Medição da Capacidade de Importação de Proteínas das Mitocôndrias Musculares Esqueléticas

Resumo

Mitocôndrias são organelas metabólicas chave que exibem um alto nível de plasticidade fenotípica no músculo esquelético. A importação de proteínas do citosol é um caminho crítico para a biogênese organela, essencial para a expansão do ritúlume e a manutenção da função mitocondrial. Portanto, a importação de proteínas serve como um barômetro da saúde celular.

Resumo

Mitocôndrias são organelas metabólicas e regulatórias fundamentais que determinam o fornecimento de energia, bem como a saúde geral da célula. No músculo esquelético, as mitocôndrias existem em uma série de morfologias complexas, que vão desde pequenas organelas ovais até uma rede ampla, semelhante a órticulo. Entender como o reticúrio mitocondrial se expande e se desenvolve em resposta a diversos estímulos, como alterações na demanda de energia, tem sido um tema de pesquisa há muito tempo. Um aspecto fundamental desse crescimento, ou biogênese, é a importação de proteínas precursoras, originalmente codificadas pelo genoma nuclear, sintetizadas no citosol, e translocadas em vários subcompartidários mitocondriais. Mitocôndrias desenvolveram um mecanismo sofisticado para este processo de importação, envolvendo muitos canais seletivos de membrana interna e externa, conhecidos como máquinas de importação de proteínas (PIM). A importação para a mitocôndria depende do potencial viável da membrana e da disponibilidade de ATP derivado de organela através da fosforilação oxidativa. Portanto, sua medição pode servir como medida de saúde organela. O PIM também exibe um alto nível de plasticidade adaptativa no músculo esquelético que é fortemente acoplado ao estado energético da célula. Por exemplo, o treinamento de exercícios tem sido mostrado para aumentar a capacidade de importação, enquanto o desuso muscular reduz,coincidentemente com mudanças nos marcadores de conteúdo mitocondrial. Embora a importação de proteínas seja um passo crítico na biogênese e expansão das mitocôndrias, o processo não é amplamente estudado no músculo esquelético. Assim, este artigo descreve como usar mitocôndrias isoladas e totalmente funcionais do músculo esquelético para medir a capacidade de importação de proteínas, a fim de promover uma maior compreensão dos métodos envolvidos e uma valorização da importância do caminho para a rotatividade de organelas no exercício, saúde e doenças.

Introdução

Mitocôndrias são organelas que existem em morfologias complexas em diferentes tipos celulares e são reconhecidas por possuir uma gama crescente de funções que são fundamentais para a saúde celular. Como tal, eles não podem mais ser reduzidos apenas a organelas produtoras de energia. Mitocôndrias são os principais reguladores metabólicos, determinantes do destino celular e centros de sinalização, das quais as funções podem servir como indicadores úteis da saúde celular geral. Nas células musculares esqueléticas, estudos de microscopia eletrônica revelam a presença de mitocôndrias subsarambimais geograficamente distintas (SS) e intermyofibrilar (FMI), que exibem um grau de conectividade1,2,3,4 que agora é reconhecida como altamente dinâmica e adaptável às mudanças nos níveis de atividade muscular esquelética, bem como com idade e doença. O conteúdo mitocondrial e a função muscular podem ser avaliados de inúmeras ^formas5,6, e métodos tradicionais de isolamento de organela têm sido aplicados para entender melhor as capacidades respiratórias e enzimáticas (Vmax) das mitocôndrias distintas da influência do meio ^celular7,8. Em particular, esses métodos tradicionais revelaram sutis distinções bioquímicas entre mitocôndrias isoladas das regiões subsarcolemmal e intermiofibrilar, desfaçando possíveis implicações funcionais para o metabolismo nessas regiões subcelulares8,9,10,11.

A biogênese das mitocôndrias é única em exigir a contribuição de produtos genéticos do DNA nuclear e mitocondrial. No entanto, a grande maioria deles são derivados do núcleo, uma vez que a transcrição do MTDNA só leva à síntese de 13 proteínas. Uma vez que as mitocôndrias normalmente compreendem >1000 proteínas envolvidas em diversas vias metabólicas, a biogênese da organela requer um meio bem regulado de importação e montagem de proteínas precursoras do citosol nos vários subcompartidores mitocondriais para manter a estequiometria e a função ^{adequadas12,13}. Proteínas codificadas por nuclear destinadas a mitocôndrias normalmente carregam uma sequência de alvo mitocondrial (MTS) que as visa à organela e facilita sua localização subcompartidária. A maioria das proteínas ligadas à matriz contém um MTS terminal N cleavável, enquanto aquelas destinadas à membrana mitocondrial externa ou interna geralmente têm domínios internos ^{de segmentação14}. O processo de importação é realizado por um conjunto de diversos canais que fornecem múltiplas vias para entrada na ^organela13. A translocase do complexo de membrana externa (TOM) transporta precursores do citosol para o espaço intermembrano, onde são reconhecidos pela translocase do complexo de membrana interna (TIM). Este complexo é responsável pela importação de precursores codificados nucleares para a matriz, onde os proteases cortam a preseqüência de alvo do terminal N. As proteínas destinadas à membrana externa podem ser diretamente inseridas nesta membrana através do complexo TOM, enquanto as destinadas à membrana interna são inseridas por uma proteína TIM, especificamente TIM22. Após sua importação, as proteínas são processadas por proteases residentes e acompanhantes e muitas vezes se combinam para formar complexos maiores, como os encontrados na cadeia de transporte de elétrons.

A importação de proteína mitocondrial também serve como uma medida da saúde mitocondrial, pois esse processo conta com a presença de potencial de membrana e uma fonte de energia na forma de ^ATP15. Por exemplo, quando o potencial da membrana é dissipado, a proteína quinase PINK1 não pode ser absorída pela organela, e isso leva a sinais de fosforilação que desencadeiam o início da degradação da organela através de uma via chamada ^{mitofagia16,17}. Em circunstâncias semelhantes, quando a importação é impedida, a proteína ATF5 não pode entrar na organela, e posteriormente se transloca para o núcleo, onde serve como fator de transcrição para a regulação da expressão genética ^UPR18,19. Assim, medir a eficiência de importação de proteínas pode fornecer uma visão abrangente da saúde da organela, enquanto a resposta à expressão genética pode ser usada para indicar o grau de sinalização retrógrada para o núcleo.

Apesar de sua óbvia importância para a biogênese das mitocôndrias e para a saúde celular em geral, a via de importação em mitocôndrias mamíferas é notavelmente subestudada. Neste relatório, descrevemos as etapas específicas envolvidas na medição da importação de proteínas precursoras em mitocôndrias musculares esqueléticas e fornecemos dados para ilustrar a resposta adaptativa do sistema de importação às alterações musculares e desuso, ilustrando a contribuição da importação de proteínas para a plasticidade adaptativa do músculo esquelético.

Protocolo

Todos os animais usados nesses experimentos são mantidos na unidade de cuidados com animais da Universidade de York. Os experimentos são realizados de acordo com as diretrizes do Conselho Canadense de Cuidados com Animais com aprovação do Comitê de Cuidados Com Animais da Universidade de York (Licença: 2017-08).

1. Isolamento funcional das mitocôndrias subsarcolemmal e intermyofibrilar do músculo esquelético

1. Preparação do reagente:
   1. Prepare todos os buffers e mídia mencionados na Tabela 1.
   2. Defina os buffers para pH 7.4 e armazene a 4 °C (até 2 semanas), exceto nagrase protease.
   3. Prepare protease nagarse fresca (Tabela 1) cada vez.
2. Remoção de tecido e picar
   NOTA: Um fluxograma das etapas abaixo para o isolamento das mitocôndrias é fornecido na Figura 1.
   1. Encha um frasco de cintilação de vidro com ~20 mL de Buffer 1 (Tabela 1) e coloque-o no gelo.
   2. Enquanto o camundongo estiver sob anestésico, colhe músculos esqueléticos (tibialis anterior, quadríceps, gastrocnemius etc.), aproximadamente 500-1000 mgs, e coloque os músculos no frasco de cintilação contendo tampão refrigerado 1.
      NOTA: O isoflurane gasoso é usado como anestésico a 2,5% a uma taxa de fluxo de 0,4 L de _O2/min. Um teste de pinça é realizado para garantir que o animal não seja responsivo.
   3. Após a coleta de tecidos, eutanize o animal por deslocamento cervical.
   4. Pré-chill um copo de relógio no gelo. Remova qualquer gordura ou tecido conjuntivo dos músculos e pique o tecido no vidro do relógio até que seja um chorume homogêneo.
   5. Coloque o tecido picado em um tubo de centrifugação de plástico pré-refrigerado de 50 mL (ver Tabela de Materiais) e regise o peso exato.
   6. Diluir o tecido picado 10 vezes com Buffer 1 + ATP (Tabela 1).
   7. Homogeneize a amostra muscular usando um homogeneizador de lâmina dupla de 8 mm (ver Tabela de Materiais) a uma potência de 9,8 Hz para 10 s, garantindo que não restem pedaços visíveis de músculo.
   8. Centrifugar as amostras a 800 x g por 10 minutos usando uma centrífuga de alta velocidade (ver Tabela de Materiais).
      NOTA: O objetivo desta etapa é separar as frações mitocondriais das SS e do FMI. O supernato contém mitocôndrias SS, enquanto a pelota contém mitocôndrias do FMI.
3. Isolamento mitocondrial SS
   1. Filtre o supernato através de uma única camada de pano de queijo em outro conjunto de tubos de centrifugação de plástico de 50 mL para remover quaisquer detritos grandes ou contaminantes.
   2. Centrifugar o supernato a 9.000 x g por 10 min a 4 °C usando uma centrífuga de alta velocidade.
   3. Descarte o supernato e resuspenque a pelota em 3,5 mL de Buffer 1 + ATP.
      NOTA: Resuspend com um P1000 e faça isso com cuidado. Mitocôndrias são organelas frágeis. Execute suavemente e evite tocar na pelota com a ponta da pipeta.
   4. Centrifugar a amostra a 9.000 x g por 10 min a 4 °C usando uma centrífuga de alta velocidade.
   5. Descarte o supernato a menos que um processamento adicional para isolar uma fração citosolítica desprovida de núcleos, mitocôndrias e outras organelas seja desejada. Resuspense a pelota cuidadosamente em aproximadamente 95 μL do meio de ressuspensão (Tabela 1) usando uma pipeta P200.
      NOTA: Semelhante ao passo 1.3.3, evite tocar na pelota com a ponta da pipeta. O volume do meio de resuspensão pode ser alterado dependendo do tamanho da pelota. Esta é a fração mitocondrial da SS, que pode ser armazenada no gelo até que a fração do FMI seja isolada. Se desejar, a fração citosolica, desprovida de organelas, pode ser isolada por centrifugar o supernato a 100.000 x g em uma ultracentrifuagem (ver Tabela de Materiais) e, posteriormente, descartando a pelota.
4. Isolamento mitocondrial do FMI
   1. Diluir a pelota da etapa 1.2.8 por 10 vezes em Buffer 1 + ATP. Resuspend usando um pilão de Teflon misturando suavemente a pelota e tampão juntos até que a amostra seja consistente.
   2. Homogeneize a amostra utilizando um homogeneizador de lâmina dupla de 8 mm (ver Tabela de Materiais) a uma potência de 9,8 Hz para 10 s.
   3. Centrifugar a amostra a 800 x g por 10 min a 4 °C usando uma centrífuga de alta velocidade.
   4. Descarte o supernato e dilua a pelota mitocondrial do FMI 10 vezes usando buffer 2 e resuspend usando o pilão de Teflon misturando suavemente até que seja homogêneo.
   5. Adicione 25 μL/g de tecido a 10 mg/mL nagarse protease (Tabela 1) e coloque o tubo de centrifugação de lado no gelo, misturando suavemente a cada minuto balançando o tubo de um lado para o outro.
      NOTA: A adição de nagarse ajuda a libertar mitocôndrias do FMI realizando digestão limitada dos miofibrils.
   6. Após 5 min, adicione 20 mL de Buffer 2 (Tabela 1) para diluir a protease nagarse ao ponto de inatividade e parar a digestão.
   7. Imediatamente centrifugar a amostra a 5.000 x g por 5 min a 4 °C usando uma centrífuga de alta velocidade.
   8. Descarte o supernato e dilua a pelota 10 vezes usando buffer 2 e resuspend usando um pilão de Teflon misturando suavemente.
   9. Centrifugar a amostra a 800 x g por 15 min a 4 °C para pelotar o material fibroso.
   10. Despeje o supernato em um novo conjunto de tubos de centrífuga de plástico de 50 mL, cuidado para não interromper a pelota, que pode ser descartada.
   11. Centrifugar a amostra a 9.000 x g por 10 min a 4 °C como na etapa 1.4.7.
   12. Descarte o supernato, adicione 3,5 mL de Buffer 2 e resuspenque suavemente a pelota usando uma pipeta P1000.
   13. Centrifugar a amostra a 9.000 x g por 10 min a 4 °C como na etapa 1.4.7.
   14. Descarte o supernato e resuspenque a pelota suavemente com cerca de 180 μL de meio de resuspensão usando uma pipeta P200.
       NOTA: O volume do meio de resuspensão pode ser alterado dependendo do tamanho da pelota. Esta é a fração mitocondrial do FMI, que pode ser armazenada no gelo até que seja usada no ensaio de importação.

2. Importação de proteína mitocondrial

1. In vitro transcrição
   NOTA: Estas etapas subsequentes descrevem como preparar uma proteína radiolabellada para importação. O caminho de importação sob investigação pode ditar a escolha da proteína alvo, por exemplo, para avaliar a importação para a matriz mitocondrial, ornitina carbamyl transferase, OCT, e desidrogenase malate, MDH, são comumente usados, enquanto Tom40 é comumente usado como uma indicação de importação para a membrana mitocondrial externa. Para as etapas seguintes, é necessário codificar o DNA plasmid da proteína escolhida. A transcrição do DNA plasmídeo pode ser feita antes do isolamento mitocondrial em um dia separado, e o mRNA coletado deste experimento pode ser armazenado e usado em experimentos futuros de tradução e importação.
   1. Linearize o DNA: Combine 40 μL de DNA plasmídeo (5 μg/μL), 5 μL de tampão de enzima de 10x e 5 μL de enzima de restrição e incubar a 37 °C por 30 min.
      NOTA: As enzimas de restrição utilizadas podem variar de acordo com o plasmídeo, que pode exigir um tampão de enzima diferente, e o DNA de condições experimentais pode ser usado em qualquer quantidade/volume, pois o modelo pode ser dimensionado para cima ou para baixo.
   2. Purificar e precipitar o DNA linearizado usando fenol e etanol. Realize todas as etapas subsequentes (2.1.3-2.1.15) em tubos estéreis de 1,5 mL e use uma centrífuga de mesa (ver Tabela de Materiais) para as etapas de centrifugação.
   3. Adicione o volume apropriado de _H2O estéril para que o volume final seja igual a 400 μL. Em seguida, adicione 400 μL de fenol.
   4. Misture vigorosamente por inversão para ~10 s, e centrífuga a 17.000 x g por 1 min a 4 °C. Retire e salve a fase superior.
   5. Adicione 400 μL de fenol:clorofórmio:isoamylalcohol (25:24:1, v:v:v).
   6. Misture vigorosamente por inversão para ~10 s, e centrífuga a 17.000 g por 1 min a 4 °C. Retire e salve a fase superior.
   7. Adicione 400 μL de clorofórmio:isoamylalcohol (24:1, v:v).
   8. Misture vigorosamente por inversão para ~10 s, e centrífuga a 17.000 g por 1 min a 4 °C. Retire e salve a fase superior.
   9. Adicione 40 μL de acetato de sódio de 3M (pH 7,0), e adicione 1 mL de 95% de etanol.
   10. Coloque tubos estéreis de 1,5 mL no congelador -80 °C ao seu lado por 15 minutos.
   11. Centrifugar as amostras a 17.000 x g por 10 min a 4 °C.
   12. Descarte o supernato e lave a pelota com 300 μL de 80% de etanol.
   13. Centrifugar as amostras a 17.000 x g por 2 min a 4 °C.
   14. Descarte o supernato e seque a pelota. Uma vez que a pelota está seca, deve estar clara.
   15. Resuspend a pelota em 20 μL de _H2O estéril
   16. Meça a concentração de DNA usando um espect autortômetro (ver Tabela de Materiais) e certifique-se de que a razão _A260:280 esteja acima de 1,8.
   17. Diluir o DNA a uma concentração de 0,8 μg/μL em _H2O estéril.
   18. Transcreva o DNA: Combine plasmid (0,8 μg/μL, 60,8 μL), _H2O estéril (8,4 μL), 10 mM NTP (5,2 μL), ATP de 10 mM (10,0 μL), 1 mM M-7-G (11,6 μL), mistura mencionado etapa 2.1.19 (15.6 μL), RNAsin (5.2 μL) e uma polimerase RNA apropriada (4.8 μL) para formar "uma mistura de reação" (volume total = 121,6 μL) e incubar por 90 min na temperatura ideal para o polímero (37 °C para polímero T7; 40 °C para polimerase SP6)
   19. Para preparar a mistura adicione 200 μL de 1M HEPES (pH 7.9), 100 μL de 1 M _MgAc2, 500 μL de 4 M KAc, 100 μL de 20 mM de espermidina, 100 μL de 0,5 M DTT e 200 μL de _H20 estéril.
       NOTA: A reação pode ser dimensionada para cima ou para baixo em volume, desde que as proporções fornecidas de reagentes sejam mantidas. A polimerase RNA utilizada é ditada pela sequência de promotores bacterianos dentro do plasmídeo que está sendo usado.
   20. Em seguida, purfique e precipitar o mRNA usando fenol e etanol como nas etapas 2.1.2-2.1.1.15. Leve o volume até 400 μL com _H2O estéril (adicione 280 μL) e prossiga conforme descrito nas etapas 2.1.2-2.1.15. Resuspend a última pelota em 20 μL de _H2O estéril.
   21. Meça a concentração de mRNA usando um espectrofotômetro, certifique-se de que a razão _A260:280 seja ~2.0.
   22. Diluir o mRNA para 2,8 μg/μL em _H2O estéril e armazenar a -20 °C em 50 alíquotas de μL.
2. Tradução in vitro
   NOTA: A tradução do DNA desejado deve ser realizada no mesmo dia do experimento de importação. Este experimento requer o uso de aminoácidos radiolabeled e, portanto, o usuário deve ter uma permissão para o uso de radioisótopos, e todo o manuseio e descarte devem estar de acordo com as políticas/requisitos da instituição. As etapas que envolvem medidas de segurança do radioisótopos foram omitidas ou descritas brevemente, pois provavelmente diferem com base na instituição.
   1. Prepare o mix de reação de tradução suficiente (Tabela 2) para fornecer ~20 μL por amostra de mitocôndrias a serem usadas no experimento de importação e inclua o mesmo volume para uma faixa de tradução.
   2. Incubar a reação por 30 min a 30 °C (o tempo pode variar com mRNA, 25-60 min).
   3. Regissite o uso de 35S-methionina de acordo com os requisitos de segurança radioativa da instituição e descarte qualquer coisa que tenha entrado em contato com o radioisótopo de acordo com as diretrizes da instituição.
3. Importação de proteínas
   NOTA: Mitocôndrias recém-isoladas são necessárias para os próximos passos. Consulte o protocolo de isolamento mitocondrial. Outros métodos de isolamento podem ser usados desde que as mitocôndrias sejam viáveis e funcionais. Para as etapas subsequentes, as amostras mitocondriais utilizadas são resuspensadas em um buffer de ressuspensão conforme descrito acima (Tabela 1). A concentração proteica da amostra mitocondrial também deve ser medida antes de iniciar o ensaio de importação.
   1. Cerca de 15 minutos após o início da reação de tradução, alíquota de 90 μg de mitocôndrias em tubos estéreis de 1,5 mL e pré-incubação a 30 °C por ~10 min.
      NOTA: Alíquota mais mitocôndrias do que o que realmente será usado no experimento; apenas 75 μg serão realmente utilizados. No entanto, alíquotar em excesso não é uma exigência.
   2. Em um conjunto fresco de tubos estéreis de 1,5 mL, combine 75 μg de mitocôndrias com 18 μL da reação de tradução e incubar a 30 °C pelo tempo desejado.
   3. Manter o volume restante da reação de tradução no gelo; isso será utilizado mais tarde.
      NOTA: A importação é um processo dependente do tempo, por isso pode ser prudente começar com um experimento de curso de tempo que varia em tempos de incubação de 1 a 60 min. Um tempo típico de reação é de 30 minutos.
   4. Durante este período, prepare a almofada de sacarose combinando 1 g de sacarose, 200 μL de 2,5 M KCl, 10 μL 1 M _MgCl2, 100 μL de 1 M HEPES (pH 7.4), e leve o volume para 5 mL usando _H2O estéril.
   5. Prepare um novo conjunto de tubos estéreis de 1,5 mL correspondentes a cada tubo na reação de importação. Alíquota de 600 μL da almofada de sacarose em cada tubo e mantenha no gelo até que a reação de importação acabe.
   6. Para encerrar a reação de importação após o tempo de incubação adequado, retire o tubo a partir de 30 °C, coloque-o no gelo e, em seguida, transfira cuidadosamente a reação de importação em cima do tubo com a almofada de sacarose.
      NOTA: Esta etapa precisa ser feita muito lentamente para garantir que as mitocôndrias não sejam danificadas/rompidas. A almofada de sacarose ajuda a retardar a migração das mitocôndrias e "almofadas" sua descida para o fundo do tubo durante a etapa de centrifugação subsequente.
   7. Centrifugar as amostras + almofada de sacarose a 17.000 x g por 15 min a 4 °C.
   8. Prepare o tampão de quebra combinando 25 mL de sorbitol de 2,4 M, 2 mL de 1 M HEPES (pH 7.4) e 72 mL de _H2O destilado duplo.
   9. Prepare o tampão de lise para eletroforese de gel SDS-PAGE: Combine 50 mL de glicerol aquecido, 11,5 g de SDS, 31,25 mL de 1 M Tris (pH 6.8) e leve o volume para 500 mL com _H2O destilado duplo.
   10. Para a preparação da amostra, misture 475 μL de tampão de lise com 25 μL de β-mercaptoetanol a ser usado posteriormente.
       NOTA: O tampão de lise pode ser feito com antecedência e armazenado à temperatura ambiente; no entanto, a adição de β-mercaptoetanol deve ser feita de novo.
   11. Usando uma pipeta P1000, remova cuidadosamente o supernato e não perturbe a pelota. Descarte o supernato em um recipiente de resíduos radioativos apropriado.
   12. Para importação para a membrana externa, realize isso usando Tom40, resuspenque a pelota em 50 μL de carbonato de sódio recém-preparado (pH 11,5) e incubar no gelo por 30 minutos.
   13. Após a incubação, centrifugar a amostra 14.000 x g por 5 min a 4 °C. Esta etapa só é feita para reações de importação de membrana externa.
   14. Para preparar as amostras para eletroforese SDS-PAGE, adicione 20 μL de tampão de quebra, 20 μL de tampão de lise e β-mercaptoetanol e resuspense bem. Adicione 5 μL de corante de amostra.
   15. Prepare a faixa de controle/tradução combinando 3 μL da reação de tradução restante da etapa 2.3.3 com 37 μL de tampão de lise e 5 μL de corante amostral. Misture bem.
   16. Ferva as amostras por 5 min a 95 °C e gire suavemente a uma velocidade baixa para evitar a dotria.
   17. Aplique as amostras em um gel de poliacrilamida SDS.
       NOTA: A porcentagem de gel e o tempo de execução subsequente dependerão de qual proteína está sendo importada. Por exemplo, OCT é de 37 kDa, e sua banda processada madura é ligeiramente menor; portanto, um gel de 12% permite uma boa separação dessas bandas.
   18. Quando a eletroforese estiver completa, remova o gel e coloque-o em _H2O destilado duplo.
   19. Ferva o gel em 5% TCA em um capô de fumaça por 5 minutos, mexendo continuamente/movendo o gel para evitar rachaduras.
       NOTA: O TCA ajuda a solidificar o gel para visualização; isso pode ser feito em uma bandeja de metal sobre um queimador Bunsen. Use TCA suficiente para cobrir generosamente o gel, ~1/2 cheio.
   20. Retire o gel e coloque-o de volta em _H2O destilado duplo. Agitar-o em uma placa giratória por 1 min a ~50 rpm.
   21. Lave o gel em 10 mM Tris em uma placa rotativa por 5 min a ~50 rpm, novamente usando o suficiente para cobrir generosamente o gel, ~1/2 do recipiente.
   22. Precipitar a proteína lavando o gel em ácido salicíclico de 1 M em uma placa rotativa por 30 min, novamente usando ácido salicíclico suficiente para cobrir generosamente o gel, ~1/2 do recipiente que está sendo usado.
   23. Desidratar o gel conforme descrito nas etapas 2.3.24-2.3.31.
       NOTA: Isso pode ser feito de várias maneiras. Um secador de gel (ver Tabela de Materiais) oferece uma opção de tempo eficiente (descrita abaixo); no entanto, outros métodos/kits disponíveis comercialmente podem ser usados que podem ser mais econômicos, mas mais demorados. Os kits de secagem de gel podem ser utilizados como uma alternativa que não requer a aplicação de calor ou sucção, mas permite que o gel seque entre as folhas de celofane para evitar distorções.
   24. Coloque uma grande folha de papel manchado na cama porosa do secador de gel. Coloque uma folha de papel toalha na área onde o gel será aplicado.
   25. Corte um pedaço de papel de 15 cm x 20 cm de papel manchado e coloque-o sobre a toalha de papel.
   26. Retire o gel do recipiente usando um segundo pedaço de papel de 15 cm x 20 cm e coloque-o em cima da primeira peça.
   27. Corte um pedaço um pouco maior de plástico, ~20 cm x 25 cm, e coloque-o em gel, garantindo que não haja vincos ou bolhas sob o envoltório.
       NOTA: Isso pode levar algumas tentativas, mas é imperativo que não haja bolsões de ar presos.
   28. Deite suavemente a tampa plástica do secador de gel por cima do envoltório, garantindo novamente que não haja bolhas ou vincos.
   29. Ligue a bomba/o vácuo e certifique-se de que a tampa plástica tenha formado uma vedação. Teste o selo levantando um canto da tampa plástica e espere que ele sela.
   30. Feche a secadora de gel e corra por 90 min. Coloque a temperatura para começar em 30 °C, atinja gradualmente 80 °C e volte para 30 °C no final da corrida.
   31. Uma vez desidratado, o gel se solidificará e sentirá papel fino. Enrole o gel no plástico usado no processo de secagem.
   32. Coloque o gel desidratado em uma fita de filme com um filme de fósforo (ver Tabela de Materiais), com o lado branco voltado para o gel. Os tempos de exposição variam, mas podem ser de 24 a 48 h para visualização de bandas.
   33. Visualize usando autoradiografia usando qualquer imager adequado capaz de imagens de fósforo.

Resultados

Ilustramos extensivamente que este protocolo é um ensaio válido para determinar a taxa de importação em mitocôndrias musculares esqueléticas funcionais e intactas. Em comparação com as condições não tratadas, a importação de proteínas precursoras típicas como o malate desidrogenase (MDH) para a matriz é sensível ao potencial da membrana porque pode ser inibida pela valinomicina, um desacoplador da cadeia respiratória (Figura 2A). A importação também é i...

Discussão

Mitocôndrias são exclusivamente dependentes da expressão e coordenação dos genomas nuclear e mitocondrial para sua síntese e expansão dentro das células. No entanto, o genoma nuclear codifica a grande maioria (99%) do proteome mitocondrial, e isso ressalta a importância do maquinário de importação de proteínas no suporte à biogênese mitocondrial. A importação também serve como um importante evento de sinalização, pois a falta de importação pode promover o início da resposta proteica desdobrada e/ou...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.2% BSA	Sigma	A2153
35S-methionine	Perkin Elmer	NEG709A500UC	Purchase requires a valid radioisotope permit
ATP	Sigma	A7699
Blotting paper; Whatman 3MM CHR Paper	Thermo Fisher	05-714-5
Cassette for film	Kodak	Kodak Xomatic
Centrifugation Tube	Thermo Fisher	3138-0050
Chloroform	Thermo Fisher	C298-4
DTT	Sigma	D9779-5G
EDTA	BioShop	EDT002
EGTA	Sigma	E4378
Gel Dryer	BioRad	Model 583
Gel Drying Kit	Sigma or BioRad	Z377570-1PAK or OW-GDF-10	Various options are commercially available through many companies, these are just as few examples.
Glycerol	Caledon Laboratory Chemicals	5350-1-40
HEPES	Sigma	H3375
High Speed Centrifuge	Beckman Coulter	Avanti J-25 Centrifuge
Homogenizer	IKA	T25 Digital Ultra Turrex
Isoamylalcohol, or 3-methylbutanol	Sigma	I9392
KAc	BioShop	POA301.500
KCl	Sigma	P3911
M7G	New England Biolab	S1404S	Dilute with 1000ul 20mM HEPES to make 1mM stock
MgCl	BioShop	MAG510
MgSO4	Thermo Fisher	M65-500
MOPS	BioShop	MOP001
NaCl	BioShop	SOD001
NTP	Thermo Fisher	R0191
OCT Plasmid	-	-	Donated from Dr. G. C. Shore, McGill University, Montreal, Canada; alternative available through Addgene, plasmid #71877
pGEM4Z/hTom40 Plasmid	-	-	Donated from Dr. M. T. Ryan, La Trobe University, Melbourne, Australia
pGMDH Plasmid	-	-	Donated from Dr. A. Strauss, Washington University School of Medicine
Phenol	Sigma	P4557
Phenol:Chloroform:Isoamyalcohol	Sigma	P3803	Can also be made with the ratio provided
Phosphorus Film	Fujifilm	BAS-IP MS 2025
Rabbit reticulocyte lysate	Promega	L4960	Avoid freeze-thaw; aliquot lysate upon arrival; amino acids are provided in the kit as well
RNAsin	Promega	N2311
Rotor for High Speed Centrifuge	Beckman Coulter	JA-25.50
SDS	BioShop	SDS001.500	Caution: harmful if ingested or inhaled, wear a mask.
Sodium acetate	Bioshop	SAA 304
Sodium Carbonate	VWR	BDH9284
Sodium salicylate	Millipore Sigma	106601
Sorbitol	Sigma	S6021
SP6 RNA Polymerase	Promega	P1085
Spectrophotometer	Thermo Fisher	Nanodrop 2000
Spermidine	Sigma	S-2626
Sucrose	BioShop	SUC507
T7 RNA Polymerase	Promega	P2075
Tabletop Centrifuge	Thermo Fisher	AccuSpin Micro 17
Trichloroacetic acid	Thermo Fisher	A322-500
Tris	BioShop	TRS001
β-mercaptoethanol	Sigma	M6250-100ML