahip bir yazıcı kullanın. Yazıcı doğruluğunun etkisi Dos Santos ve ^ark.8'de tartışılmıştır.
3. 5 mm küp Neodimyum N42 mıknatıs çiftlerini, mikroplakanın dibine doğru yönlendirilmiş alanı oluşturmak için manyetik kutuplar yönlendirilmiş olarak kaidelere yapıştırıcı kullanarak takın.
4. Mıknatıssız kontrol görevi görmesi için en az 1 konumu boş bırakın.
5. Kapağı kolayca yerleştirmek ve çıkarmak için yeterli boyutta kapalı bir kapta saklayın.

2. Mikroplaka yüzey modifikasyonu

1. Temiz, işlenmemiş cam tabanlı 24 oyuklu bir mikroplaka alın.
2. Kuyucukları 3x 500 μL yıkama tamponu (50 mM Tris-HCl (pH 7.5) ve 50 mM NaCl) ile oda sıcaklığında yıkayın.
3. Yıkama tamponuna 200 μL biotin-BSA (0.2 mg / mL) ekleyin ve oda sıcaklığında 15 dakika boyunca rahatsız edilmeden bırakın.
   NOT: Biotin-BSA hem pasivasyon hem de bağlantı için kullanılır. Diğer pasivasyon ve yüzey bağlantı stratejileri kullanılabilir. İlk kullanım ve optimizasyon için, biotin-BSA konsantrasyonu 1 mg / mL'ye kadar değiştirilebilir.
4. Kuyuları 3x 500 μL yıkama tamponu ile yıkayın.
5. Yıkama tamponuna 200 μL streptavidin (20 μg/mL) ekleyin ve oda sıcaklığında 15 dakika boyunca rahatsız edilmeden bırakın.
   NOT: İlk kullanım için, streptavidin konsantrasyonu 1 mg / mL'ye kadar değiştirilebilir.
6. Solüsyonu çıkarın ve ardından kuyucukları 3x yıkama tamponu ile yıkayın.
7. Kuyuları 500 μL yıkama tamponu ile örtün.
8. Kullanıma hazır olana kadar 4 °C'de saklayın. Plaklar aynı gün kullanılmalıdır.

3. Numune hazırlama: Protein immobilizasyonu

1. Yüzeyi değiştirilmiş mikroplakanın oda sıcaklığına ulaşmasına izin verin.
2. Kuyuları 500 μL yıkama tamponu ile yıkayın.
3. 100 nM biotin-eGFP-Myosin VI Tail-mRFP (stok numune proteini) ekleyin ve yıkama tamponunda oda sıcaklığında 15 dakika inkübe edin.
   NOT: Bu örnek protein, Dos Santos ve ^ark.8 tarafından tarif edildiği gibi üretilmiştir. Konsantrasyonlar ve inkübasyon süreleri proteine bağlı olarak değişebilir.
4. Kuyuları 3x 500 μL yıkama tamponu ile yıkayın.
5. Füzyon proteinlerinin varlığını doğrulamak için plaka okuyucuyu GFP (uyarma 490 nm ve emisyon 510-600 nm) ve RFP (uyarma 560 nm ve emisyon 580-650nm) için floresan spektrumlarını kaydedecek şekilde ayarlayın.
6. Protein eksikliği varsa, adım 3.3'teki konsantrasyonu arttırın.
   NOT: Zayıf bağlanma, yetersiz biotin-BSA ve/veya streptavidin bağlanması ile ilişkili olabilir ve bu nedenle miktarlar 10 kat artırılabilir.
7. Mümkünse, füzyon proteininin mikroplaka boyunca bağlanıp bağlanmadığını belirlemek için iyi bir tarama ölçümü yapın (Şekil 2).
   NOT: Bu ölçüm, mikroplaka kuyusu boyunca belirli noktalarda floresan yoğunluğunu kaydedecektir. Proteinin kuyuya bağlı olup olmadığını ortaya çıkaracaktır.
8. Tahlil ölçümünün yapıldığı kuyunun merkezinde sinyalin tekdüze (%5 içinde) olduğundan emin olun.

4. Manyetik boncuk hazırlama

1. Boncukları yeniden süspanse etmek için 2.8 μm paramanyetik boncukların şişesini rekombinant Protein A (Malzeme Tablosu) ile 30 saniye boyunca vorteksleyin.
2. 1 mg paramanyetik boncuklara karşılık gelen hacmi 1.5 mL'lik bir tüpe aktarın.
3. Tüpü manyetik bir izolatöre (Malzeme Tablosu) yerleştirin ve ardından süpernatanı çıkarın.
4. Çözeltiyi yukarı ve aşağı hafifçe pipetleyerek boncukları 200 μL PBS'de yeniden süspanse edin.
5. Tüpü manyetik izolatöre yerleştirin ve ardından süpernatanı çıkarın.
6. Yıkama adımını 3 kez tekrarlayın.
7. 10 μg Anti-RFP antikorunu 200 μL PBS içinde seyreltin.
8. Manyetik izolatördeki boncukları izole edin ve ardından antikor çözeltisi içinde yeniden süspanse edin.
9. Tezgah üstü döndürücüde oda sıcaklığında 20 dakika boyunca 10 rpm'de döndürün.
10. Tüpü manyetik izolatöre yerleştirin ve süpernatanı çıkarın.
11. PBS'de 3 kez yıkayın.
12. Boncukları 200 μL yıkama tamponunda tekrar süspanse edin.
13. Boncuklar üzerindeki antikor immobilizasyonunu doğrulamak için, antikor yüklü boncukları >1 μM RFP füzyon proteini çözeltisi ile inkübe edin.
    NOT: Proteinin boncuklar tarafından izole edilip edilmediğini görsel olarak onaylayın.
14. Alternatif olarak, bir floresan spektrometresinde RFP için süpernatantın floresan yoğunluğunu (uyarma 560 nm ve emisyon 580-650nm) ölçün.

5. Numune hazırlama: Boncuk eki

1. Proteine bağlı mikroplaka kuyucuklarına yıkama tamponunda (200 μL) seyreltilmiş 10 μg paramanyetik boncuk-antikor füzyonu ekleyin.
2. Boncukların floresan sinyali üzerindeki etkisini kontrol etmek için boncukları bir kontrol kuyusuna yerleştirmeyin. Boncuklarla spesifik olmayan etkileşimleri belirlemek için antikorlar içermeyen bir kontrol numunesi hazırlayın.
3. Mikroplakayı oda sıcaklığında 30 dakika inkübe edin.
4. Kuyuları 3x 500 μL yıkama tamponu ile yıkayın.
5. Yerel olarak mevcutsa, boncukların parlak alan mikroskobunda yüzeye bağlı olup olmadığını kontrol edin. Boncuk eksikliği varsa, adım 5.1'deki konsantrasyonu 500 μg / mL'ye yükseltin.

6. Veri toplama

1. Mikroplakayı kapaksız olarak 25 °C'de bir floresan plaka okuyucusuna yerleştirin.
2. Füzyon proteinlerinin varlığını doğrulamak için plaka okuyucuyu GFP (uyarma 490 nm ve emisyon 510-600 nm) ve RFP (uyarma 560 nm ve emisyon 580-650 nm) için floresan spektrumlarını kaydedecek şekilde ayarlayın.
   NOT: Kapağı üstüne yerleştirmek için mikroplakanın altından floresan spektrumlarını ölçün/kaydedin. Bu nedenle uygun bir mikroplaka okuyucu seçilmelidir.
3. Bir FRET floresan spektrumu kaydedin (uyarma 490 nm ve emisyon 510-650nm) veya 490 nm'de uyarma ile 510 nm ve 610 nm'de floresansı izleyin. Bu, üreticinin kılavuzuna göre ayarlanır.
4. Mikroplakayı okuyucudan çıkarın ve manyetik kapağı ekleyin.
5. Plaka okuyucuya geri dönün ve numuneyi 2 dakika bekletin.
6. FRET ölçümünü adım 6.3'teki gibi tekrarlayın.

7. Veri analizi

1. Verileri içe aktarmak için bir elektronik tabloya (ör. Excel) aktarın.
2. 510 nm'de Donör GFP ve 610 nm'de alıcı RFP için verileri manuel olarak çıkarın.
3. Her koşul için Denklem 2'yi kullanarak bağıl FRET'i hesaplayın.
   Denklem 2:
   A: alıcı yoğunluğu (RFP 610 nm), D: verici yoğunluğu (GFP 510 nm).
   NOT: Alıcının arka plan uyarımını kontrol etmek için aynı uyarma ve emisyon koşulları altında rekombinant RFP'yi kullanın.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Sonuçlar

Şekil 2 , GFP'nin floresan yoğunluğunun mikroplaka kuyusu boyunca 1 mm aralıklarla kaydedildiği bir kuyu tarama ölçümü örneğini göstermektedir. Tipik floresan ölçümleri, mikroplaka kuyusunun merkez konumunda gerçekleştirilir (Şekil 8,8'de konum 2); Bu nedenle, bu yerde bağlı proteinin bulunması önemlidir. Şekil 2'de gösterildiği gibi, yoğunluk kuyu merkezinde birkaç milime...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Tartışmalar

Bu yaklaşım, kuvvete dayalı ölçümlerin floresan plaka okuyucular kullanılarak bir mikroplakada kolayca uygulanmasını sağlar. Daha da önemlisi, bu tahlil formatı, bir yüzeye bağlandığında fonksiyonel bir protein olduğunu varsayar. Bu nedenle, protein aktivitesi olduğundan emin olmak için bu ölçümlere başlamadan önce önceden bilgi gereklidir. Moleküllerin paramanyetik boncuklara ve yüzeye bağlanmasının her sistem için optimize edildiğinden emin olmak da fay...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
24 well glass-bottom microplate	Cellvis	P24-1.5H-N	Multiple sources are available. Unless needed, it is best to avoid treated surfaces and we use Imaging grade glass N1.5.
Anti-RFP antibody	Abcam	ab290	Multiple sources are available but must ensure there is minimal reactivity with GFP.
Bench top light microscope	Optika	IM-3
Bench top Rotator	Cole-Palmer-Stuart	SB3
Biotin-BSA	Sigma Aldrich	A8549
CAD Software - Sketch Up Educator	Sketch Up		Alternative CAD softwares can be used. Users should ensure the file formats are compatiable with their 3D printer.
Dynabeads Protein A	Fisher Scientific	10746713	2.8 µm paramagnetic beads with recombinant Protein A
Impact contact adhesive	EVO-STIK
MagnaRack magnetic separation rack	ThermoFisher Scientific	CS15000	Magnetic Isolator
NaCl	Fisher Scientific	10316943
Neodymium N42 5mm cube Magnets	Supermagnete	W-05-N
Plate Reader - ClarioStar	BMG Labtech		All plate reader systems can be used where measurements are possible from under the microplate. The magnet lid excludes standard measurements from above
Streptavidin	Sigma Aldrich	189730
Tris-HCl	Fisher Scientific	10142400
Ultimaker PETG Filament	Ultimaker
Ultimaker S3 - 3D printer	Ultimaker