Войдите в систему

Для просмотра этого контента требуется подписка на Jove Войдите в систему или начните бесплатную пробную версию.

В этой статье

  • Резюме
  • Аннотация
  • Введение
  • протокол
  • Результаты
  • Обсуждение
  • Раскрытие информации
  • Благодарности
  • Материалы
  • Ссылки
  • Перепечатки и разрешения

Резюме

Митохондрии являются ключевыми метаболическими органеллами, которые демонстрируют высокий уровень фенотипической пластичности в скелетных мышцах. Импорт белков из цитозоля является критическим путем для биогенеза органелл, необходимым для расширения ретикулума и поддержания функции митохондрий. Поэтому импорт белка служит барометром клеточного здоровья.

Аннотация

Митохондрии являются ключевыми метаболическими и регуляторными органеллами, которые определяют энергоснабжение, а также общее состояние здоровья клетки. В скелетных мышцах митохондрии существуют в серии сложных морфологий, начиная от небольших овальных органелл до широкой, похожей на ретикулум сети. Понимание того, как митохондриальный ретикулум расширяется и развивается в ответ на различные стимулы, такие как изменения в спросе на энергию, уже давно является темой исследований. Ключевым аспектом этого роста, или биогенеза, является импорт белков-предшественников, первоначально кодируемых ядерным геномом, синтезированных в цитозоле и транслоцированных в различные митохондриальные субкомпоненты. Митохондрии разработали сложный механизм для этого процесса импорта, включающий множество селективных внутренних и внешних мембранных каналов, известных как механизм импорта белка (PIM). Импорт в митохондрии зависит от жизнеспособного мембранного потенциала и наличия АТФ, полученного из органелл, путем окислительного фосфорилирования. Поэтому его измерение может служить мерой здоровья органелл. PIM также демонстрирует высокий уровень адаптивной пластичности в скелетных мышцах, которая тесно связана с энергетическим статусом клетки. Например, было показано, что физические упражнения увеличивают импортную способность, в то время как мышечное неиспользование уменьшает ее, совпадая с изменениями маркеров содержания митохондрий. Хотя импорт белка является критическим шагом в биогенезе и расширении митохондрий, этот процесс не широко изучен в скелетных мышцах. Таким образом, в этой статье описывается, как использовать изолированные и полностью функциональные митохондрии из скелетных мышц для измерения способности импортировать белок, чтобы способствовать лучшему пониманию используемых методов и оценке важности пути для оборота органелл в физических упражнениях, здоровье и болезнях.

Введение

Митохондрии — это органеллы, которые существуют в сложных морфологиях в различных типах клеток и, как признано, обладают растущим набором функций, которые имеют решающее значение для здоровья клеток. Как таковые, они больше не могут быть сведены только к органеллам, производящим энергию. Митохондрии являются ключевыми метаболическими регуляторами, детерминантами судьбы клеток и сигнальными центрами, функции которых могут служить полезными индикаторами общего клеточного здоровья. В клетках скелетных мышц исследования электронной микроскопии показывают наличие географически различных субсарколеммальных (SS) и межмиофибриллярных (IMF) митохондрий, которые демонстрируют степень связности1,2,3,4, которая в настоящее время признана очень динамичной и адаптируемой к изменениям в уровнях активности скелетных мышц, а также с возрастом и болезнями. Содержание и функция митохондрий в мышцах могут быть оценены различными способами5,6, и традиционные методы выделения органелл были применены для лучшего понимания дыхательных и ферментативных возможностей (Vmax) митохондрий, отличных от влияния клеточной среды7,8. В частности, эти традиционные методы выявили тонкие биохимические различия между митохондриями, выделенными из субсарколеммальных и межмиофибриллярных областей, опровергая возможные функциональные последствия для метаболизма в этих субклеточных областях8,9,10,11.

Биогенез митохондрий уникален тем, что требует вклада генных продуктов как из ядерной, так и из митохондриальной ДНК. Однако подавляющее большинство из них получено из ядра, поскольку транскрипция мтДНК приводит только к синтезу 13 белков. Поскольку митохондрии обычно содержат >1000 белков, участвующих в различных метаболических путях, биогенез органеллы требует жестко регулируемых средств импорта и сборки белков-предшественников из цитозола в различные митохондриальные подкомпоненты для поддержания надлежащей стехиометрии и функции12,13. Ядерно-кодированные белки, предназначенные для митохондрий, обычно несут митохондриальную целевую последовательность (MTS), которая нацеливает их на органеллу и облегчает их субкомпарментальную локализацию. Большинство связанных с матрицей белков содержат расщепляемый N-концевой MTS, в то время как те, которые предназначены для внешней или внутренней митохондриальной мембраны, обычно имеют внутренние целевые домены14. Процесс импорта осуществляется по набору разнообразных каналов, которые обеспечивают несколько путей для входа в органеллу13. Транслоказ комплекса наружной мембраны (TOM) переносит предшественников из цитозола в межмембранное пространство, где они распознаются транслоказой комплекса внутренней мембраны (TIM). Этот комплекс отвечает за импорт ядерно-кодированных прекурсоров в матрицу, где протеазы расщепляют N-концевую целевую пресеквацию. Белки, предназначенные для внешней мембраны, могут быть непосредственно вставлены в эту мембрану через комплекс TOM, в то время как те, которые предназначены для внутренней мембраны, вставляются белком TIM, в частности TIM22. После их импорта белки дополнительно обрабатываются резидентными протеазами и шаперонами и часто объединяются, образуя более крупные комплексы, такие как те, которые обнаружены в цепи переноса электронов.

Сам импорт митохондриального белка также служит измерением здоровья митохондрий, так как этот процесс опирается на наличие мембранного потенциала и источника энергии в виде АТФ15. Например, когда мембранный потенциал рассеивается, протеинкиназа PINK1 не может быть поглощена органеллой, и это приводит к сигналам фосфорилирования, которые вызывают начало деградации органеллы через путь, называемый митофагией16,17. При аналогичных обстоятельствах, когда импорт затруднен, белок ATF5 не может попасть в органеллу, и впоследствии он перемещается в ядро, где он служит фактором транскрипции для повышения регуляции экспрессии гена УПО18,19. Таким образом, измерение эффективности импорта белка может обеспечить всестороннее понимание здоровья органеллы, в то время как реакция экспрессии генов может быть использована для указания степени ретроградной передачи сигналов в ядро.

Несмотря на его очевидную важность для биогенеза митохондрий и для клеточного здоровья в целом, путь импорта в митохондриях млекопитающих удивительно недостаточно изучен. В этом отчете мы описываем конкретные шаги, связанные с измерением импорта белков-предшественников в митохондрии скелетных мышц, и предоставляем данные, иллюстрирующие адаптивную реакцию системы импорта на изменения в мышцах и неиспользование, иллюстрируя вклад импорта белка в адаптивную пластичность скелетных мышц.

протокол

Все животные, используемые в этих экспериментах, содержатся в учреждении по уходу за животными в Йоркском университете. Эксперименты проводятся в соответствии с руководящими принципами Канадского совета по уходу за животными с одобрения Комитета по уходу за животными Йоркского университета (разрешение: 2017-08).

1. Функциональная изоляция субсарколеммальных и межмиофибриллярных митохондрий из скелетных мышц

  1. Препарат реагента:
    1. Подготовьте все буферы и носители, как указано в таблице 1.
    2. Установите буферы на рН 7,4 и храните при 4 °C (до 2 недель), за исключением протеазы награзы.
    3. Каждый раз готовьте свежую протеазу нагарса (табл. 1).
  2. Удаление тканей и измельчение
    ПРИМЕЧАНИЕ: Блок-схема шагов ниже для выделения митохондрий приведена на рисунке 1.
    1. Наполните стеклянный сцинтилляционный флакон ~20 мл буфера 1 (таблица 1) и поместите его на лед.
    2. Пока мышь находится под наркозом, соберите скелетные мышцы (большеберцовая кисть передняя, квадрицепсовая, икроножная мышца и т. Д.), Приблизительно 500-1000 мг, и поместите мышцы в сцинтилляционный флакон, содержащий охлажденный буфер 1.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Газообразный изофлуран используется в качестве анестетика при 2,5% при расходе 0,4 л O2/мин. Тест на защемление проводится, чтобы убедиться, что животное не реагирует.
    3. После сбора тканей усыплите животное через вывих шейки матки.
    4. Предварительно охладите часовое стекло на льду. Удалите жир или соединительную ткань из мышц и измельчите ткань на часовом стекле, пока она не станет однородной суспензией.
    5. Поместите измельченную ткань в предварительно охлажденную пластиковую центрифугированную трубку объемом 50 мл (см. Таблицу материалов) и запишите точный вес.
    6. Разбавить измельченную ткань в 10 раз буфером 1 + АТФ (табл. 1).
    7. Гомогенизируйте образец мышц с помощью 8-миллиметрового двухлопастного гомогенизатора (см. Таблицу материалов) при выходной мощности 9,8 Гц в течение 10 с, гарантируя, что не останутся видимые куски мышц.
    8. Центрифугирование образцов при 800 х г в течение 10 мин с помощью высокоскоростной центрифуги (см. Таблицу материалов).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Целью этого шага является разделение митохондриальных фракций SS и IMF. Супернат содержит митохондрии SS, в то время как гранула содержит митохондрии IMF.
  3. Митохондриальная изоляция SS
    1. Отфильтруйте супернат через один слой марли в другой набор пластиковых центрифугирующих трубок объемом 50 мл, чтобы удалить любой крупный мусор или загрязняющие вещества.
    2. Центрифуга суперната при 9 000 х г в течение 10 мин при 4 °C с помощью высокоскоростной центрифуги.
    3. Откажитесь от суперната и повторно суспендируйте гранулу в 3,5 мл буфера 1 + АТФ.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Восстановите с помощью P1000 и сделайте это осторожно. Митохондрии являются хрупкими органеллами. Действуйте осторожно и избегайте прикосновения к грануле кончиком пипетки.
    4. Центрифугируйте образец при 9 000 х г в течение 10 мин при 4 °C с помощью высокоскоростной центрифуги.
    5. Отбросьте супернат, если не требуется дальнейшая обработка для выделения цитозольной фракции, лишенной ядер, митохондрий и других органелл. Тщательно повторно суспендируйте гранулу примерно в 95 мкл среды повторного суспензии (таблица 1) с использованием пипетки P200.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Аналогично этапу 1.3.3, избегайте прикосновения гранулы к наконечнику пипетки. Объем среды повторного суспензии может быть изменен в зависимости от размера гранулы. Это митохондриальная фракция SS, которая может храниться на льду до тех пор, пока фракция IMF не будет выделена. При желании цитозольную фракцию, лишенную органелл, можно выделить центрифугированием суперната при 100 000 х г в ультрацентрифуге (см. Таблицу материалов) и последующим выбросом гранулы.
  4. Митохондриальная изоляция МВФ
    1. Гранулу разбавляют со стадии 1.2.8 в 10 раз в буфере 1 + АТФ. Повторное суспендирование с использованием тефлонового пестика путем осторожного смешивания гранул и буфера вместе до тех пор, пока образец не станет однородным.
    2. Гомогенизируйте образец с помощью 8-миллиметрового двухлопастного гомогенизатора (см. Таблицу материалов) при выходной мощности 9,8 Гц в течение 10 с.
    3. Центрифугируйте образец при 800 х г в течение 10 мин при 4 °C с помощью высокоскоростной центрифуги.
    4. Отбросьте супернат и разбавьте митохондриальную гранулу IMF в 10 раз, используя буфер 2, и повторно суспендируйте с помощью тефлонового пестика, осторожно перемешав до тех пор, пока он не станет однородным.
    5. Добавьте 25 мкл/г ткани к 10 мг/мл протеазы нагарса (таблица 1) и поместите центрифугированную трубку на бок на льду, осторожно перемешивая каждую минуту, раскачивая трубку из стороны в сторону.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Добавление нагарса помогает освободить митохондрии МВФ, выполняя ограниченное переваривание миофибрилл.
    6. Через 5 мин добавляют 20 мл буфера 2 (таблица 1), чтобы разбавить протеазу нагарса до точки бездействия и остановить пищеварение.
    7. Немедленно центрифугируйте образец при 5000 х г в течение 5 мин при 4 °C с помощью высокоскоростной центрифуги.
    8. Откажитесь от суперната и разбавьте гранулу в 10 раз, используя буфер 2, и повторно суспендируйте с помощью тефлонового пестика, аккуратно перемешав.
    9. Центрифугируйте образец при 800 х г в течение 15 мин при 4 °C, чтобы гранулировать волокнистый материал.
    10. Налейте супернат в новый набор из пластиковых центрифужных трубок объемом 50 мл, стараясь не нарушить гранулу, которую можно выбросить.
    11. Центрифугируйте образец при 9 000 х г в течение 10 мин при 4 °C, как на стадии 1.4.7.
    12. Отбросьте супернат, добавьте 3,5 мл буфера 2 и осторожно повторно суспендируйте гранулу с помощью пипетки P1000.
    13. Центрифугируйте образец при 9 000 х г в течение 10 мин при 4 °C, как на стадии 1.4.7.
    14. Отбросьте супернат и осторожно повторно суспендируйте гранулу примерно 180 мкл ресуспенсионной среды с помощью пипетки P200.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Объем среды для повторного суспензии может быть изменен в зависимости от размера гранулы. Это митохондриальная фракция МВФ, которая может храниться на льду до тех пор, пока она не будет использована в импортном анализе.

2. Импорт митохондриального белка

  1. In vitro транскрипция
    ПРИМЕЧАНИЕ: Эти последующие шаги описывают, как подготовить радиомаркированный белок для импорта. Исследуемый путь импорта может диктовать выбор целевого белка, например, для оценки импорта в митохондриальный матрикс, обычно используются орнитинкарбамилтрансфераза, OCT и малатдегидрогеназа, MDH, в то время как Tom40 обычно используется в качестве индикатора импорта во внешнюю митохондриальную мембрану. Для следующих шагов требуется плазмидная ДНК, кодирующая белок выбора. Транскрипция плазмидной ДНК может быть выполнена до выделения митохондрий в отдельный день, а мРНК, собранная в результате этого эксперимента, может быть сохранена и использована в будущих экспериментах по трансляции и импорту.
    1. Линеаризация ДНК: Объедините 40 мкл плазмидной ДНК (5 мкг/мкл), 5 мкл 10-кратного ферментного буфера и 5 мкл фермента рестрикции и инкубируйте при 37 °C в течение 30 мин.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Используемые ферменты рестрикции могут варьироваться в зависимости от плазмиды, что может потребовать другого ферментного буфера, и экспериментальные условия ДНК может быть использована в любом количестве / объеме, поскольку шаблон может быть увеличен или уменьшен.
    2. Очищают и выбрасывают линеаризованную ДНК с помощью фенола и этанола. Выполните все последующие этапы (2.1.3-2.1.15) в стерильных трубках объемом 1,5 мл и используйте настольную центрифугу (см. Таблицу материалов) для этапов центрифугирования.
    3. Добавьте соответствующий объем стерильного H2O таким образом, чтобы конечный объем равнялся 400 мкл. Затем добавляют 400 мкл фенола.
    4. Энергично перемешайте путем инверсии в течение ~10 с и центрифуги при 17 000 х г в течение 1 мин при 4 °C. Выведите и сохраните верхнюю фазу.
    5. Добавьте 400 мкл фенола:хлороформа:изоамилового спирта (25:24:1, v:v:v).
    6. Энергично перемешайте путем инверсии в течение ~10 с и центрифуги при 17 000 г в течение 1 мин при 4 °C. Выведите и сохраните верхнюю фазу.
    7. Добавьте 400 мкл хлороформа:изоамилового спирта (24:1, v:v).
    8. Энергично перемешайте путем инверсии в течение ~10 с и центрифуги при 17 000 г в течение 1 мин при 4 °C. Выведите и сохраните верхнюю фазу.
    9. Добавьте 40 мкл 3M ацетата натрия (рН 7,0) и добавьте 1 мл 95% этанола.
    10. Поместите стерильные пробирки объемом 1,5 мл в морозильную камеру с температурой -80 °C на бок на 15 мин.
    11. Центрифугирование образцов при 17 000 х г в течение 10 мин при 4 °C.
    12. Откажитесь от суперната и промыть гранулу 300 мкл 80% этанола.
    13. Центрифугирование образцов при 17 000 х г в течение 2 мин при 4 °C.
    14. Откажитесь от суперната и высушите гранулу на воздухе. Как только гранула высохнет, она должна быть прозрачной.
    15. Повторное суспендирование гранулы в 20 мкл стерильного H2O
    16. Измерьте концентрацию ДНК с помощью спектрофотометра (см. Таблицу материалов) и убедитесь, что соотношение A260:280 выше 1,8.
    17. Развести ДНК до концентрации 0,8 мкг/мкл в стерильном H2O.
    18. Транскрибируют ДНК: объединяют плазмиду (0,8 мкг/мкл, 60,8 мкл), стерильный H2O (8,4 мкл), 10 мМ NTP (5,2 мкл), 10 мМ АТФ (10,0 мкл), 1 мМ М-7-Г (11,6 мкл), смесь, как указано на стадии 2,1,19 (15,6 мкл), РНКАсин (5,2 мкл) и соответствующую РНК-полимеразу (4,8 мкл) с образованием «одной реакционной смеси» (общий объем = 121,6 мкл) и инкубируют в течение 90 мин при оптимальной температуре для полимеразы (37 °C для T7 полимеразы; 40 °C для SP6 полимеразы)
    19. Для приготовления смеси добавляют 200 мкл 1M HEPES (рН 7,9), 100 мкл 1 M MgAc2, 500 мкл 4 M KAc, 100 мкл 20 мМ спермидина, 100 мкл 0,5 M DTT и 200 мкл стерильного H20.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Реакцию можно масштабировать в объеме вверх или вниз при условии соблюдения предусмотренных пропорций реагентов. Используемая РНК-полимераза диктуется последовательностью бактериального промотора в используемой плазмиде.
    20. Затем очищают и выбрасывают мРНК с использованием фенола и этанола, как показано на этапах 2.1.2-2.1.15. Доведите объем до 400 мкл со стерильным H2O (добавьте 280 мкл) и действуйте так, как описано в шагах 2.1.2-2.1.15. Повторно суспендируют конечную гранулу в 20 мкл стерильного H2O.
    21. Измерьте концентрацию мРНК с помощью спектрофотометра, убедитесь, что соотношение A260:280 составляет ~ 2,0.
    22. Разбавляют мРНК до 2,8 мкг/мкл в стерильном H2O и хранят при -20 °C в 50 мкл аликвотах.
  2. Перевод in vitro
    ПРИМЕЧАНИЕ: Трансляция желаемой ДНК должна быть выполнена в тот же день импортного эксперимента. Этот эксперимент требует использования меченых радиоактивными аминокислотами, и поэтому пользователь должен иметь разрешение на использование радиоизотопов, и все обращение и удаление должны соответствовать политике / требованиям учреждения. Шаги, связанные с мерами безопасности радиоизотопов, были опущены или кратко описаны, поскольку они, вероятно, будут отличаться в зависимости от учреждения.
    1. Подготовьте достаточно реакционной смеси трансляции (таблица 2) для подачи ~20 мкл на образец митохондрий для использования в эксперименте по импорту и включите тот же объем для трансляционной полосы.
    2. Инкубируют реакцию в течение 30 мин при 30 °C (время может варьироваться в зависимости от мРНК, 25-60 мин).
    3. Регистрируйте использование 35S-метионина в соответствии с требованиями радиоактивной безопасности учреждения и утилизируйте все, что вступило в контакт с радиоизотопом в соответствии с руководящими принципами учреждения.
  3. Импорт белка
    ПРИМЕЧАНИЕ: Для следующих шагов требуются свежеизолированные митохондрии. Обратитесь к протоколу изоляции митохондрий. Другие методы изоляции могут быть использованы до тех пор, пока митохондрии жизнеспособны и функциональны. Для последующих этапов используемые митохондриальные образцы повторно суспендируются в буфере повторного суспензии, как описано выше (Таблица 1). Концентрация белка в митохондриальном образце также должна быть измерена до начала импортного анализа.
    1. Примерно через 15 мин после начала реакции трансляции аликвотирует 90 мкг митохондрий в стерильные пробирки объемом 1,5 мл и предварительно инкубирует при 30 °C в течение ~ 10 мин.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Аликвот больше митохондрий, чем то, что на самом деле будет использоваться в эксперименте; фактически будет использоваться только 75 мкг. Однако избыточное цитирование не является обязательным требованием.
    2. В свежем наборе стерильных пробирок объемом 1,5 мл соедините 75 мкг митохондрий с 18 мкл реакции трансляции и инкубируйте при 30 °C в течение желаемого времени.
    3. Держите оставшийся объем реакции перевода на льду; это будет использовано позднее.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Импорт является процессом, зависящим от времени, поэтому может быть разумно начать с эксперимента с временным курсом, варьирующимся во времени инкубации от 1 до 60 минут. Типичное время реакции составляет 30 мин.
    4. За это время подготовьте сахарозную подушку, соединив 1 г сахарозы, 200 мкл 2,5 МКл, 10 мкл 1 М МгЛ2, 100 мкл 1 М HEPES (рН 7,4), и доведите объем до 5 мл с помощью стерильного H2O.
    5. Подготовьте новый набор стерильных пробирок по 1,5 мл, соответствующих каждой пробирке в реакции импорта. Aliquot 600 мкл сахарозной подушки вводят в каждую трубку и держат на льду до окончания реакции импорта.
    6. Чтобы прекратить реакцию импорта после соответствующего времени инкубации, снимите трубку с температуры 30 °C, поместите ее на лед, а затем осторожно перенесите реакцию импорта поверх трубки с сахарозной подушкой.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Этот шаг должен быть сделан очень медленно, чтобы гарантировать, что митохондрии не повреждены / не разорваны. Сахарозная подушка помогает замедлить миграцию митохондрий и «смягчает» их спуск на дно трубки во время последующего этапа центрифугирования.
    7. Центрифуга образцов + сахарозная подушка при 17 000 х г в течение 15 мин при 4 °C.
    8. Подготовьте разрывной буфер, объединив 25 мл сорбита 2,4 М, 2 мл 1 М HEPES (рН 7,4) и 72 мл двойного дистиллированного H2O.
    9. Подготовьте буфер лизиса для электрофореза геля SDS-PAGE: смешайте 50 мл нагретого глицерина, 11,5 г SDS, 31,25 мл 1 M Tris (рН 6,8) и доведите объем до 500 мл с двойным дистиллированным H2O.
    10. Для пробоподготовки смешайте 475 мкл лизисного буфера с 25 мкл β-меркаптоэтанола для использования на более позднем этапе.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Буфер лизиса может быть изготовлен заранее и храниться при комнатной температуре; однако добавление β-меркаптоэтанола должно быть сделано в свежем виде.
    11. Используя пипетку P1000, осторожно удалите супернат и не потревожите гранулу. Утилизируйте супернат в соответствующий контейнер с радиоактивными отходами.
    12. Для импорта во внешнюю мембрану выполните это с помощью Tom40, повторно суспендируйте гранулу в 50 мкл свежеприготовленного 0,1 М карбоната натрия (рН 11,5) и инкубируйте на льду в течение 30 мин.
    13. После инкубации центрифугируют образец 14 000 х г в течение 5 мин при 4°С. Этот этап выполняется только для реакций импорта наружной мембраны.
    14. Чтобы подготовить образцы для электрофореза SDS-PAGE, добавьте 20 мкл разрывающего буфера, 20 мкл буфера лизиса и β-меркаптоэтанола и хорошо повторно суспендируйте. Добавьте 5 мкл образца красителя.
    15. Подготовьте контрольную/трансляционную полосу, объединив 3 мкл оставшейся реакции трансляции со стадии 2.3.3 с 37 мкл лизисного буфера и 5 мкл образца красителя. Хорошо перемешать.
    16. Кипятите образцы в течение 5 минут при 95 °C и осторожно вращайте вниз на низкой скорости, чтобы избежать гранулирования митохондрий.
    17. Нанесите образцы на полиакриламидный гель SDS.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Процент геля и последующее время выполнения будут зависеть от того, какой белок импортируется. Например, OCT составляет 37 кДа, а его зрелая обработанная полоса немного меньше; таким образом, 12% гель позволяет хорошо разделить эти полосы.
    18. Как только электрофорез будет завершен, удалите гель и поместите его в двойной дистиллированный H2O.
    19. Кипятите гель в 5% TCA в вытяжном шкафу в течение 5 мин, непрерывно перемешивая/перемешивая гель, чтобы избежать растрескивания.
      ПРИМЕЧАНИЕ: TCA помогает затвердеть гель для визуализации; это можно сделать в металлическом лотке над горелкой Бунзена. Используйте достаточное количество TCA, чтобы щедро покрыть гель, ~ 1/2 полной.
    20. Извлеките гель и поместите его обратно в двойной дистиллированный H2O. Перемешайте его на вращающейся пластине в течение 1 мин при ~50 об/мин.
    21. Вымойте гель в 10 мМ Tris на вращающейся пластине в течение 5 мин при ~50 об/мин, снова используя достаточно, чтобы щедро покрыть гель, ~1/2 контейнера.
    22. Осаждение белка путем промывания геля в 1 М салициклической кислоты на вращающейся пластине в течение 30 мин, снова используя достаточное количество салициклической кислоты, чтобы щедро покрыть гель, ~ 1/2 используемого контейнера.
    23. Обезвоживать гель, как описано в шагах 2.3.24-2.3.31.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Это можно сделать несколькими способами. Гелевая сушилка (см. Таблицу материалов) обеспечивает экономию времени (описано ниже); однако могут использоваться другие коммерчески доступные методы/комплекты, которые могут быть более рентабельными, но более трудоемкими. Наборы для сушки геля могут использоваться в качестве альтернативы, которая не требует применения тепла или всасывания, но вместо этого позволяет гелю высыхать на воздухе между целлофановыми листами для предотвращения искажений.
    24. Положите большой лист промокательной бумаги на пористую поверхность гелевой сушилки. Поместите один лист бумажного полотенца в область, где будет наноситься гель.
    25. Вырежьте лист бумаги размером 15 см х 20 см и положите его на бумажное полотенце.
    26. Вычерпните гель из контейнера, используя второй кусок промокательной бумаги размером 15 см х 20 см, и положите его плоско поверх первого кусочка.
    27. Вырежьте немного больший кусок полиэтиленовой пленки, ~20 см х 25 см, и поместите его на гель, чтобы под пленкой не было складок или пузырьков.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Это может занять несколько попыток, но крайне важно, чтобы не было захваченных воздушных карманов.
    28. Аккуратно положите пластиковую крышку гелевой сушилки поверх упаковки, снова убедившись, что нет пузырьков или складок.
    29. Включите насос/вакуум и убедитесь, что пластиковая крышка образовала уплотнение. Проверьте уплотнение, подняв угол пластиковой крышки и подождите, пока оно снова запечатается.
    30. Закройте гелевую сушилку и потрите в течение 90 минут. Установите температуру, чтобы начать с 30 ° C, постепенно достичь 80 ° C, а затем вернуться к 30 ° C в конце пробега.
    31. После обезвоживания гель затвердеет и почувствует себя тонким. Заверните гель в полиэтиленовую пленку, используемую в процессе сушки.
    32. Поместите обезвоженный гель в пленочную кассету с фосфорной пленкой (см. Таблицу материалов), белой стороной поверните гель. Время экспозиции варьируется, но может составлять 24-48 ч для визуализации полос.
    33. Визуализация с помощью авторедиографии с использованием любого подходящего тепловизора, способного к фосфорной визуализации.

Результаты

Мы подробно проиллюстрировали, что этот протокол является действительным анализом для определения скорости импорта в функциональные и интактные изолированные митохондрии скелетных мышц. По сравнению с необработанными условиями, импорт типичных белков-предшественников, таких как ма...

Обсуждение

Митохондрии уникально зависят от экспрессии и координации как ядерного, так и митохондриального геномов для их синтеза и расширения в клетках. Тем не менее, ядерный геном кодирует подавляющее большинство (99%) митохондриального протеома, и это подчеркивает важность механизма импорта бе...

Раскрытие информации

Авторы не заявляют о каких-либо конфликтах интересов, финансовых или иных.

Благодарности

Авторы хотели бы поблагодарить доктора Г.C Шора из Университета Макгилла, доктора А. Штрауса из Вашингтонской школы медицины и доктора .M.Т. Райана из Университета Ла Троуб за оригинальные пожертвования экспрессионных плазмид, которые были использованы для этого исследования. Эта работа была поддержана финансированием со стороны Совета по естественным наукам и инженерным исследованиям Канады (NSERC) Д. А. Худа. Д. А. Худ также является обладателем Канадской исследовательской кафедры в области клеточной физиологии.

Материалы

NameCompanyCatalog NumberComments
0.2% BSASigmaA2153
35S-methioninePerkin ElmerNEG709A500UCPurchase requires a valid radioisotope permit
ATPSigmaA7699
Blotting paper; Whatman 3MM CHR PaperThermo Fisher05-714-5
Cassette for filmKodakKodak Xomatic
Centrifugation TubeThermo Fisher3138-0050
ChloroformThermo FisherC298-4
DTTSigmaD9779-5G
EDTABioShopEDT002
EGTASigmaE4378
Gel DryerBioRadModel 583
Gel Drying KitSigma or BioRadZ377570-1PAK or OW-GDF-10Various options are commercially available through many companies, these are just as few examples.
GlycerolCaledon Laboratory Chemicals5350-1-40
HEPESSigmaH3375
High Speed CentrifugeBeckman CoulterAvanti J-25 Centrifuge
HomogenizerIKAT25 Digital Ultra Turrex
Isoamylalcohol, or 3-methylbutanolSigmaI9392
KAcBioShopPOA301.500
KClSigmaP3911
M7GNew England BiolabS1404SDilute with 1000ul 20mM HEPES to make 1mM stock
MgClBioShopMAG510
MgSO4Thermo FisherM65-500
MOPSBioShopMOP001
NaClBioShopSOD001
NTPThermo FisherR0191
OCT Plasmid--Donated from Dr. G. C. Shore, McGill University, Montreal, Canada; alternative available through Addgene, plasmid #71877
pGEM4Z/hTom40 Plasmid--Donated from Dr. M. T. Ryan, La Trobe University, Melbourne, Australia
pGMDH Plasmid--Donated from Dr. A. Strauss, Washington University School of Medicine
PhenolSigmaP4557
Phenol:Chloroform:IsoamyalcoholSigmaP3803Can also be made with the ratio provided
Phosphorus FilmFujifilmBAS-IP MS 2025
Rabbit reticulocyte lysatePromegaL4960Avoid freeze-thaw; aliquot lysate upon arrival; amino acids are provided in the kit as well
RNAsinPromegaN2311
Rotor for High Speed CentrifugeBeckman CoulterJA-25.50
SDSBioShopSDS001.500Caution: harmful if ingested or inhaled, wear a mask.
Sodium acetateBioshopSAA 304
Sodium CarbonateVWRBDH9284
Sodium salicylateMillipore Sigma106601
SorbitolSigmaS6021
SP6 RNA PolymerasePromegaP1085
SpectrophotometerThermo FisherNanodrop 2000
SpermidineSigmaS-2626
SucroseBioShopSUC507
T7 RNA PolymerasePromegaP2075
Tabletop CentrifugeThermo FisherAccuSpin Micro 17
Trichloroacetic acidThermo FisherA322-500
TrisBioShopTRS001
β-mercaptoethanolSigmaM6250-100ML

Ссылки

  1. Kirkwood, S. P., Munn, E. A., Brooks, G. A. Mitochondrial reticulum in limb skeletal muscle. The American Journal of Physiology. 251 (3), 395-402 (1986).
  2. Glancy, B., et al. Power grid protection of the muscle mitochondrial reticulum. Cell Reports. 19 (3), 487-496 (2017).
  3. Vincent, A. E., et al. Quantitative 3D mapping of the human skeletal muscle mitochondrial network. Cell Reports. 26 (4), 996-1009 (2019).
  4. Ogata, T., Yamasaki, Y. Ultra-high-resolution scanning electron microscopy of mitochondria and sarcoplasmic reticulum arrangement in human red, white, and intermediate muscle fibers. Anatomical Record. 248 (2), 214-223 (1997).
  5. Hood, D. A., Tryon, L. D., Carter, H. N., Kim, Y., Chen, C. C. W. Unravelling the mechanisms regulating muscle mitochondrial biogenesis. Biochemical Journal. 473, 2295-2314 (2016).
  6. Perry, C. G. R., Kane, D. A., Lanza, I. R., Neufer, P. D. Methods for assessing mitochondrial function in diabetes. Diabetes. 62, 1032-1036 (2013).
  7. Holloszy, J. O. Biochemical adaptations in muscle. The Journal of Biological Chemistry. 242 (9), 2278-2282 (1967).
  8. Cogswell, A. M., Stevens, R. J., Hood, D. A. Properties of skeletal muscle mitochondria from subsarcolemmal and intermyofibrillar isolated regions. The American Journal of Physiology. 264, 383-389 (1993).
  9. Koves, T. R., Noland, R. C., Bates, A. L., Henes, S. T., Muoio, D. M., Cortright, R. N. Subsarcolemmal and intermyofibrillar mitochondria play distinct roles in regulating skeletal muscle fatty acid metabolism. American Journal of Physiology - Cell Physiology. 288, 1074-1082 (2005).
  10. Bizeau, M. E., Willis, W. T., Hazel, J. R. Differential responses to endurance training in subsarcolemmal and intermyofibrillar mitochondria. Journal of Applied Physiology. 85 (4), 1279-1284 (1998).
  11. Krieger, D. A., Tate, C. A., McMillin-Wood, J., Booth, F. W. Populations of rat skeletal muscle mitochondria after exercise and immobilization. Journal of Applied Physiology: Respiratory, Environmental and Exercise Physiology. 48 (1), 23-28 (1980).
  12. Calvo, S. E., Clauser, K. R., Mootha, V. K. MitoCarta2.0: An updated inventory of mammalian mitochondrial proteins. Nucleic Acids Research. 44 (1), 1251-1257 (2016).
  13. Wiedemann, N., Pfanner, N. Mitochondrial machineries for protein import and assembly. Annual Review of Biochemistry. 86 (1), 685-714 (2017).
  14. Backes, S., Herrmann, J. M. Protein translocation into the intermembrane space and matrix of mitochondria: mechanisms and driving forces. Frontiers in Molecular Biosciences. 4, 83 (2017).
  15. Harbauer, A. B., Zahedi, R. P., Sickmann, A., Pfanner, N., Meisinger, C. The protein import machinery of mitochondria - A regulatory hub in metabolism, stress, and disease. Cell Metabolism. 19 (3), 357-372 (2014).
  16. Jin, S. M., Lazarou, M., Wang, C., Kane, L. A., Narendra, D. P., Youle, R. J. Mitochondrial membrane potential regulates PINK1 import and proteolytic destabilization by PARL. The Journal of Cell Biology. 191 (5), 933-942 (2010).
  17. Matsuda, N., et al. PINK1 stabilized by mitochondrial depolarization recruits Parkin to damaged mitochondria and activates latent Parkin for mitophagy. The Journal of Cell Biology. 189 (2), 211-221 (2010).
  18. Fiorese, C. J., Schulz, A. M., Lin, Y. -. F., Rosin, N., Pellegrino, M. W., Haynes, C. M. The transcription factor ATF5 mediates a mammalian mitochondrial UPR. Current biology. 26 (15), 2037-2043 (2016).
  19. Quiros, P. M., et al. Multi-omics analysis identifies ATF4 as a key regulator of the mitochondrial stress response in mammals. The Journal of Cell Biology. 216 (7), 2027-2045 (2017).
  20. Takahashi, M., Hood, D. A. Protein import into subsarcolemmal and intermyofibrillar skeletal muscle mitochondria. Differential import regulation in distinct subcellular regions. The Journal of Biological Chemistry. 271 (44), 27285-27291 (1996).
  21. Hood, D. A., Memme, J. M., Oliveira, A. N., Triolo, M. Maintenance of skeletal muscle mitochondria in health, exercise, and aging. Annual Review of Physiology. 81, (2019).
  22. Joseph, A., Hood, D. A. Mitochondrion plasticity of TOM complex assembly in skeletal muscle mitochondria in response to chronic contractile activity. Mitochondrion. 12 (2), 305-312 (2012).
  23. Singh, K., Hood, D. A. Effect of denervation-induced muscle disuse on mitochondrial protein import. American Journal of Physiology-Cell Physiology. 300 (1), 138-145 (2011).
  24. Zhang, Y., et al. Altered mitochondrial morphology and defective protein import reveal novel roles for Bax and/or Bak in skeletal muscle. American Journal of Physiology. Cell Physiology. 305 (5), 502-511 (2013).
  25. Lai, N., Kummitha, C., Rosca, M., Fujioka, H., Tandler, B., Hoppel, C. Isolation of mitochondrial subpopulations from skeletal muscle: optimizing recovery and preserving integrity. Acta Physiologica. 25 (2), 13182 (2019).
  26. Nargund, A. M., Pellegrino, M. W., Fiorese, C. J., Baker, B. M., Haynes, C. M. Mitochondrial import efficiency of ATFS-1 regulates mitochondrial UPR activation. Science. 337 (6094), 587-590 (2012).
  27. Picard, M., Taivassalo, T., Gouspillou, G., Hepple, R. T. Mitochondria: Isolation, structure and function. Journal of Physiology. 589 (18), 4413-4421 (2011).
  28. Kras, K. A., Willis, W. T., Barker, N., Czyzyk, T., Langlais, P. R., Katsanos, C. S. Subsarcolemmal mitochondria isolated with the proteolytic enzyme nagarse exhibit greater protein specific activities and functional coupling. Biochemistry and Biophysics Reports. 6, 101-107 (2016).
  29. Sánchez-Duarte, E., et al. Nicorandil affects mitochondrial respiratory chain function by increasing complex III activity and ROS production in skeletal muscle mitochondria. Journal of Membrane Biology. 253 (4), 309-318 (2020).
  30. Iñigo, M. R., et al. Estrogen receptor-α in female skeletal muscle is not required for regulation of muscle insulin sensitivity and mitochondrial regulation. Molecular Metabolism. 34 (2020), 1-15 (2020).
  31. Newsom, S. A., Stierwalt, H. D., Ehrlicher, S. E., Robinson, M. M. Substrate-specific respiration of isolated skeletal muscle mitochondria after 1 h of moderate cycling in sedentary adults. Medicine and Science in Sports and Exercise. 53 (7), 1375-1384 (2021).
  32. Takahashi, M., Chesley, A., Freyssenet, D., Hood, D. A. Contractile activity-induced adaptations in the mitochondrial protein import system. The American Journal of Physiology. 274 (5), 1380-1387 (1998).
  33. Kravic, B., et al. In mammalian skeletal muscle, phosphorylation of TOMM22 by protein kinase CSNK2/CK2 controls mitophagy. Autophagy. 8627, 01-65 (2017).
  34. Opalińska, M., Meisinger, C. Metabolic control via the mitochondrial protein import machinery. Current Opinion in Cell Biology. 33, 42-48 (2015).
  35. Gerbeth, C., et al. Glucose-induced regulation of protein import receptor tom22 by cytosolic and mitochondria-bound kinases. Cell Metabolism. 18 (4), 578-587 (2013).

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на использование текста или рисунков этого JoVE статьи

Запросить разрешение

Смотреть дополнительные статьи

179in vitro

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Исследования

Образование

О JoVE

Авторские права © 2025 MyJoVE Corporation. Все права защищены