微孔板形式的磁镊

摘要

在这里，我们描述了使用一种新型微孔板测定法在进行集成生化测定时能够对生物分子进行机械作。这是使用用磁铁改性的微孔板盖在微孔板上形成多个静态磁镊来实现的。

摘要

机械生物学描述了生物材料的物理力和机械特性如何影响生理学和疾病。通常，这些方法是有限的单分子方法，这限制了它们的可用性。为了满足这一需求，开发了一种微孔板检测，可以在进行标准生化检测的同时进行机械作。这是通过使用嵌入微孔板盖中的磁铁来创建多个磁镊来实现的。在这种形式中，力施加在连接到顺磁珠的生物分子上，相当于典型的磁性镊子。该研究证明了该工具与基于 FRET 的分析一起用于监测蛋白质构象。然而，这种方法广泛适用于不同的生物系统，从测量酶活性到激活活细胞中的信号通路。

引言

机械生物学侧重于了解细胞内部和细胞之间的物理力传播如何调节细胞活动 ^1,2 以及这与蛋白质和细胞的组织和动力学有何关联。

单分子力测量揭示了力在生物系统中的使用方式，从单个蛋白质到整个细胞和组织 3,4,5,6,7。这些具有挑战性的实验需要专门的设备和技术专长。相反，标准生化分析可以在现成的商用设备中以更高的通量进行。

在这里，该研究描述了一种机械生物学测定，该测定能够将基于磁性镊子的作和生化测定一起进行⁸。将磁铁放置在 3D 打印的微孔板盖上（图 1A-D），以便使用商用读板器进行检测。通过将分子与顺磁性粒子偶联，将力施加到感兴趣的生物分子上。然后磁铁在整个分子上施加张力。改变颗粒和磁铁之间的距离会调整施加在生物分子上的力（图 1E）。

我们代表了使用基于肌动蛋白的分子马达 Myosin VI 进行该测定的用途。肌球蛋白 VI 受分子内背折叠⁹ 的调节。肌球蛋白 VI 已被证明以自身抑制状态存在，因此伴侣蛋白（如 NDP52）的结合会触发肌球蛋白 VI^{的展开 10,11}。为了进行这些分析，我们将使用具有 N 端 GFP 和 C 端 RFP 的肌球蛋白 VI 尾部结构域的双标记构建体，从而蛋白质的背折叠在 GFP 和 RFP 之间产生荧光共振能量转移 （FRET）。N 端还带有生物素化标签，可将蛋白质固定在表面。我们将该测定与 FRET 测量结合使用，以展示力如何影响肌球蛋白 VI 反向折叠。

研究方案

本实验所需的样品蛋白质和试剂列表可在 材料表中找到。应为用户的研究系统生产等效蛋白以测量构象变化。

1. 3D 印刷磁性盖

1. 设计一个微孔板盖，将磁体容纳在 24 孔微孔板中。可以从 GitHub¹² 下载示例 CAD 文件。测量结果如图 1 所示。
   注意：可以改变基座的高度以改变磁铁和表面之间的距离，从而改变施加的力。此外，施加在颗粒上的最终力取决于颗粒大小和磁体对之间的间隙。Dos Santos 等人给出了计算 1 μm 和 2.8 μm 颗粒在 0.5 mm、1 mm 和 2 mm 间隙下施加力的^方程8。对于此处描述的使用 2.8 μm 颗粒和 2 mm 间隙的实验，请使用公式 1。
   公式 1：
2. 在 3D 打印机系统上使用聚对苯二甲酸乙二醇酯 （PETG） 3D 打印微孔板盖。
   注意：使用层分辨率为 0.02 mm 的打印机，以实现准确性和可重复性。Dos Santos 等人8 讨论了打印机准确性^的影响。
3. 使用粘合剂将成对的 5 mm 立方体钕 N42 磁铁连接到基座上，磁极的方向形成指向微孔板底部的磁场。
4. 至少留出 1 个位置为空，以用作无磁控制。
5. 存放在足够大小的密封容器中，以便于放置和取下盖子。

2. 微孔板表面改性

1. 取干净的、未经处理的玻璃底 24 孔微孔板。
2. 在室温下用 500 μL 洗涤缓冲液（50 mM Tris-HCl （pH 7.5） 和 50 mM NaCl）洗涤孔 3 次。
3. 在洗涤缓冲液中加入 200 μL 生物素-BSA （0.2 mg/mL），并在室温下保持 15 分钟不受干扰。
   注：生物素-BSA 用于钝化和附着。可以使用其他钝化和表面附着策略。对于首次使用和优化，生物素-BSA 的浓度可以变化到 1 mg/mL。
4. 用 500 μL 洗涤缓冲液洗涤孔 3 次。
5. 在洗涤缓冲液中加入 200 μL 链霉亲和素 （20 μg/mL），并在室温下静置 15 分钟。
   注：首次使用时，链霉亲和素的浓度可变化至 1 mg/mL。
6. 去除溶液，然后用洗涤缓冲液洗涤孔 3 次。
7. 用 500 μL 洗涤缓冲液覆盖孔。
8. 在 4 °C 下储存直至准备使用。板应在同一天使用。

3. 样品制备：蛋白质固定

1. 让表面改性的微孔板达到室温。
2. 用 500 μL 洗涤缓冲液洗涤孔。
3. 加入 100 nM 生物素-eGFP-肌球蛋白 VI Tail-mRFP（储备样品蛋白），并在室温下在洗涤缓冲液中孵育 15 分钟。
   注：该示例蛋白质的产生方式如 Dos Santos 等人 ⁸ 所述。浓度和孵育时间可能因蛋白质而异。
4. 用 500 μL 洗涤缓冲液洗涤孔 3 次。
5. 设置读板器以记录 GFP（激发 490 nm 和发射 510-600 nm）和 RFP（激发 560 nm 和发射 580-650nm）的荧光光谱，以确认融合蛋白的存在。
6. 如果缺乏蛋白质，请在步骤 3.3 中增加浓度。
   注：结合不良可能与生物素-BSA 和/或链霉亲和素结合不足有关，因此，量可以增加 10 倍。
7. 如果可能，进行孔扫描测量以确定融合蛋白是否结合在微孔板上（图 2）。
   注意：此测量将记录微孔板孔中特定点的荧光强度。它将揭示蛋白质是否在孔中结合。
8. 确保信号在进行分析测量的孔中心均匀（在 5% 以内）。

4. 磁珠制备

1. 用重组蛋白 A（材料表）涡旋 2.8 μm 顺磁性珠小瓶 30 秒以重悬珠子。
2. 将相当于 1 mg 顺磁珠的体积转移到 1.5 mL 试管中。
3. 将试管放入磁隔离器（材料表）中，然后去除上清液。
4. 轻轻上下吹打溶液，将珠子重悬于 200 μL PBS 中。
5. 将试管放入磁隔离器中，然后去除上清液。
6. 重复洗涤步骤 3 次。
7. 在 200 μL PBS 中稀释 10 μg 抗 RFP 抗体。
8. 在磁性隔离器中分离磁珠，然后重悬于抗体溶液中。
9. 在室温下在台式旋转器上以 20 rpm 旋转 10 分钟。
10. 将试管放入磁隔离器中并去除上清液。
11. 在 PBS 中洗涤 3 次。
12. 将微珠重悬于 200 μL 洗涤缓冲液中。
13. 为了确认抗体固定在磁珠上，将载有抗体的磁珠与 >1 μM RFP 融合蛋白的溶液一起孵育。
    注：目视确认蛋白质是否被磁珠分离。
14. 或者，在荧光光谱仪中测量 RFP 的上清液的荧光强度（激发 560 nm 和发射 580-650nm）。

5. 样品制备：珠子附着

1. 将 10 μg 在洗涤缓冲液 （200 μL） 中稀释的顺磁珠-抗体融合物添加到蛋白质结合的微孔板孔中。
2. 不要将磁珠放在一个对照孔中以检查磁珠对荧光信号的影响。制备不含抗体的对照样品，以确定与磁珠的任何非特异性相互作用。
3. 在室温下孵育微孔板 30 分钟。
4. 用 500 μL 洗涤缓冲液洗涤孔 3 次。
5. 如果当地可用，请检查珠子是否与明场显微镜上的表面结合。如果缺少珠子，则在步骤 5.1 中将浓度增加到 500 μg/mL。

6. 数据采集

1. 将微孔板（不带盖）放入 25 °C 的荧光读板器中。
2. 设置读板器以记录 GFP（激发 490 nm 和发射 510-600 nm）和 RFP（激发 560 nm 和发射 580-650 nm）的荧光光谱，以确认融合蛋白的存在。
   注意：通过微孔板底部测量/记录荧光光谱，将盖子放在顶部。因此，应选择合适的酶标仪。
3. 记录 FRET 荧光光谱（激发 490 nm，发射波长 510-650 nm），或用 490 nm 激发监测 510 nm 和 610 nm 的荧光。这是根据制造商的指导进行设置的。
4. 从微孔板检测仪中取出微孔板并盖上磁性盖。
5. 返回读板器，将样品放置 2 分钟。
6. 重复 FRET 测量，如步骤 6.3 所示。

7. 数据分析

1. 将要导入的数据导出到电子表格（例如 Excel）中。
2. 手动提取 510 nm 处供体 GFP 和 610 nm 处受体 RFP 的数据。
3. 对于每个条件，使用公式 2 计算相对 FRET值。
   公式 2：
   A：受体强度 （RFP 610 nm），D：供体强度 （GFP 510 nm）。
   注：在相同的激发和发射条件下使用重组 RFP 来控制受体的背景激发。

结果

图 2 显示了一个孔扫描测量示例，其中 GFP 的荧光强度在整个微孔板孔中以 1 mm 的间隔记录。典型的荧光测量在微孔板孔的中心位置（ 图 8,8 中的位置 2）进行;因此，在该位置存在结合蛋白很重要。如图 2 所示，在几毫米半径内的孔中心强度最高。通常，固定最好远离孔的边缘，这可能是由于蛋白质与侧?...

讨论

这种方法使得使用荧光读板机在微孔板中很容易地进行基于力的测量。重要的是，这种检测形式假设当它与表面结合时存在功能性蛋白质。因此，在开始这些测量之前需要先验知识，以确保存在蛋白质活性。确保分子与顺磁珠和表面的结合针对每个系统进行优化也是有益的。

这个概念可以修改为在所有类型的微孔板中发挥作用;但是，磁力架的选择?...

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
24 well glass-bottom microplate	Cellvis	P24-1.5H-N	Multiple sources are available. Unless needed, it is best to avoid treated surfaces and we use Imaging grade glass N1.5.
Anti-RFP antibody	Abcam	ab290	Multiple sources are available but must ensure there is minimal reactivity with GFP.
Bench top light microscope	Optika	IM-3
Bench top Rotator	Cole-Palmer-Stuart	SB3
Biotin-BSA	Sigma Aldrich	A8549
CAD Software - Sketch Up Educator	Sketch Up		Alternative CAD softwares can be used. Users should ensure the file formats are compatiable with their 3D printer.
Dynabeads Protein A	Fisher Scientific	10746713	2.8 µm paramagnetic beads with recombinant Protein A
Impact contact adhesive	EVO-STIK
MagnaRack magnetic separation rack	ThermoFisher Scientific	CS15000	Magnetic Isolator
NaCl	Fisher Scientific	10316943
Neodymium N42 5mm cube Magnets	Supermagnete	W-05-N
Plate Reader - ClarioStar	BMG Labtech		All plate reader systems can be used where measurements are possible from under the microplate. The magnet lid excludes standard measurements from above
Streptavidin	Sigma Aldrich	189730
Tris-HCl	Fisher Scientific	10142400
Ultimaker PETG Filament	Ultimaker
Ultimaker S3 - 3D printer	Ultimaker