Pinzette magnetiche in formato micropiastra

Riepilogo

Qui, descriviamo l'uso di un nuovo saggio su micropiastra per consentire la manipolazione meccanica di biomolecole durante l'esecuzione di saggi biochimici d'insieme. Ciò si ottiene utilizzando un coperchio per micropiastre modificato con magneti per creare più pinzette magnetiche statiche attraverso la micropiastra.

Abstract

La meccanobiologia descrive come le forze fisiche e le proprietà meccaniche del materiale biologico contribuiscono alla fisiologia e alla malattia. In genere, questi approcci sono metodi limitati a singola molecola, il che ne limita la disponibilità. Per rispondere a questa esigenza, è stato sviluppato un saggio su micropiastra che consente la manipolazione meccanica durante l'esecuzione di saggi biochimici standard. Ciò si ottiene utilizzando magneti incorporati nel coperchio di una micropiastra per creare più pinzette magnetiche. In questo formato, la forza viene esercitata attraverso biomolecole collegate a perle paramagnetiche, equivalenti a una tipica pinzetta magnetica. Lo studio dimostra l'applicazione di questo strumento con saggi basati su FRET per monitorare le conformazioni proteiche. Tuttavia, questo approccio è ampiamente applicabile a diversi sistemi biologici che vanno dalla misurazione dell'attività enzimatica fino all'attivazione di vie di segnalazione nelle cellule vive.

Introduzione

La meccanobiologia si concentra sulla comprensione di come la propagazione delle forze fisiche all'interno e tra le cellule regoli l'attività cellulare ^1,2 e di come questa sia correlata con l'organizzazione e la dinamica sia delle proteine che delle cellule.

Le misurazioni della forza di una singola molecola hanno rivelato come la forza viene utilizzata nei sistemi biologici, dalle singole proteine alle cellule e ai tessuti interi 3,4,5,6,7. Questi esperimenti impegnativi richiedono attrezzature specializzate e competenze tecniche. Al contrario, i saggi biochimici standard possono essere eseguiti a una produttività più elevata in apparecchiature commerciali prontamente disponibili.

Qui, lo studio descrive un test meccanobiologico che consente di eseguire insieme la manipolazione basata su pinzette magnetiche e i saggi biochimici⁸. I magneti sono posizionati su un coperchio per micropiastre stampato in 3D (Figura 1A-D), consentendo l'uso di lettori di piastre commerciali per i saggi. La forza viene applicata attraverso la biomolecola di interesse accoppiando la molecola a particelle paramagnetiche. I magneti esercitano quindi una tensione attraverso la molecola. Alterando la distanza tra le particelle e i magneti, si regola la forza esercitata attraverso la biomolecola (Figura 1E).

Rappresentiamo l'uso di questo test utilizzando il motore molecolare a base di actina, Myosin VI. La miosina VI è regolata dal backfolding intramolecolare⁹. È stato dimostrato che la miosina VI esiste in uno stato autoinibito, in cui il legame di proteine partner, come NDP52, innesca il dispiegamento della miosina VI^10,11. Per eseguire questi saggi, utilizzeremo un costrutto a doppia marcatura del dominio di coda VI della miosina con una GFP N-terminale e una RFP C-terminale in cui il backfolding della proteina genera un trasferimento di energia di risonanza di fluorescenza (FRET) tra GFP e RFP. L'N-terminale porta anche un tag di biotinilazione per immobilizzare la proteina sulla superficie. Utilizziamo questo test in combinazione con le misurazioni FRET per mostrare come la forza può influire sul ripiegamento posteriore della miosina VI.

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Protocollo

Le proteine campione necessarie per questo esperimento e un elenco di reagenti si trovano nella Tabella dei materiali. Dovrebbero essere prodotte proteine equivalenti per il sistema di studio dell'utente per misurare i cambiamenti di conformazione.

1. 3D coperchio magnetico stampato

1. Progetta un coperchio per micropiastre per alloggiare i magneti all'interno di una micropiastra a 24 pozzetti. Un esempio di file CAD può essere scaricato da GitHub¹². Le misurazioni sono mostrate nella Figura 1.
   NOTA: L'altezza del piedistallo può essere modificata per modificare la distanza tra i magneti e la superficie per modificare la forza applicata. Inoltre, la forza finale esercitata sulla particella dipende dalla dimensione delle particelle e dallo spazio tra la coppia di magneti. Le equazioni per calcolare la forza applicata per particelle da 1 μm e 2,8 μm a spazi di 0,5 mm, 1 mm e 2 mm sono fornite in Dos Santos et ^al.8. Per gli esperimenti qui descritti con particelle da 2,8 μm e uno spazio di 2 mm, utilizzare l'equazione 1.
   Equazione 1:
2. Stampa in 3D il coperchio di una micropiastra utilizzando il polietilene tereftalato glicole (PETG) su un sistema di stampa 3D.
   NOTA: Utilizzare una stampante con una risoluzione dello strato di 0,02 mm per garantire precisione e riproducibilità. L'impatto della precisione della stampante è stato discusso in Dos Santos et ^al.8.
3. Fissare coppie di magneti al neodimio N42 cubici da 5 mm utilizzando l'adesivo ai piedistalli con i poli magnetici orientati in modo da creare il campo diretto verso il fondo della micropiastra.
4. Lasciare almeno 1 posizione vuota per fungere da controllo senza magnete.
5. Conservare in un contenitore sigillato di dimensioni sufficienti per posizionare e rimuovere facilmente il coperchio.

2. Modifica della superficie della micropiastra

1. Prelevare una micropiastra a 24 pozzetti pulita e non trattata con fondo di vetro.
2. Lavare i pozzetti 3 volte con 500 μL di tampone di lavaggio (50 mM di Tris-HCl (pH 7,5) e 50 mM di NaCl) a temperatura ambiente.
3. Aggiungere 200 μL di biotina-BSA (0,2 mg/mL) nel tampone di lavaggio e lasciarlo indisturbato per 15 minuti a temperatura ambiente.
   NOTA: La biotina-BSA viene utilizzata sia per la passivazione che per l'attaccamento. Possono essere utilizzate altre strategie di passivazione e di fissaggio superficiale. Per il primo utilizzo e l'ottimizzazione, la concentrazione di biotina-BSA può essere variata fino a 1 mg/mL.
4. Lavare i pozzetti 3 volte con 500 μL di tampone di lavaggio.
5. Aggiungere 200 μL di streptavidina (20 μg/mL) nel tampone di lavaggio e lasciarlo indisturbato per 15 minuti a temperatura ambiente.
   NOTA: Per il primo utilizzo, la concentrazione di streptavidina può essere variata fino a 1 mg/mL.
6. Rimuovere la soluzione e quindi lavare i pozzetti 3 volte con un tampone di lavaggio.
7. Coprire i pozzetti con 500 μL di tampone di lavaggio.
8. Conservare a 4 °C fino al momento dell'uso. Le piastre devono essere utilizzate lo stesso giorno.

3. Preparazione del campione: immobilizzazione delle proteine

1. Lasciare che la micropiastra a superficie modificata raggiunga la temperatura ambiente.
2. Lavare i pozzetti con 500 μL di tampone di lavaggio.
3. Aggiungere 100 nM di biotina-eGFP-Miosina VI Tail-mRFP (proteina campione) e incubare per 15 minuti a temperatura ambiente in tampone di lavaggio.
   NOTA: Questa proteina di esempio è prodotta come descritto da Dos Santos et ^al.8. Le concentrazioni e i tempi di incubazione possono variare a seconda della proteina.
4. Lavare i pozzetti 3 volte con 500 μL di tampone di lavaggio.
5. Impostare il lettore di piastre per registrare gli spettri di fluorescenza per GFP (eccitazione 490 nm ed emissione 510-600 nm) e RFP (eccitazione 560 nm ed emissione 580-650 nm) per confermare la presenza delle proteine di fusione.
6. In caso di mancanza di proteine, aumentare la concentrazione al passaggio 3.3.
   NOTA: Uno scarso legame potrebbe essere correlato a un legame inadeguato con biotina-BSA e/o streptavidina e, pertanto, le quantità potrebbero essere aumentate di 10 volte.
7. Se possibile, eseguire una misurazione a scansione approfondita per determinare se la proteina di fusione è legata attraverso la micropiastra (Figura 2).
   NOTA: Questa misurazione registrerà l'intensità della fluorescenza in punti specifici del pozzetto della micropiastra. Rivelerà se la proteina è legata attraverso il pozzetto.
8. Assicurarsi che il segnale sia uniforme (entro il 5%) al centro del pozzetto in cui avviene la misurazione del saggio.

4. Preparazione delle microsfere magnetiche

1. Agitare la fiala di perle paramagnetiche da 2,8 μm con proteina A ricombinante (Tabella dei materiali) per 30 s per risospendere le perle.
2. Trasferire il volume corrispondente a 1 mg di perle paramagnetiche in una provetta da 1,5 mL.
3. Posizionare il tubo in un isolatore magnetico (Tabella dei materiali) e quindi rimuovere il surnatante.
4. Risospendere le microsfere in 200 μl di PBS pipettando delicatamente la soluzione su e giù.
5. Posizionare il tubo nell'isolatore magnetico e quindi rimuovere il surnatante.
6. Ripetere la fase di lavaggio 3 volte.
7. Diluire 10 μg di anticorpo anti-RFP in 200 μl di PBS.
8. Isolare le perle nell'isolatore magnetico e quindi risospenderle nella soluzione anticorpale.
9. Ruotare a 20 giri/min per 10 minuti a temperatura ambiente su un rotatore da banco.
10. Posizionare il tubo nell'isolatore magnetico e rimuovere il surnatante.
11. Lavare 3 volte in PBS.
12. Risospendere le perle in 200 μL di tampone di lavaggio.
13. Per confermare l'immobilizzazione degli anticorpi sulle perle, incubare le perle caricate con anticorpi con una soluzione di proteina di fusione RFP >1 μM.
    NOTA: Confermare visivamente se la proteina è isolata dalle perline.
14. In alternativa, misurare l'intensità di fluorescenza del surnatante (eccitazione 560 nm ed emissione 580-650 nm) per RFP in uno spettrometro a fluorescenza.

5. Preparazione del campione: attacco del tallone

1. Aggiungere 10 μg di fusione perlina paramagnetica-anticorpo diluita in tampone di lavaggio (200 μL) ai pozzetti della micropiastra legata alle proteine.
2. Non posizionare le perline in un pozzetto di controllo per verificare l'effetto delle perline sul segnale fluorescente. Preparare un campione di controllo senza anticorpi per determinare eventuali interazioni non specifiche con le microsfere.
3. Incubare la micropiastra a temperatura ambiente per 30 minuti.
4. Lavare i pozzetti 3 volte con 500 μL di tampone di lavaggio.
5. Se disponibile localmente, verificare che le perle siano legate alla superficie su un microscopio a campo chiaro. In caso di mancanza di microsfere, aumentare la concentrazione al passaggio 5.1 a 500 μg/mL.

6. Acquisizione dati

1. Posizionare la micropiastra, senza coperchio, in un lettore di piastre fluorescente a 25 °C.
2. Impostare il lettore di piastre per registrare gli spettri di fluorescenza per GFP (eccitazione 490 nm ed emissione 510-600 nm) e RFP (eccitazione 560 nm ed emissione 580-650 nm) per confermare la presenza delle proteine di fusione.
   NOTA: Misurare/registrare gli spettri di fluorescenza attraverso la parte inferiore della micropiastra per posizionare il coperchio sulla parte superiore. Pertanto, è necessario selezionare un lettore di micropiastre adatto.
3. Registra uno spettro di fluorescenza FRET (eccitazione 490 nm ed emissione 510-650 nm) o monitora la fluorescenza a 510 nm e 610 nm con eccitazione a 490 nm. Questa impostazione è in base alle linee guida del produttore.
4. Togliere la micropiastra dal lettore e aggiungere il coperchio magnetico.
5. Rimettere al lettore di piastre e lasciare il campione per 2 minuti.
6. Ripetere la misurazione FRET, come al punto 6.3.

7. Analisi dei dati

1. Esporta i dati per l'importazione in un foglio di calcolo (ad esempio, Excel).
2. Estrarre manualmente i dati per la GFP del donatore a 510 nm e la RFP dell'accettore a 610 nm.
3. Calcola il FRET relativo usando l'equazione 2 per ogni condizione.
   Equazione 2:
   A: intensità accettore (RFP 610 nm), D: intensità donatore (GFP 510 nm).
   NOTA: Utilizzare l'RFP ricombinante nelle stesse condizioni di eccitazione ed emissione per controllare l'eccitazione di fondo dell'accettore.

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Risultati

La Figura 2 mostra un esempio di misurazione a scansione di pozzetto in cui l'intensità di fluorescenza della GFP è stata registrata a intervalli di 1 mm attraverso il pozzetto della micropiastra. Le misure di fluorescenza tipiche vengono eseguite nella posizione centrale del pozzetto della micropiastra (posizione 8,8 nella Figura 2); È quindi importante che ci sia proteina legata in questa posizione. Come mostrato nella

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Discussione

Questo approccio consente di applicare prontamente misure basate sulla forza in una micropiastra utilizzando lettori di piastre fluorescenti. È importante sottolineare che questo formato di test presuppone la presenza di proteine funzionali quando sono legate a una superficie. Pertanto, è necessaria una conoscenza preliminare prima di intraprendere queste misurazioni per garantire che vi sia attività proteica. È anche utile assicurarsi che il legame delle molecole alle perle paramagn...

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Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
24 well glass-bottom microplate	Cellvis	P24-1.5H-N	Multiple sources are available. Unless needed, it is best to avoid treated surfaces and we use Imaging grade glass N1.5.
Anti-RFP antibody	Abcam	ab290	Multiple sources are available but must ensure there is minimal reactivity with GFP.
Bench top light microscope	Optika	IM-3
Bench top Rotator	Cole-Palmer-Stuart	SB3
Biotin-BSA	Sigma Aldrich	A8549
CAD Software - Sketch Up Educator	Sketch Up		Alternative CAD softwares can be used. Users should ensure the file formats are compatiable with their 3D printer.
Dynabeads Protein A	Fisher Scientific	10746713	2.8 µm paramagnetic beads with recombinant Protein A
Impact contact adhesive	EVO-STIK
MagnaRack magnetic separation rack	ThermoFisher Scientific	CS15000	Magnetic Isolator
NaCl	Fisher Scientific	10316943
Neodymium N42 5mm cube Magnets	Supermagnete	W-05-N
Plate Reader - ClarioStar	BMG Labtech		All plate reader systems can be used where measurements are possible from under the microplate. The magnet lid excludes standard measurements from above
Streptavidin	Sigma Aldrich	189730
Tris-HCl	Fisher Scientific	10142400
Ultimaker PETG Filament	Ultimaker
Ultimaker S3 - 3D printer	Ultimaker