قياس قدرة استيراد البروتين للميتوكوندريا العضلية الهيكلية

Ashley N. Oliveira; Brandon J. Richards; David  A. Hood

doi:10.3791/63055

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

Summary

الميتوكوندريا هي العضيات الأيضية الرئيسية التي تظهر مستوى عال من اللدونة الظاهرية في العضلات الهيكلية. استيراد البروتينات من السيتوسول هو مسار حاسم للتكوين الحيوي للعضيات ، وهو ضروري لتوسيع الشبكة والحفاظ على وظيفة الميتوكوندريا. لذلك ، فإن استيراد البروتين بمثابة مقياس للصحة الخلوية.

Abstract

الميتوكوندريا هي العضيات الأيضية والتنظيمية الرئيسية التي تحدد إمدادات الطاقة وكذلك الصحة العامة للخلية. في العضلات الهيكلية ، توجد الميتوكوندريا في سلسلة من المورفولوجيا المعقدة ، بدءا من العضيات البيضاوية الصغيرة إلى شبكة واسعة تشبه الشبكية. لطالما كان فهم كيفية توسع شبكة الميتوكوندريا وتطورها استجابة للمحفزات المتنوعة مثل التغيرات في الطلب على الطاقة موضوعا للبحث. أحد الجوانب الرئيسية لهذا النمو ، أو التكوين الحيوي ، هو استيراد بروتينات السلائف ، المشفرة أصلا بواسطة الجينوم النووي ، والتي يتم تصنيعها في السيتوسول ، ونقلها إلى مقصورات فرعية مختلفة من الميتوكوندريا. طورت الميتوكوندريا آلية متطورة لعملية الاستيراد هذه ، تتضمن العديد من قنوات الغشاء الداخلية والخارجية الانتقائية ، والمعروفة باسم آلة استيراد البروتين (PIM). يعتمد الاستيراد إلى الميتوكوندريون على إمكانات الغشاء القابلة للحياة وتوافر ATP المشتق من العضيات من خلال الفسفرة التأكسدية. لذلك يمكن أن يكون قياسه بمثابة مقياس لصحة العضيات. يظهر PIM أيضا مستوى عاليا من اللدونة التكيفية في العضلات الهيكلية التي ترتبط بإحكام بحالة الطاقة للخلية. على سبيل المثال ، ثبت أن التدريب على التمرين يزيد من قدرة الاستيراد ، في حين أن عدم استخدام العضلات يقلل من ذلك ، ويتزامن ذلك مع التغيرات في علامات محتوى الميتوكوندريا. على الرغم من أن استيراد البروتين هو خطوة حاسمة في التكوين الحيوي وتوسع الميتوكوندريا ، إلا أن العملية لم تدرس على نطاق واسع في العضلات الهيكلية. وبالتالي ، توضح هذه الورقة كيفية استخدام الميتوكوندريا المعزولة والتي تعمل بكامل طاقتها من العضلات الهيكلية لقياس قدرة استيراد البروتين من أجل تعزيز فهم أكبر للطرق المعنية وتقدير أهمية مسار دوران العضيات في التمرين والصحة والمرض.

Introduction

الميتوكوندريا هي عضيات موجودة في مورفولوجيا معقدة في أنواع مختلفة من الخلايا ومن المسلم به أنها تمتلك مجموعة متزايدة من الوظائف التي تعتبر حاسمة للصحة الخلوية. على هذا النحو ، لم يعد من الممكن تقليصها إلى مجرد عضيات منتجة للطاقة. الميتوكوندريا هي منظمات التمثيل الغذائي الرئيسية ، ومحددات مصير الخلية ، ومحاور الإشارات ، والتي يمكن أن تكون وظائفها بمثابة مؤشرات مفيدة للصحة الخلوية العامة. في خلايا العضلات الهيكلية، تكشف دراسات المجهر الإلكتروني عن وجود ميتوكوندريا تحت الساركوليمال (SS) والميتوكوندريا بين العضلات (IMF) المتميزة جغرافيا، والتي تظهر درجة من ^{الاتصال1}^،²^،³^،⁴ والتي من المسلم به الآن أنها ديناميكية للغاية وقابلة للتكيف مع التغيرات في مستويات نشاط العضلات الهيكلية، وكذلك مع التقدم في العمر والمرض. يمكن تقييم محتوى الميتوكوندريا ووظيفتها في العضلات بطرق ^{عديدة5,6} ، وتم تطبيق الطرق التقليدية لعزل العضيات لفهم أفضل للقدرات التنفسية والأنزيمية (Vmax) للميتوكوندريا المتميزة عن تأثير الوسط ^{الخلوي7,8}. على وجه الخصوص ، كشفت هذه الطرق التقليدية عن فروق كيميائية حيوية خفية بين الميتوكوندريا المعزولة من المناطق تحت الساركوليمية وبين الرجفان العضلي ، مما يكذب الآثار الوظيفية المحتملة لعملية التمثيل الغذائي في هذه المناطق تحت ^{الخلوية8}^،⁹^،¹⁰^،¹¹.

التكوين الحيوي للميتوكوندريا فريد من نوعه في طلب مساهمة المنتجات الجينية من كل من الحمض النووي النووي والميتوكوندريا. ومع ذلك ، فإن الغالبية العظمى منها مشتقة من النواة لأن نسخ mtDNA يؤدي فقط إلى تخليق 13 بروتينا. نظرا لأن الميتوكوندريا تتكون عادة من >1000 بروتين مشارك في مسارات استقلابية متنوعة ، فإن التكوين الحيوي للعضية يتطلب وسيلة منظمة بإحكام لاستيراد وتجميع بروتينات السلائف من السيتوسول إلى المقصورات الفرعية المختلفة للميتوكوندريا للحفاظ على قياس الستويشيومتري السليم والوظيفة12,13. عادة ما تحمل البروتينات المشفرة نوويا الموجهة للميتوكوندريا تسلسل استهداف الميتوكوندريا (MTS) الذي يستهدفها إلى العضية ويسهل توطينها دون الجزئي. تحتوي معظم البروتينات المرتبطة بالمصفوفة على MTS طرف N قابل للشق، في حين أن تلك الموجهة إلى غشاء الميتوكوندريا الخارجي أو الداخلي عادة ما يكون لها مجالات استهداف ^{داخلية14}. تتم عملية الاستيراد من خلال مجموعة من القنوات المتنوعة التي توفر طرقا متعددة للدخول إلى ^{العضية13}. ينقل ترانسلوكاس الغشاء الخارجي (TOM) المعقد السلائف من السيتوسول إلى الفضاء بين الغشاء ، حيث يتم التعرف عليها بواسطة ترانسلوكيس مجمع الغشاء الداخلي (TIM). وهذا المجمع مسؤول عن استيراد السلائف المشفرة نوويا إلى المصفوفة، حيث تشق البروتياز التسلسل المسبق للاستهداف الطرفي N. يمكن إدخال البروتينات الموجهة للغشاء الخارجي مباشرة في هذا الغشاء من خلال مجمع TOM ، في حين يتم إدخال البروتينات الموجهة للغشاء الداخلي بواسطة بروتين TIM ، وتحديدا TIM22. بعد استيرادها ، تتم معالجة البروتينات بشكل أكبر بواسطة البروتيازات والمرافقين المقيمين وغالبا ما تتحد لتشكيل مجمعات أكبر ، مثل تلك الموجودة في سلسلة نقل الإلكترونات.

استيراد بروتين الميتوكوندريا نفسه يعمل أيضا كقياس لصحة الميتوكوندريا ، حيث تعتمد هذه العملية على وجود إمكانات الغشاء ومصدر للطاقة في شكل ^ATP15. على سبيل المثال ، عندما يتم تبديد إمكانات الغشاء ، لا يمكن تناول بروتين كيناز PINK1 بواسطة العضية ، وهذا يؤدي إلى إشارات الفسفرة التي تؤدي إلى بداية تدهور العضية من خلال مسار يسمى mitophagy16,17. وفي ظل ظروف مماثلة، عندما يعوق الاستيراد، لا يمكن للبروتين ATF5 أن يدخل العضية، ثم ينتقل بعد ذلك إلى النواة، حيث يعمل كعامل نسخ للتنظيم الأعلى للتعبير الجيني للاستعراض الدوري ^{الشامل18}^،¹⁹. وبالتالي ، يمكن أن يوفر قياس كفاءة استيراد البروتين نظرة شاملة على صحة العضية ، في حين يمكن استخدام استجابة التعبير الجيني للإشارة إلى درجة الإشارات الرجعية إلى النواة.

على الرغم من أهميته الواضحة للتكوين الحيوي للميتوكوندريا وللصحة الخلوية بشكل عام ، إلا أن مسار الاستيراد في الميتوكوندريا الثديية غير مدروس بشكل ملحوظ. في هذا التقرير، نصف الخطوات المحددة التي ينطوي عليها قياس استيراد بروتينات السلائف إلى الميتوكوندريا العضلية الهيكلية ونقدم بيانات لتوضيح الاستجابة التكيفية لنظام الاستيراد للتغيرات في العضلات وعدم استخدامها، مما يوضح مساهمة استيراد البروتين في اللدونة التكيفية للعضلات الهيكلية.

Protocol

يتم الحفاظ على جميع الحيوانات المستخدمة في هذه التجارب في مرفق رعاية الحيوانات في جامعة يورك. يتم إجراء التجارب وفقا لإرشادات المجلس الكندي لرعاية الحيوان بموافقة لجنة رعاية الحيوان بجامعة يورك (التصريح: 2017-08).

1. العزل الوظيفي للميتوكوندريا تحت الساركوليمال وبين الرجفان العضلي من العضلات الهيكلية

إعداد الكاشف:
1. قم بإعداد جميع المخازن المؤقتة والوسائط كما هو مذكور في الجدول 1.
2. اضبط المخازن المؤقتة على درجة الحموضة 7.4 وخزنها عند 4 درجات مئوية (حتى أسبوعين) ، باستثناء بروتياز nagrase.
3. تحضير بروتياز الناغارزي الطازج (الجدول 1) في كل مرة.
إزالة الأنسجة والفرم
ملاحظة: يرد في الشكل 1 مخطط انسيابي للخطوات التالية لعزل الميتوكوندريا.
1. املأ قارورة التلألؤ الزجاجية بحوالي 20 مل من المخزن المؤقت 1 (الجدول 1) وضعها على الثلج.
2. بينما يكون الفأر تحت التخدير ، يحصد عضلات الهيكل العظمي (الظنبوب الأمامي ، العضلة رباعية الرؤوس ، gastrocnemius ، إلخ) ، حوالي 500-1000 ملغ ، ووضع العضلات في قارورة الوميض التي تحتوي على Buffer 1 المبرد.
  ملاحظة: يستخدم الأيزوفلوران الغازي كمخدر بنسبة 2.5٪ بمعدل تدفق 0.4 لتر من _O2 / دقيقة. يتم إجراء اختبار قرصة للتأكد من أن الحيوان غير مستجيب.
3. بعد جمع الأنسجة ، القتل الرحيم للحيوان عن طريق خلع عنق الرحم.
4. قم بتبريد زجاج الساعة مسبقا على الجليد. قم بإزالة أي دهون أو نسيج ضام من العضلات وفرم الأنسجة الموجودة على زجاج الساعة حتى يصبح ملاطا متجانسا.
5. ضع الأنسجة المفرومة في أنبوب طرد مركزي بلاستيكي مبرد مسبقا سعة 50 مل (انظر جدول المواد) وسجل الوزن الدقيق.
6. تمييع الأنسجة المفرومة 10 أضعاف مع المخزن المؤقت 1 + ATP (الجدول 1).
7. قم بتجانس عينة العضلات باستخدام مجانس ثنائي الشفرة مقاس 8 مم (انظر جدول المواد) عند خرج طاقة يبلغ 9.8 هرتز لمدة 10 ثوان ، مما يضمن عدم بقاء أجزاء مرئية من العضلات.
8. جهاز طرد مركزي العينات عند 800 × غرام لمدة 10 دقائق باستخدام جهاز طرد مركزي عالي السرعة (انظر جدول المواد).
  ملاحظة: الغرض من هذه الخطوة هو فصل كسور الميتوكوندريا SS وصندوق النقد الدولي. يحتوي السوبرنيت على الميتوكوندريا SS ، بينما تحتوي الكريات على ميتوكوندريا صندوق النقد الدولي.
عزل الميتوكوندريا SS
1. قم بتصفية السوبرنيت من خلال طبقة واحدة من القماش القطني في مجموعة أخرى من أنابيب الطرد المركزي البلاستيكية سعة 50 مل لإزالة أي حطام أو ملوثات كبيرة.
2. جهاز طرد مركزي فائق السرعة عند 9000 × جم لمدة 10 دقائق عند 4 درجات مئوية باستخدام جهاز طرد مركزي عالي السرعة.
3. تخلص من supernate وأعد تعليق الكرية في 3.5 مل من Buffer 1 + ATP.
  ملاحظة: أعد التعليق باستخدام P1000 وقم بذلك بعناية. الميتوكوندريا هي عضيات هشة. أداء بلطف وتجنب لمس بيليه مع طرف ماصة.
4. جهاز طرد مركزي العينة عند 9000 × جم لمدة 10 دقائق عند 4 درجات مئوية باستخدام جهاز طرد مركزي عالي السرعة.
5. تخلص من السوبرنيت ما لم تكن هناك حاجة إلى مزيد من المعالجة لعزل جزء خلوي خال من النوى والميتوكوندريا والعضيات الأخرى. أعد تعليق الكريات بعناية في حوالي 95 ميكرولتر من وسط إعادة التعليق (الجدول 1) باستخدام ماصة P200.
  ملاحظة: على غرار الخطوة 1.3.3، تجنب لمس الكرية بطرف الماصة. يمكن تغيير حجم وسط إعادة التعليق اعتمادا على حجم الكريات. هذا هو جزء الميتوكوندريا SS ، والذي يمكن تخزينه على الجليد حتى يتم عزل جزء صندوق النقد الدولي. إذا رغبت في ذلك ، يمكن عزل الكسر الخلوي ، الخالي من العضيات ، عن طريق الطرد المركزي للسوزانة عند 100000 × جم في جهاز طرد مركزي فائق (انظر جدول المواد) وبعد ذلك التخلص من الكريات.
عزل الميتوكوندريا التابع لصندوق النقد الدولي
1. تمييع بيليه من الخطوة 1.2.8 بواسطة 10 أضعاف في المخزن المؤقت 1 + ATP. أعد التعليق باستخدام مدقة تفلون عن طريق خلط الكريات والمخزن المؤقت معا بلطف حتى تصبح العينة متسقة.
2. قم بتجانس العينة باستخدام مجانس ثنائي الشفرة مقاس 8 مم (انظر جدول المواد) عند خرج طاقة يبلغ 9.8 هرتز لمدة 10 ثوان.
3. جهاز طرد مركزي العينة عند 800 × جم لمدة 10 دقائق عند 4 درجات مئوية باستخدام جهاز طرد مركزي عالي السرعة.
4. تخلص من السوبرنيت وخفف حبيبات الميتوكوندريا التابعة لصندوق النقد الدولي 10 أضعاف باستخدام Buffer 2 وأعيد تعليقها باستخدام مدقة التفلون عن طريق الخلط بلطف حتى تصبح متجانسة.
5. أضف 25 ميكرولتر / غرام من الأنسجة إلى 10 ملغ / مل من بروتياز ناغارز (الجدول 1) وضع أنبوب الطرد المركزي على جانبه على الجليد ، واخلطه بلطف كل دقيقة عن طريق هز الأنبوب من جانب إلى آخر.
  ملاحظة: تساعد إضافة الناغارز على تحرير الميتوكوندريا التابعة لصندوق النقد الدولي عن طريق إجراء عملية هضم محدودة للعضلات.
6. بعد 5 دقائق ، أضف 20 مل من Buffer 2 (الجدول 1) لتخفيف بروتياز الناغارز إلى درجة الخمول وإيقاف الهضم.
7. قم على الفور بطرد العينة مركزيا عند 5000 × جم لمدة 5 دقائق عند 4 درجات مئوية باستخدام جهاز طرد مركزي عالي السرعة.
8. تخلص من الزائدة وقم بتخفيف الكرية 10 أضعاف باستخدام Buffer 2 وأعد تعليقها باستخدام مدقة تفلون عن طريق الخلط بلطف.
9. جهاز طرد مركزي العينة عند 800 × غرام لمدة 15 دقيقة عند 4 درجات مئوية لتكوير المادة الليفية.
10. صب supernate في مجموعة جديدة من أنابيب الطرد المركزي البلاستيكية سعة 50 مل ، مع الحرص على عدم تعطيل الكريات ، والتي يمكن التخلص منها.
11. جهاز طرد مركزي العينة عند 9000 × جم لمدة 10 دقائق عند 4 درجات مئوية كما في الخطوة 1.4.7.
12. تخلص من السوبرنيت ، وأضف 3.5 مل من Buffer 2 وأعد تعليق الكريات بلطف باستخدام ماصة P1000.
13. جهاز طرد مركزي العينة عند 9000 × جم لمدة 10 دقائق عند 4 درجات مئوية كما في الخطوة 1.4.7.
14. تخلص من الزائدة وأعد تعليق الكريات بلطف مع ما يقرب من 180 ميكرولتر من وسط إعادة التعليق باستخدام ماصة P200.
  ملاحظة: يمكن تغيير حجم وسط إعادة التعليق اعتمادا على حجم الكريات. هذا هو جزء الميتوكوندريا التابع لصندوق النقد الدولي ، والذي يمكن تخزينه على الجليد حتى يتم استخدامه في فحص الاستيراد.

2. استيراد بروتين الميتوكوندريا

In vitro نسخ
ملاحظة: توضح هذه الخطوات اللاحقة كيفية تحضير بروتين مشع للاستيراد. قد يملي مسار الاستيراد قيد التحقيق اختيار البروتين المستهدف ، على سبيل المثال ، لتقييم الاستيراد إلى مصفوفة الميتوكوندريا ، أورنيثين كارباميل ترانسفيراز ، OCT ، ونازعة هيدروجيناز مالات ، MDH ، شائعة الاستخدام ، في حين يستخدم Tom40 بشكل شائع كمؤشر على الاستيراد إلى غشاء الميتوكوندريا الخارجي. بالنسبة للخطوات التالية ، يلزم ترميز الحمض النووي البلازميد للبروتين الذي تختاره. يمكن إجراء نسخ الحمض النووي البلازميد قبل عزل الميتوكوندريا في يوم منفصل ، ويمكن تخزين الحمض النووي الريبي المرسال الذي تم جمعه من هذه التجربة واستخدامه في تجارب الترجمة والاستيراد المستقبلية.
1. خطي الحمض النووي: الجمع بين 40 ميكرولتر من الحمض النووي البلازميد (5 ميكروغرام / ميكرولتر) ، 5 ميكرولتر من 10x المخزن المؤقت للإنزيم و 5 ميكرولتر من إنزيم التقييد والاحتضان عند 37 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة.
  ملاحظة: قد تختلف إنزيمات التقييد المستخدمة بناء على البلازميد ، والذي قد يتطلب مخزنا مؤقتا مختلفا للإنزيم ، ويمكن استخدام الحمض النووي للظروف التجريبية في أي كمية / حجم ، حيث يمكن توسيع القالب لأعلى أو لأسفل.
2. تنقية وتعجيل الحمض النووي الخطي باستخدام الفينول والإيثانول. نفذ جميع الخطوات اللاحقة (2.1.3-2.1.15) في أنابيب معقمة سعة 1.5 مل ، واستخدم جهاز طرد مركزي على الطاولة (انظر جدول المواد) لخطوات الطرد المركزي.
3. أضف الحجم المناسب من _H2O المعقم بحيث يساوي الحجم النهائي 400 ميكرولتر. ثم أضف 400 ميكرولتر من الفينول.
4. اخلط بقوة عن طريق الانعكاس لمدة 10 ثوان تقريبا ، وأجهزة الطرد المركزي عند 17000 × جم لمدة 1 دقيقة عند 4 درجات مئوية. سحب وحفظ المرحلة العليا.
5. أضف 400 ميكرولتر من الفينول: الكلوروفورم: isoamylalcohol (25: 24: 1 ، v: v: v).
6. اخلط بقوة عن طريق الانعكاس لمدة 10 ثوان تقريبا ، وأجهزة الطرد المركزي عند 17000 جم لمدة دقيقة واحدة عند 4 درجات مئوية. سحب وحفظ المرحلة العليا.
7. أضف 400 ميكرولتر من الكلوروفورم: إيزوميلالكوهول (24: 1 ، v: v).
8. اخلط بقوة عن طريق الانعكاس لمدة 10 ثوان تقريبا ، وأجهزة الطرد المركزي عند 17000 جم لمدة دقيقة واحدة عند 4 درجات مئوية. سحب وحفظ المرحلة العليا.
9. أضف 40 ميكرولتر من خلات الصوديوم 3M (الرقم الهيدروجيني 7.0) ، وأضف 1 مل من 95٪ من الإيثانول.
10. ضع أنابيب معقمة سعة 1.5 مل في فريزر -80 درجة مئوية على جانبها لمدة 15 دقيقة.
11. جهاز طرد مركزي العينات عند 17000 × جم لمدة 10 دقائق عند 4 درجات مئوية.
12. تخلص من السوبرنيت واغسل الكريات ب 300 ميكرولتر من 80٪ من الإيثانول.
13. أجهزة الطرد المركزي العينات عند 17000 × جم لمدة 2 دقيقة عند 4 درجات مئوية.
14. تخلص من الكريات وجففها بالهواء. بمجرد أن تجف الكريات ، يجب أن تكون واضحة.
15. أعد تعليق الكريات في 20 ميكرولتر من _H2O المعقمة
16. قم بقياس تركيز الحمض النووي باستخدام مقياس الطيف الضوئي (انظر جدول المواد) وتأكد من أن نسبة _{A260: 280} أعلى من 1.8.
17. تمييع الحمض النووي إلى تركيز 0.8 ميكروغرام / ميكرولتر في _H2O المعقمة.
18. نسخ الحمض النووي: الجمع بين البلازميد (0.8 ميكروغرام / ميكرولتر ، 60.8 ميكرولتر) ، _H2O المعقم (8.4 ميكرولتر) ، 10 ملليمتر NTP (5.2 ميكرولتر) ، 10 ملليمتر ATP ( 10.0 ميكرولتر) ، 1 ملليمتر M-7-G (11.6 ميكرولتر) ، المزيج كما ذكر الخطوة 2.1.19 (15.6 ميكرولتر) ، الحمض النووي الريبي (5.2 ميكرولتر) وبوليميراز الحمض النووي الريبي المناسب (4.8 ميكرولتر) لتشكيل "مزيج تفاعل واحد" (الحجم الإجمالي = 121.6 ميكرولتر) واحتضان لمدة 90 دقيقة عند درجة الحرارة المثلى للبوليميراز (37 درجة مئوية لبوليميراز T7 ؛ 40 درجة مئوية لبوليميراز SP6)
19. لتحضير المزيج ، أضف 200 ميكرولتر من 1M HEPES (الرقم الهيدروجيني 7.9) ، و 100 ميكرولتر من 1 M _MgAc2 ، و 500 ميكرولتر من 4 M KAc ، و 100 ميكرولتر من 20 mM spermidine ، و 100 ميكرولتر من 0.5 M DTT ، و 200 ميكرولتر من _H20 المعقم.
  ملاحظة: يمكن زيادة حجم التفاعل أو خفضه طالما تم الحفاظ على النسب المتوفرة من الكواشف. يتم إملاء بوليميراز الحمض النووي الريبي المستخدم بواسطة تسلسل المروج البكتيري داخل البلازميد المستخدم.
20. ثم ، قم بتنقية وتعجيل الحمض النووي الريبي المرسال باستخدام الفينول والإيثانول كما في الخطوات 2.1.2-2.1.15. اجعل الحجم يصل إلى 400 ميكرولتر باستخدام _H2O المعقم (أضف 280 ميكرولتر) واستمر كما هو موضح في الخطوات 2.1.2-2.1.15. أعد تعليق الكريات النهائية في 20 ميكرولتر من _H2O المعقمة.
21. قم بقياس تركيز الحمض النووي الريبوزي المرسال باستخدام مقياس الطيف الضوئي ، وتأكد من أن نسبة _{A260: 280} هي ~ 2.0.
22. تمييع الحمض النووي الريبي المرسال إلى 2.8 ميكروغرام / ميكرولتر في _H2O المعقمة ، وتخزينها في -20 درجة مئوية في 50 ميكرولتر aliquots.
الترجمة في المختبر
ملاحظة: يجب إجراء ترجمة الحمض النووي المطلوب في نفس يوم تجربة الاستيراد. تتطلب هذه التجربة استخدام الأحماض الأمينية ذات العلامات الإشعاعية ، وبالتالي يجب أن يكون لدى المستخدم تصريح لاستخدام النظائر المشعة ، ويجب أن تكون جميع المناولة والتخلص وفقا لسياسات / متطلبات المؤسسة. وقد حذفت الخطوات التي تنطوي على تدابير أمان النظائر المشعة أو وصفت بإيجاز، لأن هذه الخطوات من المرجح أن تختلف بناء على المؤسسة.
1. قم بإعداد ما يكفي من مزيج تفاعل الترجمة (الجدول 2) لتوفير ~ 20 ميكرولتر لكل عينة من الميتوكوندريا لاستخدامها في تجربة الاستيراد وتضمين نفس الحجم لمسار الترجمة.
2. احتضان التفاعل لمدة 30 دقيقة عند 30 درجة مئوية (قد يختلف الوقت مع mRNA ، 25-60 دقيقة).
3. تسجيل استخدام 35S-methionine وفقا لمتطلبات السلامة الإشعاعية للمؤسسة والتخلص من أي شيء يتلامس مع النظائر المشعة وفقا للمبادئ التوجيهية للمؤسسة.
استيراد البروتين
ملاحظة: الميتوكوندريا المعزولة حديثا مطلوبة للخطوات التالية. ارجع إلى بروتوكول عزل الميتوكوندريا. يمكن استخدام طرق العزل الأخرى طالما أن الميتوكوندريا قابلة للحياة وعملية. بالنسبة للخطوات اللاحقة ، يتم إعادة تعليق عينات الميتوكوندريا المستخدمة في مخزن مؤقت لإعادة التعليق كما هو موضح أعلاه (جدول رقم (1)). يجب أيضا قياس تركيز البروتين في عينة الميتوكوندريا قبل البدء في فحص الاستيراد.
1. بعد حوالي 15 دقيقة من بدء تفاعل الترجمة، يتم تحويل 90 ميكروغرام من الميتوكوندريا إلى أنابيب معقمة سعة 1.5 مل ويتم احتضانها مسبقا عند 30 درجة مئوية لمدة 10 دقائق تقريبا.
  ملاحظة: Aliquot أكثر الميتوكوندريا مما سيتم استخدامه بالفعل في التجربة. سيتم استخدام 75 ميكروغرام فقط بالفعل. ومع ذلك ، فإن الاقتباس الزائد ليس شرطا.
2. في مجموعة جديدة من الأنابيب المعقمة سعة 1.5 مل ، امزج 75 ميكروغرام من الميتوكوندريا مع 18 ميكرولتر من تفاعل الترجمة واحتضنها عند 30 درجة مئوية للوقت المطلوب.
3. احتفظ بالحجم المتبقي من تفاعل الترجمة على الجليد ؛ سيتم استخدام هذا لاحقا.
  ملاحظة: الاستيراد عملية تعتمد على الوقت، لذلك قد يكون من الحكمة البدء بتجربة دورة زمنية تتراوح في أوقات الحضانة من 1-60 دقيقة. وقت رد الفعل النموذجي هو 30 دقيقة.
4. خلال هذا الوقت ، قم بإعداد وسادة السكروز عن طريق الجمع بين 1 غرام من السكروز ، 200 ميكرولتر من 2.5 M KCl ، 10 ميكرولتر 1 M _MgCl2 ، 100 ميكرولتر من 1 M HEPES (الرقم الهيدروجيني 7.4) ، وجلب الحجم إلى 5 مل باستخدام _H2O المعقمة.
5. قم بإعداد مجموعة جديدة من الأنابيب المعقمة سعة 1.5 مل المقابلة لكل أنبوب في تفاعل الاستيراد. Aliquot 600 ميكرولتر من وسادة السكروز في كل أنبوب والحفاظ على الجليد حتى ينتهي تفاعل الاستيراد.
6. لإنهاء تفاعل الاستيراد بعد وقت الحضانة المناسب ، قم بإزالة الأنبوب من 30 درجة مئوية ، وضعه على الثلج ثم انقل تفاعل الاستيراد بعناية أعلى الأنبوب باستخدام وسادة السكروز.
  ملاحظة: يجب القيام بهذه الخطوة ببطء شديد لضمان عدم تلف / تمزق الميتوكوندريا. تساعد وسادة السكروز على إبطاء هجرة الميتوكوندريا و "الوسائد" نزولها إلى أسفل الأنبوب خلال خطوة الطرد المركزي اللاحقة.
7. جهاز طرد مركزي للعينات + وسادة سكروز عند 17000 × جم لمدة 15 دقيقة عند 4 درجات مئوية.
8. قم بإعداد المخزن المؤقت للكسر عن طريق الجمع بين 25 مل من السوربيتول 2.4 م ، و 2 مل من 1 م HEPES (الرقم الهيدروجيني 7.4) ، و 72 مل من _H2O المقطر المزدوج.
9. تحضير المخزن المؤقت للتحلل للرحلان الكهربائي الهلامي SDS-PAGE: اجمع بين 50 مل من الجلسرين الساخن و 11.5 جم من SDS و 31.25 مل من 1 م تريس (الرقم الهيدروجيني 6.8) واجعل الحجم يصل إلى 500 مل مع _H2O المقطر المزدوج.
10. لإعداد العينة، امزج 475 ميكرولتر من المخزن المؤقت للتحلل مع 25 ميكرولتر من β-ميركابتوإيثانول لاستخدامها في خطوة لاحقة.
  ملاحظة: يمكن إجراء المخزن المؤقت للتحلل مقدما وتخزينه في درجة حرارة الغرفة ؛ ومع ذلك ، فإن إضافة β-mercaptoethanol يجب أن تتم طازجة.
11. باستخدام ماصة P1000 ، قم بإزالة supernate بعناية ولا تزعج الكريات. تخلص من الزائدة في حاوية نفايات مشعة مناسبة.
12. للاستيراد إلى الغشاء الخارجي ، قم بإجراء ذلك باستخدام Tom40 ، وأعد تعليق الكريات في 50 ميكرولتر من كربونات الصوديوم الطازجة 0.1 M (الرقم الهيدروجيني 11.5) واحتضانها على الجليد لمدة 30 دقيقة.
13. بعد الحضانة ، قم بطرد العينة 14000 × جم لمدة 5 دقائق عند 4 درجات مئوية. تتم هذه الخطوة فقط لتفاعلات استيراد الغشاء الخارجي.
14. لإعداد العينات للرحلان الكهربائي SDS-PAGE ، أضف 20 ميكرولتر من المخزن المؤقت للكسر ، و 20 ميكرولتر من المخزن المؤقت للتحلل ، β-mercaptoethanol وأعيد تعليقه جيدا. أضف 5 ميكرولتر من عينة الصبغة.
15. قم بإعداد ممر التحكم/الترجمة عن طريق الجمع بين 3 ميكرولتر من تفاعل الترجمة المتبقي من الخطوة 2.3.3 مع 37 ميكرولتر من المخزن المؤقت للتحلل و5 ميكرولتر من صبغة العينة. تخلط جيدا.
16. تغلي العينات لمدة 5 دقائق عند 95 درجة مئوية وتدور بلطف بسرعة منخفضة لتجنب تكوير الميتوكوندريا.
17. ضع العينات على هلام بولي أكريلاميد SDS.
  ملاحظة: تعتمد نسبة الجل ووقت التشغيل اللاحق على البروتين الذي يتم استيراده. على سبيل المثال ، OCT هو 37 kDa ، ونطاقه المعالج الناضج أصغر قليلا ؛ لذلك ، يسمح هلام 12 ٪ بفصل جيد لهذه النطاقات.
18. بمجرد اكتمال الرحلان الكهربائي ، قم بإزالة الجل وضعه في _H2O المقطر المزدوج.
19. اغلي الجل في 5٪ TCA في غطاء الدخان لمدة 5 دقائق ، مع التحريك / تحريك الجل باستمرار لتجنب التشقق.
  ملاحظة: يساعد TCA على تصلب الجل للتصور. يمكن القيام بذلك في صينية معدنية فوق موقد بنسن. استخدم ما يكفي من TCA لتغطية الجل بسخاء ، ~ 1/2 ممتلئ.
20. قم بإزالة الجل وضعه مرة أخرى في _H2O المقطر المزدوج. حركه على لوحة دوارة لمدة 1 دقيقة عند ~ 50 دورة في الدقيقة.
21. اغسل الجل في 10 mM Tris على لوحة دوارة لمدة 5 دقائق عند ~ 50 دورة في الدقيقة ، مرة أخرى باستخدام ما يكفي لتغطية الجل بسخاء ، ~ 1/2 من الحاوية.
22. قم بترسب البروتين عن طريق غسل الجل في 1 M حمض الساليسيليك على لوحة دوارة لمدة 30 دقيقة ، مرة أخرى باستخدام ما يكفي من حمض الساليسيليك لتغطية الجل بسخاء ، ~ 1/2 من الحاوية المستخدمة.
23. تجفيف الجل كما هو موضح في الخطوات 2.3.24-2.3.31.
  ملاحظة: يمكن القيام بذلك بعدة طرق. يوفر مجفف الجل (انظر جدول المواد) خيارا فعالا من حيث الوقت (الموضح أدناه) ؛ ومع ذلك ، يمكن استخدام طرق / مجموعات أخرى متاحة تجاريا قد تكون أكثر فعالية من حيث التكلفة ولكنها أكثر استهلاكا للوقت. يمكن استخدام مجموعات تجفيف الجل كبديل لا يتطلب تطبيق الحرارة أو الشفط ولكن بدلا من ذلك يسمح للجل بالتجفيف بالهواء بين صفائح السيلوفان لمنع التشويه.
24. ضع ورقة كبيرة من ورق النشاف على السرير المسامي لمجفف الجل. ضع ورقة واحدة من منشفة ورقية في المنطقة التي سيتم فيها تطبيق الجل.
25. قطع قطعة 15 سم × 20 سم من ورق النشاف ووضعها على منشفة ورقية.
26. أخرج الجل من الحاوية باستخدام قطعة ثانية من ورق النشاف 15 سم × 20 سم وضعه بشكل مسطح فوق القطعة الأولى.
27. قطع قطعة أكبر قليلا من الغلاف البلاستيكي ، ~ 20 سم × 25 سم ، ووضعها على الجل ، وضمان عدم وجود تجاعيد أو فقاعات تحت الغلاف.
  ملاحظة: قد يستغرق ذلك بضع محاولات، ولكن من الضروري عدم وجود جيوب هوائية محاصرة.
28. ضع الغطاء البلاستيكي لمجفف الجل برفق فوق الغلاف ، مع التأكد مرة أخرى من عدم وجود فقاعات أو تجاعيد.
29. قم بتشغيل المضخة / الفراغ وتأكد من أن الغطاء البلاستيكي قد شكل ختما. اختبر الختم عن طريق رفع زاوية من الغطاء البلاستيكي وانتظر حتى يتم إعادة إغلاقه.
30. أغلق مجفف الجل واركض لمدة 90 دقيقة. اضبط درجة الحرارة لتبدأ عند 30 درجة مئوية ، وتصل تدريجيا إلى 80 درجة مئوية ، ثم تعود إلى 30 درجة مئوية في نهاية الجري.
31. بمجرد الجفاف ، سوف يتصلب الجل ويشعر بنحافة الورق. لف الجل في الغلاف البلاستيكي المستخدم في عملية التجفيف.
32. ضع الجل المجفف في كاسيت فيلم مع فيلم فوسفور (انظر جدول المواد) ، مع الجانب الأبيض الذي يواجه الجل. تختلف أوقات التعرض ولكن يمكن أن تكون 24-48 ساعة لتصور النطاقات.
33. تصور باستخدام التصوير الشعاعي الذاتي باستخدام أي مصور مناسب قادر على التصوير الفوسفوري.

النتائج

لقد أوضحنا على نطاق واسع أن هذا البروتوكول هو فحص صالح لتحديد معدل الاستيراد إلى الميتوكوندريا العضلية المعزولة الوظيفية والسليمة. وبالمقارنة مع الظروف غير المعالجة، فإن استيراد بروتينات السلائف النموذجية مثل نازعة هيدروجيناز مالات (MDH) إلى المصفوفة أمر حساس لإمكانات الغشاء لأنه يمكن ت?...

Discussion

تعتمد الميتوكوندريا بشكل فريد على التعبير والتنسيق بين كل من الجينوم النووي والميتوكوندريا لتخليقها وتوسعها داخل الخلايا. ومع ذلك ، فإن الجينوم النووي يشفر الغالبية العظمى (99 ٪) من بروتيوم الميتوكوندريا ، وهذا يؤكد أهمية آلية استيراد البروتين في دعم التكوين الحيوي للميتوكوندريا. يعمل ال...

Disclosures

ولم يعلن صاحبا البلاغ عن أي تضارب في المصالح، سواء كان ماليا أو غير مالي.

Acknowledgements

يود المؤلفون أن يشكروا الدكتور ج.C. شور من جامعة ماكجيل ، والدكتور أ. شتراوس من كلية واشنطن للطب ، والدكتور .M. ت. ريان من جامعة لا تروب على التبرعات الأصلية من بلازميدات التعبير التي استخدمت في هذا البحث. تم دعم هذا العمل بتمويل من مجلس أبحاث العلوم الطبيعية والهندسة في كندا (NSERC) إلى D. A. Hood. D. A. Hood هو أيضا حامل كرسي أبحاث كندا في فسيولوجيا الخلية.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.2% BSA	Sigma	A2153
35S-methionine	Perkin Elmer	NEG709A500UC	Purchase requires a valid radioisotope permit
ATP	Sigma	A7699
Blotting paper; Whatman 3MM CHR Paper	Thermo Fisher	05-714-5
Cassette for film	Kodak	Kodak Xomatic
Centrifugation Tube	Thermo Fisher	3138-0050
Chloroform	Thermo Fisher	C298-4
DTT	Sigma	D9779-5G
EDTA	BioShop	EDT002
EGTA	Sigma	E4378
Gel Dryer	BioRad	Model 583
Gel Drying Kit	Sigma or BioRad	Z377570-1PAK or OW-GDF-10	Various options are commercially available through many companies, these are just as few examples.
Glycerol	Caledon Laboratory Chemicals	5350-1-40
HEPES	Sigma	H3375
High Speed Centrifuge	Beckman Coulter	Avanti J-25 Centrifuge
Homogenizer	IKA	T25 Digital Ultra Turrex
Isoamylalcohol, or 3-methylbutanol	Sigma	I9392
KAc	BioShop	POA301.500
KCl	Sigma	P3911
M7G	New England Biolab	S1404S	Dilute with 1000ul 20mM HEPES to make 1mM stock
MgCl	BioShop	MAG510
MgSO₄	Thermo Fisher	M65-500
MOPS	BioShop	MOP001
NaCl	BioShop	SOD001
NTP	Thermo Fisher	R0191
OCT Plasmid	-	-	Donated from Dr. G. C. Shore, McGill University, Montreal, Canada; alternative available through Addgene, plasmid #71877
pGEM4Z/hTom40 Plasmid	-	-	Donated from Dr. M. T. Ryan, La Trobe University, Melbourne, Australia
pGMDH Plasmid	-	-	Donated from Dr. A. Strauss, Washington University School of Medicine
Phenol	Sigma	P4557
Phenol:Chloroform:Isoamyalcohol	Sigma	P3803	Can also be made with the ratio provided
Phosphorus Film	Fujifilm	BAS-IP MS 2025
Rabbit reticulocyte lysate	Promega	L4960	Avoid freeze-thaw; aliquot lysate upon arrival; amino acids are provided in the kit as well
RNAsin	Promega	N2311
Rotor for High Speed Centrifuge	Beckman Coulter	JA-25.50
SDS	BioShop	SDS001.500	Caution: harmful if ingested or inhaled, wear a mask.
Sodium acetate	Bioshop	SAA 304
Sodium Carbonate	VWR	BDH9284
Sodium salicylate	Millipore Sigma	106601
Sorbitol	Sigma	S6021
SP6 RNA Polymerase	Promega	P1085
Spectrophotometer	Thermo Fisher	Nanodrop 2000
Spermidine	Sigma	S-2626
Sucrose	BioShop	SUC507
T7 RNA Polymerase	Promega	P2075
Tabletop Centrifuge	Thermo Fisher	AccuSpin Micro 17
Trichloroacetic acid	Thermo Fisher	A322-500
Tris	BioShop	TRS001
β-mercaptoethanol	Sigma	M6250-100ML

References

Kirkwood, S. P., Munn, E. A., Brooks, G. A. Mitochondrial reticulum in limb skeletal muscle. The American Journal of Physiology. 251 (3), 395-402 (1986).
Glancy, B., et al. Power grid protection of the muscle mitochondrial reticulum. Cell Reports. 19 (3), 487-496 (2017).
Vincent, A. E., et al. Quantitative 3D mapping of the human skeletal muscle mitochondrial network. Cell Reports. 26 (4), 996-1009 (2019).
Ogata, T., Yamasaki, Y. Ultra-high-resolution scanning electron microscopy of mitochondria and sarcoplasmic reticulum arrangement in human red, white, and intermediate muscle fibers. Anatomical Record. 248 (2), 214-223 (1997).
Hood, D. A., Tryon, L. D., Carter, H. N., Kim, Y., Chen, C. C. W. Unravelling the mechanisms regulating muscle mitochondrial biogenesis. Biochemical Journal. 473, 2295-2314 (2016).
Perry, C. G. R., Kane, D. A., Lanza, I. R., Neufer, P. D. Methods for assessing mitochondrial function in diabetes. Diabetes. 62, 1032-1036 (2013).
Holloszy, J. O. Biochemical adaptations in muscle. The Journal of Biological Chemistry. 242 (9), 2278-2282 (1967).
Cogswell, A. M., Stevens, R. J., Hood, D. A. Properties of skeletal muscle mitochondria from subsarcolemmal and intermyofibrillar isolated regions. The American Journal of Physiology. 264, 383-389 (1993).
Koves, T. R., Noland, R. C., Bates, A. L., Henes, S. T., Muoio, D. M., Cortright, R. N. Subsarcolemmal and intermyofibrillar mitochondria play distinct roles in regulating skeletal muscle fatty acid metabolism. American Journal of Physiology - Cell Physiology. 288, 1074-1082 (2005).
Bizeau, M. E., Willis, W. T., Hazel, J. R. Differential responses to endurance training in subsarcolemmal and intermyofibrillar mitochondria. Journal of Applied Physiology. 85 (4), 1279-1284 (1998).
Krieger, D. A., Tate, C. A., McMillin-Wood, J., Booth, F. W. Populations of rat skeletal muscle mitochondria after exercise and immobilization. Journal of Applied Physiology: Respiratory, Environmental and Exercise Physiology. 48 (1), 23-28 (1980).
Calvo, S. E., Clauser, K. R., Mootha, V. K. MitoCarta2.0: An updated inventory of mammalian mitochondrial proteins. Nucleic Acids Research. 44 (1), 1251-1257 (2016).
Wiedemann, N., Pfanner, N. Mitochondrial machineries for protein import and assembly. Annual Review of Biochemistry. 86 (1), 685-714 (2017).
Backes, S., Herrmann, J. M. Protein translocation into the intermembrane space and matrix of mitochondria: mechanisms and driving forces. Frontiers in Molecular Biosciences. 4, 83 (2017).
Harbauer, A. B., Zahedi, R. P., Sickmann, A., Pfanner, N., Meisinger, C. The protein import machinery of mitochondria - A regulatory hub in metabolism, stress, and disease. Cell Metabolism. 19 (3), 357-372 (2014).
Jin, S. M., Lazarou, M., Wang, C., Kane, L. A., Narendra, D. P., Youle, R. J. Mitochondrial membrane potential regulates PINK1 import and proteolytic destabilization by PARL. The Journal of Cell Biology. 191 (5), 933-942 (2010).
Matsuda, N., et al. PINK1 stabilized by mitochondrial depolarization recruits Parkin to damaged mitochondria and activates latent Parkin for mitophagy. The Journal of Cell Biology. 189 (2), 211-221 (2010).
Fiorese, C. J., Schulz, A. M., Lin, Y. -. F., Rosin, N., Pellegrino, M. W., Haynes, C. M. The transcription factor ATF5 mediates a mammalian mitochondrial UPR. Current biology. 26 (15), 2037-2043 (2016).
Quiros, P. M., et al. Multi-omics analysis identifies ATF4 as a key regulator of the mitochondrial stress response in mammals. The Journal of Cell Biology. 216 (7), 2027-2045 (2017).
Takahashi, M., Hood, D. A. Protein import into subsarcolemmal and intermyofibrillar skeletal muscle mitochondria. Differential import regulation in distinct subcellular regions. The Journal of Biological Chemistry. 271 (44), 27285-27291 (1996).
Hood, D. A., Memme, J. M., Oliveira, A. N., Triolo, M. Maintenance of skeletal muscle mitochondria in health, exercise, and aging. Annual Review of Physiology. 81, (2019).
Joseph, A., Hood, D. A. Mitochondrion plasticity of TOM complex assembly in skeletal muscle mitochondria in response to chronic contractile activity. Mitochondrion. 12 (2), 305-312 (2012).
Singh, K., Hood, D. A. Effect of denervation-induced muscle disuse on mitochondrial protein import. American Journal of Physiology-Cell Physiology. 300 (1), 138-145 (2011).
Zhang, Y., et al. Altered mitochondrial morphology and defective protein import reveal novel roles for Bax and/or Bak in skeletal muscle. American Journal of Physiology. Cell Physiology. 305 (5), 502-511 (2013).
Lai, N., Kummitha, C., Rosca, M., Fujioka, H., Tandler, B., Hoppel, C. Isolation of mitochondrial subpopulations from skeletal muscle: optimizing recovery and preserving integrity. Acta Physiologica. 25 (2), 13182 (2019).
Nargund, A. M., Pellegrino, M. W., Fiorese, C. J., Baker, B. M., Haynes, C. M. Mitochondrial import efficiency of ATFS-1 regulates mitochondrial UPR activation. Science. 337 (6094), 587-590 (2012).
Picard, M., Taivassalo, T., Gouspillou, G., Hepple, R. T. Mitochondria: Isolation, structure and function. Journal of Physiology. 589 (18), 4413-4421 (2011).
Kras, K. A., Willis, W. T., Barker, N., Czyzyk, T., Langlais, P. R., Katsanos, C. S. Subsarcolemmal mitochondria isolated with the proteolytic enzyme nagarse exhibit greater protein specific activities and functional coupling. Biochemistry and Biophysics Reports. 6, 101-107 (2016).
Sánchez-Duarte, E., et al. Nicorandil affects mitochondrial respiratory chain function by increasing complex III activity and ROS production in skeletal muscle mitochondria. Journal of Membrane Biology. 253 (4), 309-318 (2020).
Iñigo, M. R., et al. Estrogen receptor-α in female skeletal muscle is not required for regulation of muscle insulin sensitivity and mitochondrial regulation. Molecular Metabolism. 34 (2020), 1-15 (2020).
Newsom, S. A., Stierwalt, H. D., Ehrlicher, S. E., Robinson, M. M. Substrate-specific respiration of isolated skeletal muscle mitochondria after 1 h of moderate cycling in sedentary adults. Medicine and Science in Sports and Exercise. 53 (7), 1375-1384 (2021).
Takahashi, M., Chesley, A., Freyssenet, D., Hood, D. A. Contractile activity-induced adaptations in the mitochondrial protein import system. The American Journal of Physiology. 274 (5), 1380-1387 (1998).
Kravic, B., et al. In mammalian skeletal muscle, phosphorylation of TOMM22 by protein kinase CSNK2/CK2 controls mitophagy. Autophagy. 8627, 01-65 (2017).
Opalińska, M., Meisinger, C. Metabolic control via the mitochondrial protein import machinery. Current Opinion in Cell Biology. 33, 42-48 (2015).
Gerbeth, C., et al. Glucose-induced regulation of protein import receptor tom22 by cytosolic and mitochondria-bound kinases. Cell Metabolism. 18 (4), 578-587 (2013).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

179

This article has been published

Video Coming Soon

Keep me updated: