マイクロプレート形式の磁気ピンセット

要約

ここでは、アンサンブル生化学的アッセイを実行しながら生体分子の機械的操作を可能にする新しいマイクロプレートアッセイの使用について説明します。これは、磁石で改造されたマイクロプレートの蓋を使用して、マイクロプレート全体に複数の静的磁気ピンセットを作成することで実現されます。

要約

メカノバイオロジーは、生体材料の物理的力と機械的特性が生理学と病気にどのように寄与するかを説明しています。通常、これらのアプローチは限られた単一分子の方法であるため、利用可能性が制限されます。このニーズに対応するため、標準的な生化学的アッセイを行いながら機械的な操作を可能にするマイクロプレートアッセイが開発されました。これは、マイクロプレートの蓋に組み込まれた磁石を使用して、複数の磁気ピンセットを作成することで実現されます。この形式では、常磁性ビーズに接続された生体分子全体に力が加えられ、これは一般的な磁気ピンセットに相当します。この研究では、このツールをFRETベースのアッセイと組み合わせてタンパク質のコンフォメーションをモニターする方法を実証しています。しかし、このアプローチは、酵素活性の測定から生細胞のシグナル伝達経路の活性化まで、さまざまな生物学的システムに広く適用できます。

概要

メカノバイオロジーは、細胞内および細胞間の物理的な力の伝播が細胞活動をどのように制御するか^1,2、およびこれがタンパク質と細胞の両方の組織とダイナミクスとどのように相関するかを理解することに焦点を当てています。

単一分子の力の測定により、単一のタンパク質から全細胞および組織3,4,5,6,7までの生物学的システムにおいて力がどのように使用されるかが明らかになりました。これらの困難な実験には、特殊な機器と技術的な専門知識が必要です。逆に、標準的な生化学的アッセイは、容易に入手できる市販の機器でより高いスループットで実施できます。

ここでは、この研究では、磁気ピンセットベースの操作と生化学的アッセイを一緒に実行できるようにする機械生物学アッセイについて説明します⁸。磁石は3Dプリントされたマイクロプレートの蓋(図1A-D)に配置され、アッセイに市販のプレートリーダーを使用できるようになります。力は、分子を常磁性粒子に結合することにより、目的の生体分子全体に加えられます。その後、磁石は分子全体に張力を及ぼします。粒子と磁石の間の距離を変更すると、生体分子全体に及ぼされる力が調整されます(図1E)。

このアッセイの使用は、アクチンベースの分子モーターであるミオシンVIを使用しています。ミオシンVIは分子内バックフォールディングによって調節されている⁹。ミオシンVIは自己阻害状態で存在し、NDP52などのパートナータンパク質の結合がミオシンVIのアンフォールディングを引き起こすことが示されています^10,11。これらのアッセイを実施するために、N末端GFPとC末端RFPを備えたミオシンVIテールドメインの二重標識構造を使用し、タンパク質のバックフォールディングによりGFPとRFPの間に蛍光共鳴エネルギー移動(FRET)を生成します。N末端には、タンパク質を表面に固定するためのビオチン化タグも付いています。このアッセイをFRET測定と組み合わせて使用し、力がミオシンVIのバックフォールディングにどのように影響するかを示します。

プロトコル

この実験に必要なタンパク質のサンプルと試薬のリストは、 材料表に記載されています。コンフォメーションの変化を測定するために、ユーザーの研究システムに対して同等のタンパク質を作製する必要があります。

1. 3Dプリントされた磁気蓋

1. 24ウェルマイクロプレート内に磁石を収納するマイクロプレートの蓋を設計します。サンプルのCADファイルはGitHub¹²からダウンロードできます。測定値を 図1に示します。
   注意: 台座の高さを変更して、磁石と表面の間の距離を変更し、加えられる力を変更できます。さらに、粒子に加えられる最終的な力は、粒子のサイズと磁石のペア間のギャップによって異なります。0.5 mm、1 mm、および2 mmのギャップで1 μmおよび2.8 μmの粒子に加えられる力を計算する式は、Dos Santos et ^al.8に示されています。ここで説明する2.8 μmの粒子と2 mmのギャップでの実験では、式1を使用します。
   方程式1:
2. ポリエチレンテレフタレートグリコール(PETG)を使用して、3Dプリンターシステムでマイクロプレートの蓋を3Dプリントします。
   注意: 精度と再現性を確保するために、レイヤー解像度が0.02mmのプリンターを使用してください。プリンターの精度の影響については、Dos Santos et ^al.8で議論されています。
3. 5 mm キューブのネオジム N42 磁石のペアを接着剤を使用して台座に取り付け、磁極を向けてマイクロプレートの底に向けられた磁場を作成します。
4. 磁石なしのコントロールとして機能するように、少なくとも 1 つの位置を空のままにします。
5. 蓋を容易に設置および取り外すのに十分なサイズの密閉容器に保管してください。

2. マイクロプレート表面改質

1. 清潔な未処理のガラス底24ウェルマイクロプレートを取ります。
2. ウェルを500 μLの洗浄バッファー(50 mM Tris-HCl(pH 7.5)および50 mM NaCl)で室温で3回洗浄します。
3. 200 μLのビオチン-BSA(0.2 mg/mL)を洗浄バッファーに加え、室温で15分間放置します。
   注:ビオチン-BSAは、不動態化と付着の両方に使用されます。他の不動態化および表面付着戦略を使用することができます。初めての使用と最適化のために、ビオチン-BSAの濃度を最大1 mg/mLまで変化させることができます。
4. ウェルを500μLの洗浄バッファーで3回洗浄します。
5. 200 μLのストレプトアビジン(20 μg/mL)を洗浄バッファーに加え、室温で15分間放置します。
   注:初めて使用する場合、ストレプトアビジンの濃度は最大1 mg / mLまで変更できます。.
6. 溶液を取り出し、ウェルを洗浄バッファーで3回洗浄します。
7. ウェルを500μLの洗浄バッファーで覆います。
8. 使用する準備ができるまで4°Cで保存してください。プレートは即日使用する必要があります。

3.サンプル調製:タンパク質の固定化

1. 表面改質マイクロプレートを室温に戻します。
2. ウェルを500 μLの洗浄バッファーで洗浄します。
3. 100 nM ビオチン-eGFP-ミオシン VI Tail-mRFP(ストックサンプルタンパク質)を添加し、洗浄バッファー中で室温で 15 分間インキュベートします。
   注:この例のタンパク質は、Dos Santosら⁸に記載されているように産生されます。濃度とインキュベーション時間は、タンパク質によって異なります。
4. ウェルを500μLの洗浄バッファーで3回洗浄します。
5. GFP(励起490nm、発光510-600nm)およびRFP(励起560nm、発光580-650nm)の蛍光スペクトルを記録するようにプレートリーダーを設定し、融合タンパク質の存在を確認します。
6. タンパク質が不足している場合は、ステップ3.3で濃度を上げます。
   注:結合不良は、ビオチン-BSAおよび/またはストレプトアビジンの結合が不十分であることに関連している可能性があるため、その量は10倍に増加する可能性があります。
7. 可能であれば、ウェルスキャン測定を行い、融合タンパク質がマイクロプレート全体に結合しているかどうかを判断します(図2)。
   注:この測定では、マイクロプレートウェル全体の特定のポイントでの蛍光強度を記録します。これにより、タンパク質がウェル全体に結合しているかどうかが明らかになります。
8. アッセイ測定が行われるウェルの中央でシグナルが均一(5 % 以内)であることを確認してください。

4. 磁気ビーズの調製

1. 2.8 μm常磁性ビーズのバイアルを組換えプロテインA(Table of Materials)で30秒間ボルテックスし、ビーズを再懸濁します。
2. 1 mgの常磁性ビーズに相当する容量を1.5 mLチューブに移します。
3. チューブを磁気アイソレータ(材料の表)に入れ、上清を取り除きます。
4. 200 μLのPBSにビーズを再び懸濁し、溶液を静かにピペッティングします。
5. チューブを磁気アイソレータに入れ、上清を取り除きます。
6. 洗浄手順を3回繰り返します。
7. 10 μgの抗RFP抗体を200 μLのPBSで希釈します。
8. 磁気アイソレータでビーズを単離し、抗体溶液に再懸濁します。
9. ベンチトップローテーターで室温で20rpmで10分間回転させます。
10. チューブを磁気アイソレータに入れ、上清を取り除きます。
11. PBSで3回洗ってください。
12. ビーズを200 μLの洗浄バッファーに再懸濁します。
13. ビーズへの抗体の固定化を確認するために、抗体をロードしたビーズを>1 μM RFP融合タンパク質の溶液とインキュベートします。
    注:タンパク質がビーズによって単離されているかどうかを視覚的に確認してください。
14. あるいは、蛍光分光器でRFPの上清の蛍光強度(励起560nm、発光580-650nm)を測定します。

5.サンプル調製:ビーズアタッチメント

1. 洗浄バッファー(200 μL)で希釈した常磁性ビーズ-抗体融合液10 μgをタンパク質結合マイクロプレートウェルに加えます。
2. ビーズが蛍光シグナルに及ぼす影響を確認するために、ビーズを1つのコントロールウェルに入れないでください。抗体を含まないコントロールサンプルを調製して、ビーズとの非特異的相互作用を測定します。
3. マイクロプレートを室温で30分間インキュベートします。
4. ウェルを500μLの洗浄バッファーで3回洗浄します。
5. 局所的に利用可能な場合は、ビーズが明視野顕微鏡で表面に結合していることを確認します。ビーズが不足している場合は、ステップ5.1の濃度を500 μg/mLに増やします。

6. データ取得

1. 蓋をせずにマイクロプレートを25°Cの蛍光プレートリーダーに入れます。
2. GFP(励起490 nm、蛍光510-600 nm)およびRFP(励起560 nm、蛍光580-650 nm)の蛍光スペクトルを記録するようにプレートリーダーをセットアップし、融合タンパク質の存在を確認します。
   注:マイクロプレートの底部から蛍光スペクトルを測定/記録し、蓋を上に置きます。したがって、適切なマイクロプレートリーダーを選択する必要があります。
3. FRET蛍光スペクトル(励起490 nm、蛍光510-650 nm)を記録するか、510 nmおよび610 nmの蛍光を490 nmの励起でモニターします。これは、製造元のガイダンスに従って設定されます。
4. マイクロプレートをリーダーから取り外し、磁気蓋を追加します。
5. プレートリーダーに戻り、サンプルを2分間放置します。
6. 手順6.3のように、FRET測定を繰り返します。

7. データ分析

1. データをスプレッドシート(Excelなど)にインポートします。
2. 510 nm のドナー GFP と 610 nm のアクセプター RFP のデータを手動で抽出します。
3. 各条件の式 2 を使用して相対 FRET を計算します。
   式 2:
   A:アクセプター強度(RFP 610 nm)、D:ドナー強度(GFP 510 nm)。
   注:同じ励起および放出条件下で組換えRFPを使用して、アクセプターのバックグラウンド励起を制御します。

結果

図2 は、GFPの蛍光強度がマイクロプレートウェル全体で1mm間隔で記録されたウェルスキャン測定の例を示しています。一般的な蛍光測定は、マイクロプレートウェルの中心位置( 図2の位置8,8)で行います。したがって、この場所に結合タンパク質が存在することが重要です。 図2に示すように、強度は?...

ディスカッション

このアプローチにより、蛍光プレートリーダーを使用して、力ベースの測定をマイクロプレートに容易に適用できます。重要なことは、このアッセイフォーマットは、表面に結合したときに機能的なタンパク質が存在することを前提としています。したがって、これらの測定に着手する前に、タンパク質活性があることを確認するための事前知識が必要です。また、...

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
24 well glass-bottom microplate	Cellvis	P24-1.5H-N	Multiple sources are available. Unless needed, it is best to avoid treated surfaces and we use Imaging grade glass N1.5.
Anti-RFP antibody	Abcam	ab290	Multiple sources are available but must ensure there is minimal reactivity with GFP.
Bench top light microscope	Optika	IM-3
Bench top Rotator	Cole-Palmer-Stuart	SB3
Biotin-BSA	Sigma Aldrich	A8549
CAD Software - Sketch Up Educator	Sketch Up		Alternative CAD softwares can be used. Users should ensure the file formats are compatiable with their 3D printer.
Dynabeads Protein A	Fisher Scientific	10746713	2.8 µm paramagnetic beads with recombinant Protein A
Impact contact adhesive	EVO-STIK
MagnaRack magnetic separation rack	ThermoFisher Scientific	CS15000	Magnetic Isolator
NaCl	Fisher Scientific	10316943
Neodymium N42 5mm cube Magnets	Supermagnete	W-05-N
Plate Reader - ClarioStar	BMG Labtech		All plate reader systems can be used where measurements are possible from under the microplate. The magnet lid excludes standard measurements from above
Streptavidin	Sigma Aldrich	189730
Tris-HCl	Fisher Scientific	10142400
Ultimaker PETG Filament	Ultimaker
Ultimaker S3 - 3D printer	Ultimaker