פינצטה מגנטית בפורמט Microplate

Summary

כאן, אנו מתארים את השימוש בבדיקת מיקרו-פלטות חדשה כדי לאפשר מניפולציה מכנית של ביומולקולות תוך ביצוע בדיקות ביוכימיות אנסמבל. זה מושג באמצעות מכסה מיקרו-פלטה ששונה עם מגנטים ליצירת פינצטה מגנטית סטטית מרובה על פני המיקרו-לוח.

Abstract

מכאנוביולוגיה מתארת כיצד הכוחות הפיזיקליים והתכונות המכניות של חומר ביולוגי תורמים לפיזיולוגיה ולמחלות. בדרך כלל, גישות אלו הן שיטות מוגבלות של מולקולה אחת, מה שמגביל את זמינותן. כדי לענות על צורך זה, פותחה בדיקת מיקרופלייט המאפשרת מניפולציה מכנית תוך ביצוע בדיקות ביוכימיות סטנדרטיות. זה מושג באמצעות מגנטים המשולבים במכסה מיקרופלייט ליצירת פינצטה מגנטית מרובה. בפורמט זה, מופעל כוח על פני ביומולקולות המחוברות לחרוזים פרמגנטיים, שווה ערך לפינצטה מגנטית טיפוסית. המחקר מדגים את היישום של כלי זה עם מבחנים מבוססי FRET לניטור קונפורמציות חלבון. עם זאת, גישה זו ישימה באופן נרחב למערכות ביולוגיות שונות, החל ממדידת פעילות אנזימטית ועד להפעלת מסלולי איתות בתאים חיים.

Introduction

המכנוביולוגיה מתמקדת בהבנת האופן שבו התפשטות הכוחות הפיזיקליים בתוך התאים וביניהם, מווסתת את הפעילות התאית ^1,2 וכיצד זה מתאם עם הארגון והדינמיקה של חלבונים ותאים כאחד.

מדידות כוח של מולקולה בודדת חשפו כיצד משתמשים בכוח במערכות ביולוגיות, מחלבונים בודדים ועד תאים ורקמות שלמות 3,4,5,6,7. ניסויים מאתגרים אלה דורשים ציוד מיוחד ומומחיות טכנית. לעומת זאת, ניתן לבצע בדיקות ביוכימיות סטנדרטיות בתפוקה גבוהה יותר בציוד מסחרי זמין.

כאן, המחקר מתאר מבחן מכניביולוגיה המאפשר לבצע מניפולציה מבוססת פינצטה מגנטית ובדיקות ביוכימיות יחד⁸. מגנטים מונחים על מכסה מיקרו-לוח מודפס בתלת מימד (איור 1A-D), המאפשר שימוש בקוראי לוחות מסחריים עבור הבדיקות. כוח מופעל על פני הביו-מולקולה המעניינת על ידי צימוד המולקולה לחלקיקים פרמגנטיים. לאחר מכן המגנטים מפעילים מתח על פני המולקולה. שינוי המרחק בין החלקיקים למגנטים מתאים את הכוח המופעל על פני הביו-מולקולה (איור 1E).

אנו מייצגים את השימוש בבדיקה זו באמצעות המנוע המולקולרי מבוסס האקטין, מיוזין VI. מיוזין VI מווסת על ידי קיפול לאחור תוך מולקולרי⁹. הוכח כי מיוזין VI קיים במצב מעוכב עצמי, לפיו קשירת חלבונים שותפים, כגון NDP52, מעוררת את התפתחות המיוזין VI^10,11. כדי לבצע בדיקות אלה, נשתמש במבנה בעל תווית כפולה של תחום הזנב של מיוזין VI עם GFP N-terminal ו-C-Terminal RFP לפיו קיפול חוזר של החלבון מייצר העברת אנרגיית תהודה פלואורסצנטית (FRET) בין GFP ל-RFP. מסוף ה-N נושא גם תג ביוטינילציה כדי לשתק את החלבון על פני השטח. אנו משתמשים בבדיקה זו בשילוב עם מדידות FRET כדי להראות כיצד כוח יכול להשפיע על קיפול לאחור של מיוזין VI.

Protocol

חלבונים לדוגמה הנדרשים לניסוי זה ורשימת ריאגנטים נמצאים בטבלת החומרים. יש לייצר חלבונים שווי ערך למערכת המחקר של המשתמש כדי למדוד שינויים בקונפורמציה.

מכסה מגנטי מודפס 1. 3D

1. תכנן מכסה מיקרו-פלטה כדי לאכלס את המגנטים בתוך מיקרו-פלטה של 24 בארות. ניתן להוריד קובץ CAD לדוגמה מ-GitHub¹². המדידות מוצגות באיור 1.
   הערה: ניתן לשנות את גובה הכן כדי לשנות את המרחק בין מגנטים למשטח כדי לשנות את הכוח המופעל. בנוסף, הכוח הסופי המופעל על החלקיק תלוי בגודל החלקיקים ובמרווח בין זוג המגנטים. משוואות לחישוב הכוח המופעל עבור חלקיקים של 1 מיקרומטר ו-2.8 מיקרומטר במרווחים של 0.5 מ"מ, 1 מ"מ ו-2 מ"מ ניתנות ב-Dos Santos et ^al.8. עבור הניסויים המתוארים כאן עם חלקיקים של 2.8 מיקרומטר ופער של 2 מ"מ, השתמש במשוואה 1.
   משוואה 1:
2. הדפס בתלת מימד מכסה מיקרופלייט באמצעות פוליאתילן טרפתלט גליקול (PETG) על מערכת מדפסת תלת מימד.
   הערה: השתמש במדפסת עם רזולוציית שכבה של 0.02 מ"מ כדי לאפשר דיוק ושחזור. ההשפעה של דיוק המדפסת נדונה ב- Dos Santos et ^al.8.
3. חבר זוגות של מגנטים Neodymium N42 קובייה 5 מ"מ באמצעות דבק אל הכן כאשר הקטבים המגנטיים מכוונים ליצירת השדה המכוון לתחתית המיקרו-פלטה.
4. השאר לפחות עמדה אחת ריקה כדי לשמש כבקרה ללא מגנט.
5. יש לאחסן בכלי אטום בגודל מספיק כדי להניח ולהסיר את המכסה בקלות.

2. שינוי משטח מיקרופלייט

1. קח מיקרופלייט נקי ולא מטופל עם תחתית זכוכית עם 24 בארות.
2. שטפו את הבארות פי 3 עם 500 מיקרוליטר של מאגר שטיפה (50 מ"מ Tris-HCl (pH 7.5) ו-50 מ"מ NaCl) בטמפרטורת החדר.
3. הוסיפו 200 מיקרוליטר של ביוטין-BSA (0.2 מ"ג/מ"ל) למאגר הכביסה והשאירו אותו ללא הפרעה למשך 15 דקות בטמפרטורת החדר.
   הערה: ביוטין-BSA משמש הן לפסיבציה והן לחיבור. ניתן להשתמש באסטרטגיות אחרות של פסיבציה והתקשרות פני השטח. לשימוש ראשון ואופטימיזציה, ניתן לשנות את ריכוז הביוטין-BSA עד 1 מ"ג/מ"ל.
4. שטפו את הבארות פי 3 עם 500 מיקרוליטר של מאגר כביסה.
5. הוסף 200 מיקרוליטר של סטרפטווידין (20 מיקרוגרם/מ"ל) במאגר הכביסה והשאיר אותו ללא הפרעה למשך 15 דקות בטמפרטורת החדר.
   הערה: לשימוש בפעם הראשונה, ניתן לשנות את ריכוז הסטרפטווידין עד 1 מ"ג/מ"ל.
6. הסר את התמיסה ולאחר מכן שטוף את הבארות פי 3 עם מאגר כביסה.
7. מכסים את הבארות במאגר כביסה של 500 מיקרוליטר.
8. יש לאחסן בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס עד שמוכן לשימוש. יש להשתמש בצלחות באותו יום.

3. הכנת דגימה: קיבוע חלבון

1. אפשר למיקרו-פלטת שהשתנתה על פני השטח להגיע לטמפרטורת החדר.
2. שוטפים את הבארות עם 500 מיקרוליטר של מאגר כביסה.
3. הוסף 100 ננומטר ביוטין-eGFP-Myosin VI Tail-mRFP (חלבון דגימת מלאי) ודגירה למשך 15 דקות בטמפרטורת החדר במאגר הכביסה.
   הערה: חלבון לדוגמה זה מיוצר כמתואר על ידי Dos Santos et ^al.8. הריכוזים וזמני הדגירה יכולים להשתנות בהתאם לחלבון.
4. שטפו את הבארות פי 3 עם 500 מיקרוליטר של מאגר כביסה.
5. הגדר את קורא הלוחות כדי להקליט ספקטרום פלואורסצנטי עבור GFP (עירור 490 ננומטר ופליטה 510-600 ננומטר) ו-RFP (עירור 560 ננומטר ופליטה 580-650 ננומטר) כדי לאשר את נוכחותם של חלבוני ההיתוך.
6. אם יש מחסור בחלבון, הגדל את הריכוז בשלב 3.3.
   הערה: קשירה לקויה יכולה להיות קשורה לקשירת ביוטין-BSA ו/או סטרפטווידין לא מספקת, ולכן ניתן להגדיל את הכמויות פי 10.
7. במידת האפשר, בצעו מדידת סריקה היטב כדי לקבוע אם חלבון ההיתוך קשור על פני המיקרו-לוח (איור 2).
   הערה: מדידה זו תתעד את עוצמת הקרינה בנקודות ספציפיות על פני באר המיקרו-לוחית. זה יגלה אם החלבון קשור על פני הבאר.
8. ודא שהאות אחיד (בטווח של 5%) במרכז הבאר שבה מתרחשת מדידת הבדיקה.

4. הכנת חרוזים מגנטיים

1. מערבולת הבקבוקון של חרוזים פרמגנטיים של 2.8 מיקרומטר עם חלבון רקומביננטי A (טבלת חומרים) למשך 30 שניות כדי להשעות מחדש את החרוזים.
2. העבירו את הנפח המתאים ל -1 מ"ג חרוזים פרמגנטיים לצינור של 1.5 מ"ל.
3. הנח את הצינור במבודד מגנטי (טבלת חומרים) ולאחר מכן הסר את הסופרנטנט.
4. השעו מחדש את החרוזים ב-200 מיקרוליטר של PBS על ידי פיפטינג עדין של התמיסה למעלה ולמטה.
5. הנח את הצינור במבודד המגנטי ולאחר מכן הסר את הסופרנטנט.
6. חזור על שלב הכביסה 3x.
7. לדלל 10 מיקרוגרם של נוגדן Anti-RFP ב-200 מיקרוליטר של PBS.
8. בודד את החרוזים במבודד המגנטי ולאחר מכן השהה מחדש בתמיסת הנוגדנים.
9. סובב ב -20 סל"ד למשך 10 דקות בטמפרטורת החדר על מסובב ספסל.
10. הנח את הצינור במבודד המגנטי והסר את הסופרנטנט.
11. שטפו 3 פעמים ב-PBS.
12. השעו מחדש את החרוזים ב -200 מיקרוליטר של מאגר כביסה.
13. כדי לאשר קיבוע נוגדנים על החרוזים, דגרו את החרוזים העמוסים בנוגדנים בתמיסה של חלבון היתוך RFP של >1 מיקרומטר.
    הערה: ודא חזותית אם החלבון מבודד על ידי החרוזים.
14. לחלופין, מדוד את עוצמת הקרינה של הסופרנטנט (עירור 560 ננומטר ופליטה 580-650 ננומטר) עבור RFP בספקטרומטר פלואורסצנטי.

5. הכנה לדוגמא: חיבור חרוזים

1. הוסף 10 מיקרוגרם של היתוך החרוזים-נוגדנים הפרמגנטיים המדולל במאגר הכביסה (200 מיקרוליטר) לבארות המיקרו-פלייט הקשורות לחלבון.
2. אל תניח חרוזים בבאר בקרה אחת כדי לבדוק את השפעת החרוזים על האות הפלואורסצנטי. הכן דגימת בקרה ללא נוגדנים כדי לקבוע אינטראקציות לא ספציפיות עם החרוזים.
3. דגרו את המיקרופלטה בטמפרטורת החדר למשך 30 דקות.
4. שטפו את הבארות פי 3 עם 500 מיקרוליטר של מאגר כביסה.
5. אם זמין באופן מקומי, בדוק שהחרוזים קשורים לפני השטח במיקרוסקופ שדה בהיר. אם יש מחסור בחרוזים, הגדל את הריכוז בשלב 5.1 עד 500 מיקרוגרם/מ"ל.

6. רכישת נתונים

1. הנח את המיקרופלייט, ללא מכסה, לקורא צלחות פלורסנט בטמפרטורה של 25 מעלות צלזיוס.
2. הגדר את קורא הצלחות כדי להקליט ספקטרום פלואורסצנטי עבור GFP (עירור 490 ננומטר ופליטה 510-600 ננומטר) ו-RFP (עירור 560 ננומטר ופליטה 580-650 ננומטר) כדי לאשר את נוכחותם של חלבוני ההיתוך.
   הערה: מדוד/הקלט את ספקטרום הקרינה דרך החלק התחתון של המיקרופלייט כדי להניח את המכסה מעל. לכן, יש לבחור קורא מיקרו-פלטות מתאים.
3. רשום ספקטרום פלואורסצנטי FRET (עירור 490 ננומטר ופליטה 510-650 ננומטר), או עקוב אחר הקרינה ב-510 ננומטר ו-610 ננומטר עם עירור ב-490 ננומטר. זה מוגדר בהתאם להנחיות היצרן.
4. הסר את המיקרו-פלטת מהקורא והוסף את המכסה המגנטי.
5. חזור לקורא הצלחות והשאיר את הדגימה למשך 2 דקות.
6. חזור על מדידת ה-FRET, כמו בשלב 6.3.

7. ניתוח נתונים

1. ייצא את הנתונים לייבוא לגיליון אלקטרוני (למשל, Excel).
2. חלץ ידנית את הנתונים עבור תורם GFP ב-510 ננומטר ומקבל RFP ב-610 ננומטר.
3. חשב FRET יחסי באמצעות משוואה 2 עבור כל תנאי.
   משוואה 2:
   A: עוצמת המקבל (RFP 610 ננומטר), D: עוצמת התורם (GFP 510 ננומטר).
   הערה: השתמש ב-RFP הרקומביננטי באותם תנאי עירור ופליטה כדי לשלוט בעירור הרקע של המקבל.

תוצאות

איור 2 מציג דוגמה למדידת סריקת באר שבה עוצמת הקרינה של GFP נרשמה במרווחים של 1 מ"מ על פני באר המיקרו-לוחית. מדידות פלואורסצנטיות אופייניות מבוצעות במיקום המרכזי של באר המיקרופלייט (מיקום 8,8 באיור 2); לכן חשוב שיהיה חלבון קשור במיקום זה. כפי שמו...

Discussion

גישה זו מאפשרת ליישם בקלות מדידות מבוססות כוח במיקרופלייט באמצעות קוראי לוחות פלורסנט. חשוב לציין, פורמט בדיקה זה מניח שיש חלבון פונקציונלי כאשר הוא קשור למשטח. לכן, נדרש ידע מוקדם לפני תחילת המדידות הללו כדי להבטיח פעילות חלבון. כדאי גם לוודא שקשירת המולקולות לחרוזים ה?...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
24 well glass-bottom microplate	Cellvis	P24-1.5H-N	Multiple sources are available. Unless needed, it is best to avoid treated surfaces and we use Imaging grade glass N1.5.
Anti-RFP antibody	Abcam	ab290	Multiple sources are available but must ensure there is minimal reactivity with GFP.
Bench top light microscope	Optika	IM-3
Bench top Rotator	Cole-Palmer-Stuart	SB3
Biotin-BSA	Sigma Aldrich	A8549
CAD Software - Sketch Up Educator	Sketch Up		Alternative CAD softwares can be used. Users should ensure the file formats are compatiable with their 3D printer.
Dynabeads Protein A	Fisher Scientific	10746713	2.8 µm paramagnetic beads with recombinant Protein A
Impact contact adhesive	EVO-STIK
MagnaRack magnetic separation rack	ThermoFisher Scientific	CS15000	Magnetic Isolator
NaCl	Fisher Scientific	10316943
Neodymium N42 5mm cube Magnets	Supermagnete	W-05-N
Plate Reader - ClarioStar	BMG Labtech		All plate reader systems can be used where measurements are possible from under the microplate. The magnet lid excludes standard measurements from above
Streptavidin	Sigma Aldrich	189730
Tris-HCl	Fisher Scientific	10142400
Ultimaker PETG Filament	Ultimaker
Ultimaker S3 - 3D printer	Ultimaker