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  • Resumen
  • Resumen
  • Introducción
  • Protocolo
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  • Discusión
  • Divulgaciones
  • Agradecimientos
  • Materiales
  • Referencias
  • Reimpresiones y Permisos

Resumen

Las mitocondrias son orgánulos metabólicos clave que exhiben un alto nivel de plasticidad fenotípica en el músculo esquelético. La importación de proteínas del citosol es una vía crítica para la biogénesis de orgánulos, esencial para la expansión del retículo y el mantenimiento de la función mitocondrial. Por lo tanto, la importación de proteínas sirve como un barómetro de la salud celular.

Resumen

Las mitocondrias son orgánulos metabólicos y reguladores clave que determinan el suministro de energía, así como la salud general de la célula. En el músculo esquelético, las mitocondrias existen en una serie de morfologías complejas, que van desde pequeños orgánulos ovalados hasta una amplia red similar a un retículo. Comprender cómo el retículo mitocondrial se expande y se desarrolla en respuesta a diversos estímulos, como las alteraciones en la demanda de energía, ha sido durante mucho tiempo un tema de investigación. Un aspecto clave de este crecimiento, o biogénesis, es la importación de proteínas precursoras, originalmente codificadas por el genoma nuclear, sintetizadas en el citosol y translocadas en varios subcompartimentos mitocondriales. Las mitocondrias han desarrollado un mecanismo sofisticado para este proceso de importación, que involucra muchos canales selectivos de membrana interna y externa, conocidos como la maquinaria de importación de proteínas (PIM). La importación a la mitocondria depende del potencial de membrana viable y de la disponibilidad de ATP derivado de orgánulos a través de la fosforilación oxidativa. Por lo tanto, su medición puede servir como una medida de la salud de los orgánulos. El PIM también exhibe un alto nivel de plasticidad adaptativa en el músculo esquelético que está estrechamente acoplado al estado energético de la célula. Por ejemplo, se ha demostrado que el entrenamiento con ejercicios aumenta la capacidad de importación, mientras que el desuso muscular la reduce, coincidiendo con los cambios en los marcadores de contenido mitocondrial. Aunque la importación de proteínas es un paso crítico en la biogénesis y expansión de las mitocondrias, el proceso no está ampliamente estudiado en el músculo esquelético. Por lo tanto, este documento describe cómo utilizar mitocondrias aisladas y completamente funcionales del músculo esquelético para medir la capacidad de importación de proteínas con el fin de promover una mayor comprensión de los métodos involucrados y una apreciación de la importancia de la vía para el recambio de orgánulos en el ejercicio, la salud y la enfermedad.

Introducción

Las mitocondrias son orgánulos que existen en morfologías complejas en diferentes tipos de células y se reconoce que poseen una gama cada vez mayor de funciones que son críticas para la salud celular. Como tales, ya no pueden reducirse simplemente a orgánulos productores de energía. Las mitocondrias son reguladores metabólicos clave, determinantes del destino celular y centros de señalización, cuyas funciones pueden servir como indicadores útiles de la salud celular en general. En las células musculares esqueléticas, los estudios de microscopía electrónica revelan la presencia de mitocondrias subsarcolemmales (SS) e intermiofibrilares (IMF) geográficamente distintas, que exhiben un grado de conectividad1,2,3,4 que ahora se reconoce que es altamente dinámico y adaptable a los cambios en los niveles de actividad del músculo esquelético, así como con la edad y la enfermedad. El contenido mitocondrial y la función en el músculo pueden evaluarse de numerosas maneras5,6, y se han aplicado métodos tradicionales de aislamiento de orgánulos para comprender mejor las capacidades respiratorias y enzimáticas (Vmax) de las mitocondrias distintas de la influencia del medio celular7,8. En particular, estos métodos tradicionales han revelado sutiles distinciones bioquímicas entre mitocondrias aisladas de regiones subsarcolemmales e intermiofibrilares, desmintiendo posibles implicaciones funcionales para el metabolismo en estas regiones subcelulares8,9,10,11.

La biogénesis de las mitocondrias es única en requerir la contribución de productos genéticos del ADN nuclear y mitocondrial. Sin embargo, la gran mayoría de estos se derivan del núcleo, ya que la transcripción del ADNmt solo conduce a la síntesis de 13 proteínas. Dado que las mitocondrias normalmente comprenden >1000 proteínas involucradas en diversas vías metabólicas, la biogénesis del orgánulo requiere un medio estrechamente regulado de importación y ensamblaje de proteínas precursoras del citosol en los diversos subcompartimentos mitocondriales para mantener una estequiometría y función adecuadas12,13. Las proteínas codificadas nuclearmente destinadas a las mitocondrias normalmente llevan una secuencia de orientación mitocondrial (MTS) que las dirige al orgánulo y facilita su localización subcompartimental. La mayoría de las proteínas unidas a la matriz contienen un MTS N-terminal escindible, mientras que las destinadas a la membrana mitocondrial externa o interna suelen tener dominios de orientación internos14. El proceso de importación se lleva a cabo mediante un conjunto de canales diversos que proporcionan múltiples vías de entrada en el orgánulo13. La translocasa del complejo de membrana externa (TOM) transporta precursores desde el citosol hacia el espacio intermembrana, donde son reconocidos por la translocasa del complejo de membrana interna (TIM). Este complejo es responsable de importar precursores codificados nuclearmente a la matriz, donde las proteasas escinden la presecuencia de apuntamiento N-terminal. Las proteínas destinadas a la membrana externa se pueden insertar directamente en esta membrana a través del complejo TOM, mientras que las destinadas a la membrana interna se insertan mediante una proteína TIM, específicamente TIM22. Después de su importación, las proteínas son procesadas por proteasas y chaperonas residentes y, a menudo, se combinan para formar complejos más grandes, como los que se encuentran en la cadena de transporte de electrones.

La importación de proteínas mitocondriales en sí misma también sirve como una medida de la salud mitocondrial, ya que este proceso se basa en la presencia de potencial de membrana y una fuente de energía en forma de ATP15. Por ejemplo, cuando el potencial de membrana se disipa, la proteína quinasa PINK1 no puede ser absorbida por el orgánulo, y esto conduce a señales de fosforilación que desencadenan el inicio de la degradación del orgánulo a través de una vía llamada mitofagia16,17. En circunstancias similares, cuando se impide la importación, la proteína ATF5 no puede entrar en el orgánulo, y posteriormente se transloca al núcleo, donde sirve como factor de transcripción para la regulación ascendente de la expresión génica UPR18,19. Por lo tanto, medir la eficiencia de la importación de proteínas puede proporcionar una visión completa de la salud del orgánulo, mientras que la respuesta de expresión génica se puede utilizar para indicar el grado de señalización retrógrada al núcleo.

A pesar de su obvia importancia para la biogénesis de las mitocondrias y para la salud celular en general, la vía de importación en las mitocondrias de los mamíferos está notablemente poco estudiada. En este informe, describimos los pasos específicos involucrados en la medición de la importación de proteínas precursoras en las mitocondrias del músculo esquelético y proporcionamos datos para ilustrar la respuesta adaptativa del sistema de importación a los cambios en el músculo y el desuso, ilustrando la contribución de la importación de proteínas a la plasticidad adaptativa del músculo esquelético.

Protocolo

Todos los animales utilizados en estos experimentos se mantienen en el centro de cuidado de animales de la Universidad de York. Los experimentos se llevan a cabo de acuerdo con las pautas del Consejo Canadiense de Cuidado Animal con la aprobación del Comité de Cuidado de Animales de la Universidad de York (Permiso: 2017-08).

1. Aislamiento funcional de mitocondrias subsarcolemmales e intermiofibrilares del músculo esquelético

  1. Preparación de reactivos:
    1. Prepare todos los búferes y medios como se menciona en la Tabla 1.
    2. Ajuste los tampones a pH 7.4 y guárdelos a 4 °C (hasta 2 semanas), excepto la proteasa de nagrasa.
    3. Preparar nagarse proteasa fresca (Tabla 1) cada vez.
  2. Extracción de tejido y picado
    NOTA: En la Figura 1 se proporciona un diagrama de flujo de los pasos a continuación para el aislamiento de las mitocondrias.
    1. Llene un vial de centelleo de vidrio con ~ 20 ml de Buffer 1 (Tabla 1) y colóquelo sobre hielo.
    2. Mientras el ratón está bajo anestesia, cosecha los músculos esqueléticos (tibialis anterior, cuádriceps, gastrocnemio, etc.), aproximadamente 500-1000 mg, y coloca los músculos en el vial de centelleo que contiene Buffer 1 refrigerado.
      NOTA: El isoflurano gaseoso se utiliza como anestésico al 2,5% a un caudal de 0,4 L de O2/min. Se realiza una prueba de pellizco para garantizar que el animal no responda.
    3. Después de la recolección de tejido, eutanasia al animal a través de la dislocación cervical.
    4. Pre-enfriar un vaso de reloj sobre hielo. Retire cualquier grasa o tejido conectivo de los músculos y pica el tejido en el vidrio del reloj hasta que sea una suspensión homogénea.
    5. Coloque el tejido picado en un tubo de centrifugación de plástico preenfriado de 50 ml (consulte la Tabla de materiales) y registre el peso exacto.
    6. Diluir el tejido picado 10 veces con Buffer 1 + ATP (Tabla 1).
    7. Homogeneice la muestra muscular utilizando un homogeneizador de doble hoja de 8 mm (consulte la Tabla de materiales) a una potencia de salida de 9,8 Hz durante 10 s, asegurando que no queden trozos visibles de músculo.
    8. Centrifugar las muestras a 800 x g durante 10 min utilizando una centrífuga de alta velocidad (ver Tabla de Materiales).
      NOTA: El propósito de este paso es separar las fracciones mitocondriales SS e IMF. El supernato contiene mitocondrias SS, mientras que el pellet contiene mitocondrias IMF.
  3. Aislamiento mitocondrial de SS
    1. Filtre el sobrenado a través de una sola capa de gasa en otro conjunto de tubos de centrifugación de plástico de 50 ml para eliminar cualquier residuo o contaminante grande.
    2. Centrifugar el sobrenato a 9.000 x g durante 10 min a 4 °C utilizando una centrífuga de alta velocidad.
    3. Desechar el sobrenado y resuspend el pellet en 3,5 mL de Buffer 1 + ATP.
      NOTA: Vuelva a suspender con un P1000 y hágalo con cuidado. Las mitocondrias son orgánulos frágiles. Realizar suavemente y evitar tocar el pellet con la punta de la pipeta.
    4. Centrifugar la muestra a 9.000 x g durante 10 min a 4 °C utilizando una centrífuga de alta velocidad.
    5. Deseche el supernado a menos que se desee un procesamiento adicional para aislar una fracción citosólica desprovista de núcleos, mitocondrias y otros orgánulos. Resuspenda el pellet cuidadosamente en aproximadamente 95 μL del medio de resuspensión (Tabla 1) utilizando una pipeta P200.
      NOTA: Similar al paso 1.3.3, evite tocar el pellet con la punta de la pipeta. El volumen del medio de resuspensión puede ser alterado dependiendo del tamaño del pellet. Esta es la fracción mitocondrial SS, que se puede almacenar en hielo hasta que se aísle la fracción IMF. Si se desea, la fracción citosólica, desprovista de orgánulos, se puede aislar centrifugando el sobrenato a 100.000 x g en una ultracentrífuga (ver Tabla de Materiales) y posteriormente desechando el pellet.
  4. Aislamiento mitocondrial del FMI
    1. Diluya el pellet del paso 1.2.8 10 veces en Buffer 1 + ATP. Vuelva a suspender usando un mortero de teflón mezclando suavemente el pellet y el tampón hasta que la muestra sea consistente.
    2. Homogeneizar la muestra utilizando un homogeneizador de doble hoja de 8 mm (ver Tabla de Materiales) a una potencia de salida de 9,8 Hz durante 10 s.
    3. Centrifugar la muestra a 800 x g durante 10 min a 4 °C utilizando una centrífuga de alta velocidad.
    4. Deseche el supernado y diluya el gránulo mitocondrial IMF 10 veces usando Buffer 2 y vuelva a suspenderlo usando el mortero de teflón mezclando suavemente hasta que sea homogéneo.
    5. Añadir 25 μL/g de tejido a 10 mg/ml de nagarse proteasa (Tabla 1) y colocar el tubo de centrifugación de lado sobre hielo, mezclando suavemente cada minuto meciendo el tubo de lado a lado.
      NOTA: La adición de nagarse ayuda a liberar las mitocondrias IMF al realizar una digestión limitada de las miofibrillas.
    6. Después de 5 min, agregue 20 ml de Buffer 2 (Tabla 1) para diluir la nagarse proteasa hasta el punto de inactividad y detener la digestión.
    7. Centrifugar inmediatamente la muestra a 5.000 x g durante 5 min a 4 °C utilizando una centrífuga de alta velocidad.
    8. Deseche el sobrenado y diluya el pellet 10 veces usando Buffer 2 y vuelva a suspenderlo usando un mortero de teflón mezclando suavemente.
    9. Centrifugar la muestra a 800 x g durante 15 min a 4 °C para granular el material fibroso.
    10. Vierta el supernado en un nuevo conjunto de tubos centrífugos de plástico de 50 ml, con cuidado de no interrumpir el pellet, que se puede desechar.
    11. Centrifugar la muestra a 9.000 x g durante 10 min a 4 °C como en el paso 1.4.7.
    12. Deseche el supernado, agregue 3.5 ml de Buffer 2 y vuelva a suspender suavemente el pellet con una pipeta P1000.
    13. Centrifugar la muestra a 9.000 x g durante 10 min a 4 °C como en el paso 1.4.7.
    14. Deseche el sobrenado y vuelva a suspender el pellet suavemente con aproximadamente 180 μL de medio de resuspensión utilizando una pipeta P200.
      NOTA: El volumen del medio de resuspensión puede ser alterado dependiendo del tamaño del pellet. Esta es la fracción mitocondrial del FMI, que se puede almacenar en hielo hasta que se utilizará en el ensayo de importación.

2. Importación de proteínas mitocondriales

  1. In vitro transcripción
    NOTA: Estos pasos posteriores describen cómo preparar una proteína radiomarcada para la importación. La vía de importación bajo investigación puede dictar la elección de la proteína objetivo, por ejemplo, para evaluar la importación en la matriz mitocondrial, la ornitina carbamila transferasa, OCT, y la malato deshidrogenasa, MDH, se usan comúnmente, mientras que Tom40 se usa comúnmente como una indicación de importación en la membrana mitocondrial externa. Para los siguientes pasos, se requiere ADN plásmido que codifique la proteína de elección. La transcripción del ADN plásmido se puede hacer antes del aislamiento mitocondrial en un día separado, y el ARNm recogido de este experimento se puede almacenar y utilizar en futuros experimentos de traducción e importación.
    1. Linealizar el ADN: Combinar 40 μL de ADN plásmido (5 μg/μL), 5 μL de tampón enzimático 10x y 5 μL de enzima de restricción e incubar a 37 °C durante 30 min.
      NOTA: Las enzimas de restricción utilizadas pueden variar según el plásmido, lo que puede requerir un tampón enzimático diferente, y las condiciones experimentales del ADN se pueden usar en cualquier cantidad / volumen, ya que la plantilla se puede escalar hacia arriba o hacia abajo.
    2. Purificar y precipitar el ADN linealizado utilizando fenol y etanol. Realice todos los pasos posteriores (2.1.3-2.1.15) en tubos estériles de 1,5 ml, y utilice una centrífuga de mesa (ver Tabla de materiales) para los pasos de centrifugación.
    3. Añadir el volumen apropiado de H2O estéril para que el volumen final sea igual a 400 μL. Luego, agregue 400 μL de fenol.
    4. Mezclar vigorosamente por inversión durante ~10 s, y centrifugar a 17.000 x g durante 1 min a 4 °C. Retira y guarda la fase superior.
    5. Añadir 400 μL de fenol:cloroformo:isoamilalcohol (25:24:1, v:v:v).
    6. Mezclar vigorosamente por inversión durante ~10 s, y centrifugar a 17.000 g durante 1 min a 4 °C. Retira y guarda la fase superior.
    7. Añadir 400 μL de cloroformo:isoamilalcohol (24:1, v:v).
    8. Mezclar vigorosamente por inversión durante ~10 s, y centrifugar a 17.000 g durante 1 min a 4 °C. Retira y guarda la fase superior.
    9. Agregue 40 μL de acetato de sodio 3M (pH 7.0) y agregue 1 ml de etanol al 95%.
    10. Coloque los tubos estériles de 1,5 ml en el congelador de -80 °C de lado durante 15 min.
    11. Centrifugar las muestras a 17.000 x g durante 10 min a 4 °C.
    12. Deseche el sobrenado y lave el pellet con 300 μL de etanol al 80%.
    13. Centrifugar las muestras a 17.000 x g durante 2 min a 4 °C.
    14. Deseche el sobrenado y seque al aire el pellet. Una vez que el pellet está seco, debe estar claro.
    15. Resuspendir el pellet en 20 μL de H2O estéril
    16. Mida la concentración de ADN utilizando un espectrofotómetro (ver Tabla de Materiales) y asegúrese de que la relación A260:280 esté por encima de 1.8.
    17. Diluir el ADN a una concentración de 0,8 μg/μL en H2O estéril.
    18. Transcribir el ADN: Combinar plásmido (0,8 μg/μL, 60,8 μL), H2O estéril (8,4 μL), 10 mM NTP (5,2 μL), 10 mM ATP (10,0 μL), 1 mM M-7-G (11,6 μL), la mezcla mencionada paso 2.1.19 (15,6 μL), RNAsin (5,2 μL) y una ARN polimerasa apropiada (4,8 μL) para formar "una mezcla de reacción" (volumen total = 121,6 μL) e incubar durante 90 min a la temperatura óptima para la polimerasa (37 °C para la polimerasa T7; 40 °C para la polimerasa SP6)
    19. Para preparar la mezcla añadir 200 μL de 1M HEPES (pH 7.9), 100 μL de 1 M MgAc2, 500 μL de 4 M KAc, 100 μL de 20 mM de espermidina, 100 μL de 0,5 M de TDT y 200 μL de H20 estéril.
      NOTA: La reacción se puede escalar hacia arriba o hacia abajo en volumen siempre que se mantengan las proporciones proporcionadas de reactivos. La ARN polimerasa utilizada está dictada por la secuencia promotora bacteriana dentro del plásmido que se está utilizando.
    20. Luego, purificar y precipitar el ARNm usando fenol y etanol como en los pasos 2.1.2-2.1.15. Lleve el volumen hasta 400 μL con H2O estéril (agregue 280 μL) y proceda como se describe en los pasos 2.1.2-2.1.15. Resuspend el pellet final en 20 μL de H2O estéril.
    21. Mida la concentración de ARNm utilizando un espectrofotómetro, asegúrese de que la relación A260:280 sea ~2.0.
    22. Diluir el ARNm a 2,8 μg/μL en H2O estéril y almacenar a -20 °C en alícuotas de 50 μL.
  2. Traducción in vitro
    NOTA: La traducción del ADN deseado debe llevarse a cabo el mismo día del experimento de importación. Este experimento requiere el uso de aminoácidos radiomarcados y, por lo tanto, el usuario debe tener un permiso para el uso de radioisótopos, y todo el manejo y eliminación debe estar de acuerdo con las políticas / requisitos de la institución. Los pasos que involucran medidas de seguridad de radioisótopos se han omitido o descrito brevemente, ya que es probable que difieran según la institución.
    1. Preparar suficiente mezcla de reacción de traducción (Tabla 2) para suministrar ~ 20 μL por muestra de mitocondrias para ser utilizada en el experimento de importación e incluir el mismo volumen para un carril de traducción.
    2. Incubar la reacción durante 30 min a 30 °C (el tiempo puede variar con arnm, 25-60 min).
    3. Registre el uso de 35S-metionina según los requisitos de seguridad radiactiva de la institución y deseche cualquier cosa que haya entrado en contacto con el radioisótopo según las pautas de la institución.
  3. Importación de proteínas
    NOTA: Se requieren mitocondrias recién aisladas para los próximos pasos. Consulte el protocolo de aislamiento mitocondrial. Se pueden utilizar otros métodos de aislamiento siempre que las mitocondrias sean viables y funcionales. Para los pasos posteriores, las muestras mitocondriales utilizadas se resuspenden en un tampón de resuspensión como se describió anteriormente (Cuadro 1). La concentración de proteínas de la muestra mitocondrial también debe medirse antes de comenzar el ensayo de importación.
    1. Aproximadamente 15 min después del inicio de la reacción de traducción, alícuota 90 μg de mitocondrias en tubos estériles de 1,5 ml y preincuba a 30 °C durante ~10 min.
      NOTA: Alícuota más mitocondrias de las que realmente se utilizarán en el experimento; solo se utilizarán realmente 75 μg. Sin embargo, la alícuota en exceso no es un requisito.
    2. En un conjunto fresco de tubos estériles de 1,5 ml, combine 75 μg de mitocondrias con 18 μL de la reacción de traducción e incube a 30 °C durante el tiempo deseado.
    3. Mantenga el volumen restante de la reacción de traducción en hielo; esto se utilizará más adelante.
      NOTA: La importación es un proceso dependiente del tiempo, por lo que puede ser prudente comenzar con un experimento de curso de tiempo que varía en tiempos de incubación de 1 a 60 minutos. Un tiempo de reacción típico es de 30 min.
    4. Durante este tiempo, prepare el cojín de sacarosa combinando 1 g de sacarosa, 200 μL de 2.5 M KCl, 10 μL 1 M MgCl2, 100 μL de 1 M HEPES (pH 7.4), y lleve el volumen a 5 mL usando H2O estéril.
    5. Preparar un nuevo juego de tubos estériles de 1,5 ml correspondientes a cada tubo en la reacción de importación. Alícuota 600 μL del cojín de sacarosa en cada tubo y manténgala en hielo hasta que finalice la reacción de importación.
    6. Para terminar la reacción de importación después del tiempo de incubación apropiado, retire el tubo de 30 °C, colóquelo en hielo y luego transfiera cuidadosamente la reacción de importación en la parte superior del tubo con el cojín de sacarosa.
      NOTA: Este paso debe hacerse muy lentamente para garantizar que las mitocondrias no se dañen / rompan. El cojín de sacarosa ayuda a ralentizar la migración de las mitocondrias y "amortigua" su descenso a la parte inferior del tubo durante la siguiente etapa de centrifugación.
    7. Centrifugar las muestras + cojín de sacarosa a 17.000 x g durante 15 min a 4 °C.
    8. Prepare el tampón de rotura combinando 25 ml de sorbitol de 2,4 M, 2 ml de 1 M de HEPES (pH 7,4) y 72 ml de H2O de doble destilación.
    9. Prepare el tampón de lisis para la electroforesis en gel SDS-PAGE: Combine 50 ml de glicerol calentado, 11,5 g de SDS, 31,25 ml de 1 M Tris (pH 6,8) y lleve el volumen a 500 ml con H2O de doble destilación.
    10. Para la preparación de la muestra, mezcle 475 μL de tampón de lisis con 25 μL de β-mercaptoetanol para ser utilizado en un paso posterior.
      NOTA: El tampón de lisis se puede hacer con anticipación y almacenar a temperatura ambiente; sin embargo, la adición de β-mercaptoetanol debe hacerse fresca.
    11. Usando una pipeta P1000, retire cuidadosamente el sobrenado y no moleste el pellet. Deseche el sobrenado en un contenedor de residuos radiactivos apropiado.
    12. Para la importación a la membrana externa, realice esto usando Tom40, resuspenda el pellet en 50 μL de carbonato de sodio recién preparado 0.1 M (pH 11.5) e incube en hielo durante 30 min.
    13. Después de la incubación, centrifugar la muestra 14.000 x g durante 5 min a 4 °C. Este paso solo se realiza para reacciones de importación de membrana externa.
    14. Para preparar las muestras para la electroforesis SDS-PAGE, agregue 20 μL de tampón de rotura, 20 μL de tampón de lisis y β-mercaptoetanol y resuspend bien. Añadir 5 μL de tinte de muestra.
    15. Prepare el carril de control/traslación combinando 3 μL de la reacción de traslación restante del paso 2.3.3 con 37 μL de tampón de lisis y 5 μL de colorante de muestra. Mezclar bien.
    16. Hervir las muestras durante 5 min a 95 °C y girar suavemente hacia abajo a baja velocidad para evitar la peletización de las mitocondrias.
    17. Aplique las muestras a un gel de poliacrilamida SDS.
      NOTA: El porcentaje de gel y el tiempo de ejecución posterior dependerán de la proteína que se importe. Por ejemplo, la OCT es de 37 kDa, y su banda procesada madura es ligeramente más pequeña; por lo tanto, un gel al 12% permite una buena separación de estas bandas.
    18. Una vez completada la electroforesis, retire el gel y colóquelo en H2O de doble destilación.
    19. Hervir el gel en TCA al 5% en una campana de humos durante 5 minutos, revolviendo / moviendo continuamente el gel para evitar que se agriete.
      NOTA: TCA ayuda a solidificar el gel para la visualización; esto se puede hacer en una bandeja de metal sobre un quemador Bunsen. Use suficiente TCA para cubrir generosamente el gel, ~ 1/2 lleno.
    20. Retire el gel y vuelva a colocarlo en H2O de doble destilación. Agítelo en una placa giratoria durante 1 minuto a ~ 50 rpm.
    21. Lave el gel en 10 mM Tris en una placa giratoria durante 5 min a ~ 50 rpm, nuevamente usando lo suficiente para cubrir generosamente el gel, ~ 1/2 del recipiente.
    22. Precipitar la proteína lavando el gel en 1 M de ácido salicíclico en una placa giratoria durante 30 min, nuevamente usando suficiente ácido salicíclico para cubrir generosamente el gel, ~ 1/2 del recipiente que se está utilizando.
    23. Deshidratar el gel como se describe en los pasos 2.3.24-2.3.31.
      NOTA: Esto se puede hacer de varias maneras. Un secador de gel (consulte la Tabla de materiales) proporciona una opción eficiente en el tiempo (que se describe a continuación); sin embargo, se pueden utilizar otros métodos/kits disponibles comercialmente que pueden ser más rentables pero que requieren más tiempo. Los kits de secado en gel se pueden utilizar como una alternativa que no requiere la aplicación de calor o succión, sino que permite que el gel se seque al aire entre las láminas de celofán para evitar la distorsión.
    24. Coloque una hoja grande de papel secante sobre la cama porosa del secador de gel. Coloque una hoja de toalla de papel en el área donde se aplicará el gel.
    25. Corta un trozo de papel secante de 15 cm x 20 cm y colócalo sobre la toalla de papel.
    26. Saque el gel del recipiente con una segunda pieza de papel secante de 15 cm x 20 cm y colóquelo plano sobre la primera pieza.
    27. Corte un trozo ligeramente más grande de envoltura de plástico, ~ 20 cm x 25 cm, y colóquelo sobre gel, asegurándose de que no haya pliegues o burbujas debajo de la envoltura.
      NOTA: Esto puede tomar algunos intentos, pero es imperativo que no haya bolsas de aire atrapadas.
    28. Coloque suavemente la cubierta de plástico del secador de gel sobre la parte superior de la envoltura, asegurándose nuevamente de que no haya burbujas ni pliegues.
    29. Encienda la bomba/aspiradora y asegúrese de que la cubierta de plástico haya formado un sello. Pruebe el sello levantando una esquina de la cubierta de plástico y espere a que se vuelva a sellar.
    30. Cierre el secador de gel y funcione durante 90 min. Ajuste la temperatura para que comience a 30 ° C, alcance gradualmente los 80 ° C y luego vuelva a 30 ° C al final de la carrera.
    31. Una vez deshidratado, el gel se solidificará y se sentirá delgado como el papel. Envuelva el gel en la envoltura de plástico utilizada en el proceso de secado.
    32. Coloque el gel deshidratado en un cassette de película con una película de fósforo (ver Tabla de Materiales), con el lado blanco mirando hacia el gel. Los tiempos de exposición varían, pero pueden ser de 24-48 h para la visualización de bandas.
    33. Visualice mediante autorradiografía utilizando cualquier generador de imágenes adecuado que sea capaz de obtener imágenes de fósforo.

Resultados

Hemos ilustrado ampliamente que este protocolo es un ensayo válido para determinar la tasa de importación en mitocondrias funcionales e intactas aisladas del músculo esquelético. En comparación con las condiciones no tratadas, la importación de proteínas precursoras típicas como la malato deshidrogenasa (MDH) en la matriz es sensible al potencial de membrana porque puede ser inhibida por la valinomicina, un desacoplador de la cadena respiratoria (Figura 2A). La impor...

Discusión

Las mitocondrias dependen exclusivamente de la expresión y coordinación de los genomas nuclear y mitocondrial para su síntesis y expansión dentro de las células. Sin embargo, el genoma nuclear codifica la gran mayoría (99%) del proteoma mitocondrial, y esto subraya la importancia de la maquinaria de importación de proteínas para apoyar la biogénesis mitocondrial. La importación también sirve como un evento de señalización importante, ya que la falta de importación puede promover el inicio de la respuesta de...

Divulgaciones

Los autores no declaran conflictos de intereses, financieros o de otro tipo.

Agradecimientos

Los autores desean agradecer al Dr. G.C. Shore de la Universidad McGill, al Dr. A. Strauss de la Escuela de Medicina de Washington y al Dr.M.T. Ryan de la Universidad de La Trobe por las donaciones originales de plásmidos de expresión que se utilizaron para esta investigación. Este trabajo fue apoyado por fondos del Consejo de Investigación de Ciencias Naturales e Ingeniería de Canadá (NSERC) a D. A. Hood. D. A. Hood también es titular de una Cátedra de Investigación de Canadá en Fisiología Celular.

Materiales

NameCompanyCatalog NumberComments
0.2% BSASigmaA2153
35S-methioninePerkin ElmerNEG709A500UCPurchase requires a valid radioisotope permit
ATPSigmaA7699
Blotting paper; Whatman 3MM CHR PaperThermo Fisher05-714-5
Cassette for filmKodakKodak Xomatic
Centrifugation TubeThermo Fisher3138-0050
ChloroformThermo FisherC298-4
DTTSigmaD9779-5G
EDTABioShopEDT002
EGTASigmaE4378
Gel DryerBioRadModel 583
Gel Drying KitSigma or BioRadZ377570-1PAK or OW-GDF-10Various options are commercially available through many companies, these are just as few examples.
GlycerolCaledon Laboratory Chemicals5350-1-40
HEPESSigmaH3375
High Speed CentrifugeBeckman CoulterAvanti J-25 Centrifuge
HomogenizerIKAT25 Digital Ultra Turrex
Isoamylalcohol, or 3-methylbutanolSigmaI9392
KAcBioShopPOA301.500
KClSigmaP3911
M7GNew England BiolabS1404SDilute with 1000ul 20mM HEPES to make 1mM stock
MgClBioShopMAG510
MgSO4Thermo FisherM65-500
MOPSBioShopMOP001
NaClBioShopSOD001
NTPThermo FisherR0191
OCT Plasmid--Donated from Dr. G. C. Shore, McGill University, Montreal, Canada; alternative available through Addgene, plasmid #71877
pGEM4Z/hTom40 Plasmid--Donated from Dr. M. T. Ryan, La Trobe University, Melbourne, Australia
pGMDH Plasmid--Donated from Dr. A. Strauss, Washington University School of Medicine
PhenolSigmaP4557
Phenol:Chloroform:IsoamyalcoholSigmaP3803Can also be made with the ratio provided
Phosphorus FilmFujifilmBAS-IP MS 2025
Rabbit reticulocyte lysatePromegaL4960Avoid freeze-thaw; aliquot lysate upon arrival; amino acids are provided in the kit as well
RNAsinPromegaN2311
Rotor for High Speed CentrifugeBeckman CoulterJA-25.50
SDSBioShopSDS001.500Caution: harmful if ingested or inhaled, wear a mask.
Sodium acetateBioshopSAA 304
Sodium CarbonateVWRBDH9284
Sodium salicylateMillipore Sigma106601
SorbitolSigmaS6021
SP6 RNA PolymerasePromegaP1085
SpectrophotometerThermo FisherNanodrop 2000
SpermidineSigmaS-2626
SucroseBioShopSUC507
T7 RNA PolymerasePromegaP2075
Tabletop CentrifugeThermo FisherAccuSpin Micro 17
Trichloroacetic acidThermo FisherA322-500
TrisBioShopTRS001
β-mercaptoethanolSigmaM6250-100ML

Referencias

  1. Kirkwood, S. P., Munn, E. A., Brooks, G. A. Mitochondrial reticulum in limb skeletal muscle. The American Journal of Physiology. 251 (3), 395-402 (1986).
  2. Glancy, B., et al. Power grid protection of the muscle mitochondrial reticulum. Cell Reports. 19 (3), 487-496 (2017).
  3. Vincent, A. E., et al. Quantitative 3D mapping of the human skeletal muscle mitochondrial network. Cell Reports. 26 (4), 996-1009 (2019).
  4. Ogata, T., Yamasaki, Y. Ultra-high-resolution scanning electron microscopy of mitochondria and sarcoplasmic reticulum arrangement in human red, white, and intermediate muscle fibers. Anatomical Record. 248 (2), 214-223 (1997).
  5. Hood, D. A., Tryon, L. D., Carter, H. N., Kim, Y., Chen, C. C. W. Unravelling the mechanisms regulating muscle mitochondrial biogenesis. Biochemical Journal. 473, 2295-2314 (2016).
  6. Perry, C. G. R., Kane, D. A., Lanza, I. R., Neufer, P. D. Methods for assessing mitochondrial function in diabetes. Diabetes. 62, 1032-1036 (2013).
  7. Holloszy, J. O. Biochemical adaptations in muscle. The Journal of Biological Chemistry. 242 (9), 2278-2282 (1967).
  8. Cogswell, A. M., Stevens, R. J., Hood, D. A. Properties of skeletal muscle mitochondria from subsarcolemmal and intermyofibrillar isolated regions. The American Journal of Physiology. 264, 383-389 (1993).
  9. Koves, T. R., Noland, R. C., Bates, A. L., Henes, S. T., Muoio, D. M., Cortright, R. N. Subsarcolemmal and intermyofibrillar mitochondria play distinct roles in regulating skeletal muscle fatty acid metabolism. American Journal of Physiology - Cell Physiology. 288, 1074-1082 (2005).
  10. Bizeau, M. E., Willis, W. T., Hazel, J. R. Differential responses to endurance training in subsarcolemmal and intermyofibrillar mitochondria. Journal of Applied Physiology. 85 (4), 1279-1284 (1998).
  11. Krieger, D. A., Tate, C. A., McMillin-Wood, J., Booth, F. W. Populations of rat skeletal muscle mitochondria after exercise and immobilization. Journal of Applied Physiology: Respiratory, Environmental and Exercise Physiology. 48 (1), 23-28 (1980).
  12. Calvo, S. E., Clauser, K. R., Mootha, V. K. MitoCarta2.0: An updated inventory of mammalian mitochondrial proteins. Nucleic Acids Research. 44 (1), 1251-1257 (2016).
  13. Wiedemann, N., Pfanner, N. Mitochondrial machineries for protein import and assembly. Annual Review of Biochemistry. 86 (1), 685-714 (2017).
  14. Backes, S., Herrmann, J. M. Protein translocation into the intermembrane space and matrix of mitochondria: mechanisms and driving forces. Frontiers in Molecular Biosciences. 4, 83 (2017).
  15. Harbauer, A. B., Zahedi, R. P., Sickmann, A., Pfanner, N., Meisinger, C. The protein import machinery of mitochondria - A regulatory hub in metabolism, stress, and disease. Cell Metabolism. 19 (3), 357-372 (2014).
  16. Jin, S. M., Lazarou, M., Wang, C., Kane, L. A., Narendra, D. P., Youle, R. J. Mitochondrial membrane potential regulates PINK1 import and proteolytic destabilization by PARL. The Journal of Cell Biology. 191 (5), 933-942 (2010).
  17. Matsuda, N., et al. PINK1 stabilized by mitochondrial depolarization recruits Parkin to damaged mitochondria and activates latent Parkin for mitophagy. The Journal of Cell Biology. 189 (2), 211-221 (2010).
  18. Fiorese, C. J., Schulz, A. M., Lin, Y. -. F., Rosin, N., Pellegrino, M. W., Haynes, C. M. The transcription factor ATF5 mediates a mammalian mitochondrial UPR. Current biology. 26 (15), 2037-2043 (2016).
  19. Quiros, P. M., et al. Multi-omics analysis identifies ATF4 as a key regulator of the mitochondrial stress response in mammals. The Journal of Cell Biology. 216 (7), 2027-2045 (2017).
  20. Takahashi, M., Hood, D. A. Protein import into subsarcolemmal and intermyofibrillar skeletal muscle mitochondria. Differential import regulation in distinct subcellular regions. The Journal of Biological Chemistry. 271 (44), 27285-27291 (1996).
  21. Hood, D. A., Memme, J. M., Oliveira, A. N., Triolo, M. Maintenance of skeletal muscle mitochondria in health, exercise, and aging. Annual Review of Physiology. 81, (2019).
  22. Joseph, A., Hood, D. A. Mitochondrion plasticity of TOM complex assembly in skeletal muscle mitochondria in response to chronic contractile activity. Mitochondrion. 12 (2), 305-312 (2012).
  23. Singh, K., Hood, D. A. Effect of denervation-induced muscle disuse on mitochondrial protein import. American Journal of Physiology-Cell Physiology. 300 (1), 138-145 (2011).
  24. Zhang, Y., et al. Altered mitochondrial morphology and defective protein import reveal novel roles for Bax and/or Bak in skeletal muscle. American Journal of Physiology. Cell Physiology. 305 (5), 502-511 (2013).
  25. Lai, N., Kummitha, C., Rosca, M., Fujioka, H., Tandler, B., Hoppel, C. Isolation of mitochondrial subpopulations from skeletal muscle: optimizing recovery and preserving integrity. Acta Physiologica. 25 (2), 13182 (2019).
  26. Nargund, A. M., Pellegrino, M. W., Fiorese, C. J., Baker, B. M., Haynes, C. M. Mitochondrial import efficiency of ATFS-1 regulates mitochondrial UPR activation. Science. 337 (6094), 587-590 (2012).
  27. Picard, M., Taivassalo, T., Gouspillou, G., Hepple, R. T. Mitochondria: Isolation, structure and function. Journal of Physiology. 589 (18), 4413-4421 (2011).
  28. Kras, K. A., Willis, W. T., Barker, N., Czyzyk, T., Langlais, P. R., Katsanos, C. S. Subsarcolemmal mitochondria isolated with the proteolytic enzyme nagarse exhibit greater protein specific activities and functional coupling. Biochemistry and Biophysics Reports. 6, 101-107 (2016).
  29. Sánchez-Duarte, E., et al. Nicorandil affects mitochondrial respiratory chain function by increasing complex III activity and ROS production in skeletal muscle mitochondria. Journal of Membrane Biology. 253 (4), 309-318 (2020).
  30. Iñigo, M. R., et al. Estrogen receptor-α in female skeletal muscle is not required for regulation of muscle insulin sensitivity and mitochondrial regulation. Molecular Metabolism. 34 (2020), 1-15 (2020).
  31. Newsom, S. A., Stierwalt, H. D., Ehrlicher, S. E., Robinson, M. M. Substrate-specific respiration of isolated skeletal muscle mitochondria after 1 h of moderate cycling in sedentary adults. Medicine and Science in Sports and Exercise. 53 (7), 1375-1384 (2021).
  32. Takahashi, M., Chesley, A., Freyssenet, D., Hood, D. A. Contractile activity-induced adaptations in the mitochondrial protein import system. The American Journal of Physiology. 274 (5), 1380-1387 (1998).
  33. Kravic, B., et al. In mammalian skeletal muscle, phosphorylation of TOMM22 by protein kinase CSNK2/CK2 controls mitophagy. Autophagy. 8627, 01-65 (2017).
  34. Opalińska, M., Meisinger, C. Metabolic control via the mitochondrial protein import machinery. Current Opinion in Cell Biology. 33, 42-48 (2015).
  35. Gerbeth, C., et al. Glucose-induced regulation of protein import receptor tom22 by cytosolic and mitochondria-bound kinases. Cell Metabolism. 18 (4), 578-587 (2013).

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