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요약

미토콘드리아는 골격 근육에서 높은 수준의 페노티픽 가소성을 나타내는 주요 대사 세포기관입니다. 사이토솔에서 단백질의 수입은 세포기관 생물 발생을 위한 중요한 통로입니다, 망상의 확장 및 미토콘드리아 기능의 유지에 필수적입니다. 따라서, 단백질 수입은 세포 건강의 기압계 역할을 한다.

초록

미토콘드리아는 에너지 공급뿐만 아니라 세포의 전반적인 건강을 결정하는 주요 대사 및 조절 세포기관입니다. 골격 근육에서 미토콘드리아는 작은 타원형 세포기관에서 부터 광범위하고 망상과 같은 네트워크에 이르기까지 일련의 복잡한 형태에 존재합니다. 미토콘드리아 망상이 에너지 수요의 변경과 같은 다양한 자극에 대응하여 어떻게 확장되고 발전하는지 이해하는 것은 오랫동안 연구의 주제였습니다. 이러한 성장 또는 생물 발생의 주요 측면은 원래 핵 게놈에 의해 인코딩되고, 사이토솔에서 합성되고, 다양한 미토콘드리아 하위 구획으로 전이되는 전구체 단백질의 수입이다. 미토콘드리아는 단백질 수입 기계(PIM)로 알려진 많은 선택적 내측 및 외부 멤브레인 채널을 포함하는 이러한 수입 공정을 위한 정교한 메커니즘을 개발했습니다. 미토콘드리온으로 수입하는 것은 산화 인산화를 통해 세포기관에서 파생된 ATP의 가용성과 실행 가능한 멤브레인 잠재력및 가용성에 달려 있습니다. 따라서 그 측정은 세포구 건강의 척도로 작용할 수 있습니다. PIM은 또한 세포의 에너지 상태에 단단히 결합되는 골격 근육에 적응가성의 높은 수준을 전시한다. 예를 들어, 운동 훈련은 수입 용량을 증가시키는 것으로 나타났으며, 근육 사용은 미토콘드리아 함량의 마커의 변화와 일치하여 이를 감소시킵니다. 단백질 수입은 미토콘드리아의 생물 발생 및 확장에 있는 중요한 단계이지만, 프로세스는 골격 근육에서 널리 공부되지 않습니다. 따라서, 이 논문은 운동, 건강 및 질병에 있는 세포기관 회전율에 대한 통로의 중요성을 더 잘 이해하고 관련시키는 방법을 촉진하기 위하여 단백질 수입 용량을 측정하기 위하여 골격 근육에서 고립되고 완전하게 기능하는 미토콘드리아를 사용하는 방법을 설명합니다.

서문

미토콘드리아는 다른 세포 모형에 있는 복잡한 형태학에 존재하는 세포기관이고 세포 건강에 중요한 기능의 증가 배열을 가지고 있는 것을 인식됩니다. 따라서, 그들은 더 이상 단지 에너지 생산 세포기관에 휘청해질 수 없습니다. 미토콘드리아는 주요 신진 대사 조절제, 세포 운명의 결정요인 및 신호 허브이며, 그 기능은 전반적인 세포 건강의 유용한 지표로 작용할 수 있습니다. 골격 근육 세포에서 전자 현미경 연구는 지리적으로 구별되는 subsarcolemmal (SS) 및 intermyofibrillar (IMF) 미토콘드리아의 존재를 밝혀, 이는 연결의 정도를 나타내는 1,2,3,4 이는 지금 매우 역동적이고 변화 골격 근육 활동 수준에 적응할 수 있음을 인식, 뿐만 아니라 나이와 질병. 미토콘드리아 함량과 근육의 기능은 여러 가지 방법으로 평가될 수 있으며, 세포기질의 영향과 구별되는 미토콘드리아의 호흡기 및 효소 용량(Vmax)을 더 잘 이해하기 위해 기존의 세포 간 절연 방법이 적용되었다. 특히, 이러한 전통적인 방법은 서브사콜렘말과 인터미오피릴라 부위로부터 분리된 미토콘드리아 사이의 미묘한 생화학적 구별을 밝혀왔으며, 이러한 세포외 지역에서 대사에 대한 가능한 기능적 의미를 갖는다8,9,10,11.

미토콘드리아의 생물 발생은 핵과 미토콘드리아 DNA 모두에서 유전자 제품의 기여를 요구하는 데 독특합니다. 그러나, 이들 중 대다수는 mtDNA 전사가 13개의 단백질의 합성으로 만 이어지기 때문에 핵으로부터 유래된다. 미토콘드리아는 일반적으로 다양한 대사 경로에 관여하는 >1000단백질을 포함하기 때문에, 세포기관의 생체발생은 시토솔에서 전구체 단백질의 수입 및 조립을 엄격하게 조절하여 적절한 스토이치오메트리및 기능을 유지하기 위해 다양한 미토콘드리아 하위 구획으로 한다. 미토콘드리아로 향하는 핵으로 구분된 단백질은 일반적으로 세포기관을 대상으로 하는 미토콘드리아 표적 시퀀스(MTS)를 운반하고 하위 구획 국소화를 용이하게 합니다. 대부분의 매트릭스 결합 단백질은 경화 N 단자 MTS를 포함하고, 그 외또는 내부 미토콘드리아 막을 위해 향하는 사람들은 일반적으로 내부 표적 도메인14가 있는 동안. 수입 프로세스는 organelle13에 진입하기 위한 여러 경로를 제공하는 다양한 채널 집합에 의해 수행됩니다. 외부 멤브레인(TOM)의 연막은 사이토솔에서 막 간 공간으로 전구체를 선구체로 이동하여 내부 멤브레인(TIM) 복합체의 트랜스로케이스에 의해 인식된다. 이 단지는 핵으로 인코딩된 전구체를 매트릭스로 수입하여 N 단말 타겟팅 프리시퀀스를 절단하는 작업을 담당합니다. 외부 막을 향한 단백질은 TOM 복합체를 통해 이 막에 직접 삽입될 수 있으며, 내부 막으로 향하는 단백질은 TIM 단백질, 특히 TIM22에 의해 삽입됩니다. 그들의 수입에 따라, 단백질은 상주 proteases 및 chaperones에 의해 추가 처리되고 수시로 전자 수송 사슬에서 찾아낸 것과 같은 더 큰 복합체를 형성하기 위하여 결합합니다.

미토콘드리아 단백질 수입 자체는 또한 미토콘드리아 건강의 측정 역할을 하며, 이 과정은 ATP15 의 형태로 막 잠재력과 에너지원의 존재에 의존하기 때문이다. 예를 들어, 막 전위가 소멸되면, 단백질 키나아제 PINK1은 세포기관에 의해 채택될 수 없으며, 이는 미토파기16,17이라는 경로를 통해 세포기관의 분해의 개시를 유발하는 인산화 신호로 이어집니다. 유사한 상황에서, 수입이 방해될 때, 단백질 ATF5는 세포기관을 입력할 수 없고, 이어서 UPR 유전자 발현의 업 조절을 위한 전사 인자 역할을 하는 핵으로 전염된다18,19. 따라서, 단백질 수입 효율을 측정하는 것은 세포기관의 건강에 대한 포괄적인 통찰력을 제공할 수 있으며, 유전자 발현 반응은 핵에 대한 역행 신호의 정도를 나타내는 데 사용될 수 있다.

미토콘드리아의 생물 발생과 일반적으로 세포 건강에 대한 명백한 중요성에도 불구하고, 포유류 미토콘드리아의 수입 경로는 현저하게 과소 연구. 본 보고서에서는 전구체 단백질의 수입을 골격 근육 미토콘드리아로 측정하는 데 관련된 구체적인 단계를 설명하고 근육 및 사용의 변화에 대한 수입 시스템의 적응 반응을 설명하기 위한 데이터를 제공하여 골격 근육의 적응가성에 대한 단백질 수입의 기여를 보여줍니다.

프로토콜

이 실험에 사용된 모든 동물은 요크 대학의 동물 보호 시설에서 유지됩니다. 실험은 요크 대학 동물 관리 위원회의 승인을 받아 캐나다 동물 관리 위원회 지침에 따라 수행됩니다 (허가: 2017-08).

1. 골격 근육에서 서브사콜렘말과 내미오피릴라 미토콘드리아의 기능적 격리

  1. 시약 준비:
    1. 표 1에 언급된 모든 버퍼와 미디어를 준비합니다.
    2. 버퍼를 pH 7.4로 설정하고 나그라제 프로테아제(nagrase protease)를 제외한 4°C(최대 2주)에 저장합니다.
    3. 매번 신선한 나구프로테아제(표 1)를 준비합니다.
  2. 조직 제거 및 다진
    참고: 미토콘드리아의 격리를 위한 아래 단계의 순서도가 도 1에 제공됩니다.
    1. 완충 1 (표 1)의 ~ 20 mL유리 병기를 채우고 얼음 위에 놓습니다.
    2. 마우스가 마취 하에 있는 동안, 골격 근 (티비알리스 전방, 사두근, 위장 혈증 등), 약 500-1000 mg을 수확하고, 차가운 버퍼 1을 포함하는 신경병 바이알에 근육을 놓습니다.
      참고: 기체 이소플루란은 O2/min의 0.4L의 유량으로 2.5%의 마취제로 사용됩니다. 핀치 테스트는 동물이 반응하지 않도록 하기 위해 수행됩니다.
    3. 조직 수집 에 따라 자궁 경부 탈구를 통해 동물을 안락사시하십시오.
    4. 얼음 위에 시계 유리를 미리 식힙니다. 근육에서 지방 또는 결합 조직을 제거하고 균일 한 슬러리가 될 때까지 시계 유리에 조직을 다진.
    5. 다진 조직을 미리 냉각된 50mL 플라스틱 원심분리 튜브에 놓고 정확한 무게를 기록합니다( 재료표 참조).
    6. 버퍼 1 + ATP (표 1)로 다진 조직을 10 배 희석시 희석시.
    7. 10s에 대한 9.8Hz의 출력에서 8mm 트윈 블레이드 균질화( 재료 표 참조)를 사용하여 근육 샘플을 균질화하여 눈에 띄는 근육 덩어리가 남지 않도록 합니다.
    8. 시료를 800 x g 에서 10분 동안 고속 원심분리기를 사용하여 원심분리합니다( 재료 표 참조).
      참고: 이 단계의 목적은 SS 및 IMF 미토콘드리아 분획을 분리하는 것입니다. 상판은 SS 미토콘드리아를 포함하고, 펠릿에는 IMF 미토콘드리아가 포함되어 있습니다.
  3. SS 미토콘드리아 절연
    1. 치즈천 의 단일 층을 통해 슈퍼네이트를 50mL 플라스틱 원심분리 튜브의 또 다른 세트로 필터링하여 큰 파편이나 오염 물질을 제거합니다.
    2. 원심분리기는 고속 원심분리기를 사용하여 4°C에서 10분 동안 9,000 x g 에서 슈퍼네이트를 원심분리합니다.
    3. 슈퍼네이트를 버리고 버퍼 1 + ATP의 3.5 mL에서 펠릿을 다시 놓습니다.
      참고: P1000으로 다시 중단하고 신중하게 수행하십시오. 미토콘드리아는 연약한 세포기관입니다. 부드럽게 수행하고 파이펫 팁으로 펠릿을 만지지 마십시오.
    4. 원심분리기는 고속 원심분리기를 사용하여 4°C에서 10분 동안 9,000 x g 의 샘플을 원심분리합니다.
    5. 핵, 미토콘드리아 및 기타 세포기관이 없는 세포균 분획을 분리하기 위한 추가 처리가 필요하지 않는 한 초공을 버리십시오. P200 파이펫을 사용하여 재서스펜션 배지(표 1)의 약 95μL에서 펠릿을 조심스럽게 재연한다.
      참고: 1.3.3 단계와 유사하게 파이펫 팁으로 펠릿을 만지지 마십시오. 재서스펜션 배지의 부피는 펠릿의 크기에 따라 변경될 수 있다. 이것은 IMF 분획이 고립될 때까지 얼음에 저장할 수 있는 SS 미토콘드리아 분획입니다. 원하는 경우, 세포기관이 없는 세포성 분획은 초원심분리기(재료표 참조)에서 100,000 x g의 초탄을 원심분리하고 그 후에 펠릿을 폐기함으로써 격리될 수 있다.
  4. IMF 미토콘드리아 격리
    1. 버퍼 1 + ATP에서 1.2.8 단계에서 10 배씩 펠릿을 희석하십시오. 테플론 페슬을 사용하여 펠릿을 부드럽게 혼합하여 다시 중단하고 샘플이 일관될 때까지 함께 버퍼링합니다.
    2. 10s용 9.8Hz의 출력에서 8mm 트윈 블레이드 균질화제( 재료 표 참조)를 사용하여 샘플을 균질화합니다.
    3. 원심분리기는 고속 원심분리기를 사용하여 4°C에서 10분 동안 800 x g 의 샘플을 원심분리합니다.
    4. 초탄을 버리고 완충 2를 사용하여 IMF 미토콘드리아 펠릿을 10배 희석하고 균일해질 때까지 부드럽게 혼합하여 테플론 페슬을 사용하여 재연한다.
    5. 10 mg / mL nagarse protease (표 1)에 조직의 25 μL / g을 추가하고 얼음에 원심 분리 튜브를 배치, 부드럽게 튜브 측면을 좌우로 흔들어 매 순간을 혼합.
      참고: 나구스의 첨가는 미오피릴의 제한된 소화를 수행하여 IMF 미토콘드리아를 해방시키는 데 도움이 됩니다.
    6. 5 분 후, 버퍼 2 (표 1)의 20mL을 추가하여 나구 프로테아를 비활성 지점으로 희석시키고 소화를 중지합니다.
    7. 고속 원심분리기를 사용하여 4°C에서 5분 동안 5,000 x g 의 샘플을 즉시 원심분리합니다.
    8. 슈퍼네이트를 버리고 버퍼 2를 사용하여 펠릿을 10 배 희석하고 부드럽게 혼합하여 테플론 페슬을 사용하여 다시 중단하십시오.
    9. 원심분리기는 4°C에서 15분 동안 800 x g 에서 섬유질 물질을 펠렛합니다.
    10. 50mL 플라스틱 원심분리기 튜브의 새로운 세트에 슈퍼네이트를 붓고, 폐기 할 수있는 펠릿을 방해하지 않도록주의하십시오.
    11. 원심분리기는 1.4.7단계와 같이 4°C에서 10분 동안 9,000 x g 에서 샘플을 원심분리한다.
    12. 슈퍼네이트를 버리고 버퍼 2의 3.5 mL을 추가하고 P1000 파이펫을 사용하여 펠릿을 부드럽게 다시 놓습니다.
    13. 원심분리기는 1.4.7단계와 같이 4°C에서 10분 동안 9,000 x g 에서 샘플을 원심분리한다.
    14. P200 파이펫을 사용하여 약 180 μL의 재서스펜션 배지로 슈퍼네이트를 버리고 펠릿을 부드럽게 재개봉하십시오.
      참고: 재서스펜션 배지의 부피는 펠릿의 크기에 따라 변경될 수 있습니다. 이것은 수입 분석에서 사용될 때까지 얼음에 저장할 수있는 IMF 미토콘드리아 분획입니다.

2. 미토콘드리아 단백질 수입

  1. In vitro 전사
    참고: 이러한 후속 단계는 수입에 대한 방사성 라벨단백질을 준비하는 방법을 간략하게 설명합니다. 조사 중인 수입 경로는 표적 단백질의 선택을 지시할 수 있으며, 예를 들어 미토콘드리아 매트릭스, ornithine 카르바말 트랜스퍼라제, OCT 및 malate 탈수소효소, MDH, 일반적으로 사용되는 반면, Tom40은 일반적으로 외부 미토콘드리아 막으로 의 수입의 표시로서 사용된다. 다음 단계에 대해, 플라스미드 DNA가 선택한 단백질을 인코딩하는 것이 요구된다. 플라스미드 DNA의 전사는 별도의 날에 미토콘드리아 절연 전에 수행될 수 있으며, 이 실험에서 수집된 mRNA는 향후 번역 및 수입 실험에서 저장 및 사용될 수 있다.
    1. DNA선형화: 플라스미드 DNA 40μL(5μg/μL), 10x 효소 완충제 5μL, 제한 효소 5μL을 30분 동안 37°C에서 배양한다.
      참고: 활용된 제한 효소는 플라스미드에 따라 달라질 수 있으며, 이는 다른 효소 완충액을 필요로 할 수 있으며, DNA는 템플릿을 축소하거나 축소할 수 있으므로 임의의 양/부피에서 DNA를 사용할 수 있다.
    2. 페놀과 에탄올을 사용하여 선형화된 DNA를 정화하고 침전시합니다. 멸균 1.5mL 튜브에서 모든 후속 단계(2.1.3-2.1.15)를 수행하고 원심 분리 단계에 대한 탁상 원심분리기( 재료 표 참조)를 사용합니다.
    3. 최종 부피가 400 μL과 같도록 적절한 멸균 H2O 를 추가합니다. 그런 다음 페놀 400 μL을 추가합니다.
    4. ~10초, 원심분리기는 4°C에서 1분 동안 17,000 x g 에서 반전하여 격렬하게 섞는다. 위단계를 철회하고 저장합니다.
    5. 페놀:클로로폼:이소아닐알코올400 μL 추가(25:24:1, v:v).
    6. ~10초, 원심분리기는 4°C에서 1분 동안 17,000g에서 반전하여 격렬하게 섞는다. 위단계를 철회하고 저장합니다.
    7. 클로로폼 400 μL 추가: 이소아닐 알코올 (24:1, v:v).
    8. ~10초, 원심분리기는 4°C에서 1분 동안 17,000g에서 반전하여 격렬하게 섞는다. 위단계를 철회하고 저장합니다.
    9. 3M 아세테이트 나트륨 40 μL(pH 7.0)을 추가하고 95% 에탄올1mL을 추가합니다.
    10. 멸균 1.5mL 튜브를 -80°C 냉동고에 15분 간 배치합니다.
    11. 4°C에서 10분 동안 17,000 x g 의 샘플을 원심분리합니다.
    12. 슈퍼네이트를 버리고 80 %의 에탄올의 300 μL로 펠릿을 씻으십시오.
    13. 4°C에서 2분 동안 17,000 x g 의 샘플을 원심분리합니다.
    14. 펠릿을 대체하고 공기 건조하십시오. 펠릿이 건조되면 분명해야합니다.
    15. 멸균 H2O의 20 μL에서 펠릿을 다시 일시 중지
    16. 분광계를 사용하여 DNA 농도를 측정하고( 재료표 참조) A260:280 비율이 1.8을 초과하는지 확인합니다.
    17. 멸균 H2O에서 DNA를 0.8 μg/μL 농도로 희석시.
    18. DNA 전사: 플라스미드(0.8 μg/μL, 60.8 μL), 멸균 H2O(8.4 μL), 10mM NTP(5.2 μL), 10mM ATP(10.0 μL), 1mM M-7-G(11.6μL), 혼합2단계.1.19 (15.6 μL), RNA 폴리머라제(5.2 μL) 및 적절한 RNA 폴리머라제(4.8 μL)를 형성하여 "1개의 반응 혼합"(총 부피 = 121.6 μL) 및 중합체(T7 폴리머라제의 경우 37°C)에 대한 최적 온도에서 90분 동안 배양한다. SP6 폴리머라제용 40°C)
    19. 믹스를 준비하려면 1M HEPES (pH 7.9), 1 M MgAc2의 100 μL, 4 M KAc의 500 μL, 20 mM spermidine의 100 μL, 0.5 M DTT의 100 μL 및 멸균 H20의 200 μL을 추가합니다.
      참고: 제공된 시약 비율이 유지되는 한 반응은 볼륨으로 확장되거나 축소될 수 있습니다. 사용되는 RNA 폴리머라제는 사용되는 플라스미드 내의 세균 프로모터 서열에 의해 결정된다.
    20. 이어서, 단계 2.1.2-2.1.15에서와 같이 페놀및 에탄올을 사용하여 mRNA를 정화하고 침전한다. 멸균 H2O (280 μL 추가)로 최대 400 μL의 부피를 가져와 2.1.2-2.1.15 단계에 설명된 대로 진행하십시오. 멸균 H2O의 20 μL에서 최종 펠릿을 다시 중단합니다.
    21. 분광계를 사용하여 mRNA의 농도를 측정하고 A260:280 비율이 ~2.0인지 확인합니다.
    22. 멸균 H2O에서 mRNA를 2.8 μg/μL로 희석하고 50 μL 알리쿼트에 -20°C로 저장합니다.
  2. 시험관 내 번역
    참고: 원하는 DNA의 번역은 가져오기 실험당일에 수행되어야 합니다. 이 실험은 방사성 표지 아미노산의 사용을 필요로하고, 따라서 사용자는 방사성 동위원소의 사용에 대한 허가가 있어야하며, 모든 처리 및 폐기는 기관의 정책 / 요구 사항에 따라해야합니다. 방사성 동위원소 안전 대책과 관련된 단계는 기관에 따라 다를 가능성이 있기 때문에 생략되거나 짧게 설명되었습니다.
    1. 수입 실험에 사용될 미토콘드리아 샘플당 ~20 μL을 공급하고 번역 차선에 대해 동일한 부피를 포함하도록 충분한 번역 반응 믹스(표 2)를 준비한다.
    2. 30°C에서 30분 동안 의 반응을 배양한다(시간은 mRNA, 25-60분과 다를 수 있음).
    3. 기관의 방사성 안전 요구 사항에 따라 35S-메티오닌 사용을 기록하고 기관의 지침에 따라 방사성 동위원소와 접촉한 모든 것을 폐기하십시오.
  3. 단백질 수입
    참고: 다음 단계에는 갓 분리된 미토콘드리아가 필요합니다. 미토콘드리아 격리 프로토콜을 참조하십시오. 미토콘드리아가 실행 가능하고 기능적이면 다른 절연 방법을 사용할 수 있습니다. 후속 단계의 경우, 활용된 미토콘드리아 샘플은 상술한 바와 같이 재서스펜션 버퍼에서 재중단된다(표 1). 미토콘드리아 샘플의 단백질 농도는 또한 수입 분석기를 시작하기 전에 측정되어야 한다.
    1. 번역 반응의 시작 후 약 15 분, 알리쿼트 90 미토콘드리아의 μg멸 1.5 mL 튜브로 및 사전 인큐베이터 30 °C에서 ~10 분.
      참고: 실제로 실험에 사용될 것보다 더 많은 미토콘드리아를 알리쿼트; 75 μg만 실제로 사용됩니다. 그러나, 과잉 알리쿼팅은 요구 사항이 아닙니다.
    2. 멸균 1.5mL 튜브의 신선한 세트에서, 번역 반응의 18 μL과 미토콘드리아의 75 μg를 결합하고 원하는 시간 동안 30 °C에서 배양.
    3. 얼음에 번역 반응의 나머지 볼륨을 유지; 이것은 나중에 활용될 것입니다.
      참고: 가져오기는 시간에 따라 달라지는 프로세스이므로 1-60분부터 인큐베이션 시간에 이르는 시간 과정 실험으로 시작하는 것이 신중할 수 있습니다. 일반적인 반응 시간은 30 분입니다.
    4. 이 기간 동안, 자당 1g, 2.5M KCl의 200 μL, 10 μL 1 M MgCl2, 1M HEPES(pH 7.4)의 100 μL을 결합하여 자당 쿠션을 준비하고 멸균 H2O를 사용하여 5mL로 부피를 가져옵니다.
    5. 수입 반응에서 각 튜브에 대응하는 새로운 멸균 1.5 mL 튜브 세트를 준비합니다. 각 튜브에 자당 쿠션의 알리쿼트 600 μL과 수입 반응이 끝날 때까지 얼음을 유지합니다.
    6. 적절한 인큐베이션 시간 후에 수입 반응을 종료하려면 튜브를 30°C에서 제거하고 얼음 위에 놓고 자당 쿠션으로 튜브 위에 수입 반응을 조심스럽게 옮겨냅니다.
      참고: 이 단계는 미토콘드리아가 손상되나 파열되지 않도록 매우 느리게 수행해야 합니다. 자당 쿠션은 미토콘드리아의 이동을 늦추고 후속 원심 분리 단계에서 튜브 바닥으로 하강을 "쿠션"하는 데 도움이됩니다.
    7. 원심 분리시 시료 + 자당 쿠션은 4 °C에서 15 분 동안 17,000 x g 에서.
    8. 2.4m 소르비톨 25mL, 1M HEPES(pH 7.4)의 2mL, 이중 증류 H2O 72mL을 결합하여 획기적인 버퍼를 준비한다.
    9. SDS-PAGE 젤 전기포에 대한 용해 완충제 준비: 50mL의 가열 글리세롤, SDS 11.5g, 1M Tris(pH 6.8)의 31.25mL를 결합하고 이중 증류H2O로 500mL로 볼륨을 가져옵니다.
    10. 시료 준비를 위해, 리시스 버퍼 475 μL을 β-메카토에탄올의 25 μL과 혼합하여 나중에 사용할 수 있습니다.
      참고: 리시스 버퍼는 사전에 만들어 실온에서 보관할 수 있습니다. 그러나, β-메르카토에탄올의 첨가는 신선하게 이루어져야 한다.
    11. P1000 파이펫을 사용하여, 조심스럽게 슈퍼네이트를 제거하고 펠릿을 방해하지 않습니다. 적절한 방사성 폐기물 용기에 슈퍼네이트를 폐기하십시오.
    12. 외부 멤브레인으로 반입하려면 Tom40을 사용하여 이 작업을 수행하고, 새로 준비된 0.1M 탄산나트륨(pH 11.5)의 50 μL로 펠릿을 재연하고 30분 동안 얼음에 배양한다.
    13. 인큐베이션에 이어, 원심분리기 는 4°C에서 5분 동안 14,000 x g 의 샘플을 원심분리한다. 이 단계는 외부 멤브레인 가져오기 반응에 대해서만 수행됩니다.
    14. SDS-PAGE 전기전도에 대한 샘플을 준비하려면 20 μL의 브레이킹 버퍼, 20 μL의 리시스 버퍼, β-mercaptoethanol을 추가하고 잘 재중단합니다. 5 μL의 시료 염료를 추가합니다.
    15. 리시스 버퍼 37 μL 및 시료 염료 5μL과 2.3.3 단계에서 남은 번역 반응의 3 μL을 결합하여 제어/번역 레인을 준비합니다. 잘 섞으세요.
    16. 95°C에서 5분간 샘플을 끓이고, 미토콘드리아펠을 피하기 위해 저속으로 부드럽게 회전합니다.
    17. 샘플을 SDS 폴리아크라이알라미드 젤에 바하십시오.
      참고: 젤 백분율 및 후속 런타임은 어떤 단백질을 수입하느냐에 따라 달라집니다. 예를 들어, OCT는 37 kDa이며 성숙한 가공 밴드는 약간 작습니다. 따라서 12% 젤을 사용하면 이러한 밴드를 잘 분리할 수 있습니다.
    18. 전기 전도가 완료되면 젤을 제거하고 이중 증류 된 H2O에 놓습니다.
    19. 젤을 연기 후드에 5% TCA로 끓여서 균열을 피하기 위해 지속적으로 젤을 교반/움직입니다.
      참고: TCA는 시각화를 위해 젤을 고화시키는 데 도움이 됩니다. 이것은 분젠 버너 위에 금속 트레이에서 수행 할 수 있습니다. 젤을 넉넉하게 커버할 수 있는 충분한 TCA를 사용하십시오.
    20. 젤을 제거하고 다시 두 번 증류된 H2O. Agitate는 ~50 rpm에서 1 분 동안 회전 판에 그것을 걸수.
    21. 10mM 트리스로 젤을 회전 플레이트에 넣고 ~50rpm~50rpm에 다시 충분한 방법으로 젤을 넉넉하게 덮어 용기의 ~1/2를 세척합니다.
    22. 젤을 30분 동안 회전판에 1M 살리사이클산으로 세척하여 단백질을 침전하고, 다시 충분한 살리사이클산을 사용하여 젤을 아낌없이 커버하고, 용기의 ~1/2가 사용되고 있다.
    23. 단계 2.3.24-2.3.31에 기술된 바와 같이 젤을 탈수한다.
      참고: 이 작업은 여러 가지 방법으로 수행할 수 있습니다. 젤 건조기( 재료 표 참조)는 시간 효율적인 옵션(아래에 설명됨)을 제공합니다. 그러나 상업적으로 이용 가능한 다른 방법/키트를 사용할 수 있으며 비용 효율적이지만 시간이 많이 소요될 수 있습니다. 겔 건조 키트는 열이나 흡입의 적용을 필요로하지 않고 대신 왜곡을 방지하기 위해 셀로판 시트 사이에 공기 건조 젤을 허용하는 대안으로 활용 될 수있다.
    24. 젤 드라이어의 다공성 침대에 큰 용지를 놓습니다. 젤이 적용되는 지역에 종이 타월 1장을 놓습니다.
    25. 15cm x 20cm 의 얼룩종이를 자르고 종이 타월에 놓습니다.
    26. 15cm x 20cm 블로팅 용지의 두 번째 조각을 사용하여 용기에서 젤을 떠서 첫 번째 조각 위에 평평하게 놓습니다.
    27. 약간 더 큰 플라스틱 랩을 잘라 ~ 20cm x 25cm, 젤에 내려 놓고 주름이나 거품이 랩 아래에 없도록합니다.
      참고: 몇 번의 시도가 필요할 수 있지만 갇힌 공기 주머니가 없는 것이 필수적입니다.
    28. 젤 드라이어의 플라스틱 커버를 랩 위에 부드럽게 내려 놓고 거품이나 주름이 없도록 합니다.
    29. 펌프/진공을 켜고 플라스틱 커버가 씰을 형성했는지 확인합니다. 플라스틱 덮개의 모서리를 들어 올려 밀봉을 테스트하고 다시 밀봉 할 때까지 기다립니다.
    30. 젤 드라이어를 닫고 90분 동안 실행합니다. 온도를 30°C에서 시작하여 점차 80°C에 도달한 다음 실행 끝에 30°C로 돌아갑니다.
    31. 탈수되면 젤은 고화되어 종이처럼 얇습니다. 건조 공정에 사용되는 플라스틱 랩에 젤을 감쌉니다.
    32. 탈수 된 젤을 필름 카세트에 인 필름 ( 재료 표 참조)에 놓고 흰색 면은 젤을 향합니다. 노출 시간은 다양하지만 대역 시각화를 위해 24-48h일 수 있습니다.
    33. 인 이미징이 가능한 적합한 이미저를 사용하여 사인 방사선 을 사용하여 시각화합니다.

결과

우리는 광범위하게이 프로토콜이 기능적이고 그대로 고립 된 골격 근육 미토콘드리아로 수입의 속도를 결정하기위한 유효한 분석이라고 설명했다. 처리되지 않은 조건에 비해, 매트릭스내의 말린 탈수소효소(MDH)와 같은 전형적인 전구체 단백질의 수입은 발리노마이신, 호흡기 사슬 비커플러 (도 2A)에 의해 억제될 수 있기 때문에 멤브레인 전위에 민감하다. 미?...

토론

미토콘드리아는 세포 내의 합성 및 확장을 위해 핵과 미토콘드리아 게놈의 발현과 조정에 유일히 의존한다. 그러나, 핵게놈은 미토콘드리아 프로테아메의 대다수(99%)를 인코딩하고, 이것은 미토콘드리아 생물 발생을 지원하는 단백질 수입 기계류의 중요성을 강조한다. 수입은 또한 수입 실패가 전개된 단백질 반응 및/또는 mitophagy15,16,26의 개시를 촉진할 수 있기 때문에 중요한

공개

이해 상충, 재정적 또는 기타 충돌은 저자에 의해 선언되지 않습니다.

감사의 말

저자는 맥길 대학의 박사 G.C 쇼어, 워싱턴 의과 대학의 A. 스트라우스 박사, 그리고 라 트로브 대학의 박사.M.T. 라이언이 이 연구에 사용 된 표현 플라스미드의 원래 기부에 감사드립니다. 이 작품은 캐나다 자연 과학 및 공학 연구 위원회 (NSERC)에서 D. A. Hood에 대한 자금 지원을 받았습니다. D. A. 후드는 또한 세포 생리학에 있는 캐나다 연구 의자의 홀더입니다.

자료

NameCompanyCatalog NumberComments
0.2% BSASigmaA2153
35S-methioninePerkin ElmerNEG709A500UCPurchase requires a valid radioisotope permit
ATPSigmaA7699
Blotting paper; Whatman 3MM CHR PaperThermo Fisher05-714-5
Cassette for filmKodakKodak Xomatic
Centrifugation TubeThermo Fisher3138-0050
ChloroformThermo FisherC298-4
DTTSigmaD9779-5G
EDTABioShopEDT002
EGTASigmaE4378
Gel DryerBioRadModel 583
Gel Drying KitSigma or BioRadZ377570-1PAK or OW-GDF-10Various options are commercially available through many companies, these are just as few examples.
GlycerolCaledon Laboratory Chemicals5350-1-40
HEPESSigmaH3375
High Speed CentrifugeBeckman CoulterAvanti J-25 Centrifuge
HomogenizerIKAT25 Digital Ultra Turrex
Isoamylalcohol, or 3-methylbutanolSigmaI9392
KAcBioShopPOA301.500
KClSigmaP3911
M7GNew England BiolabS1404SDilute with 1000ul 20mM HEPES to make 1mM stock
MgClBioShopMAG510
MgSO4Thermo FisherM65-500
MOPSBioShopMOP001
NaClBioShopSOD001
NTPThermo FisherR0191
OCT Plasmid--Donated from Dr. G. C. Shore, McGill University, Montreal, Canada; alternative available through Addgene, plasmid #71877
pGEM4Z/hTom40 Plasmid--Donated from Dr. M. T. Ryan, La Trobe University, Melbourne, Australia
pGMDH Plasmid--Donated from Dr. A. Strauss, Washington University School of Medicine
PhenolSigmaP4557
Phenol:Chloroform:IsoamyalcoholSigmaP3803Can also be made with the ratio provided
Phosphorus FilmFujifilmBAS-IP MS 2025
Rabbit reticulocyte lysatePromegaL4960Avoid freeze-thaw; aliquot lysate upon arrival; amino acids are provided in the kit as well
RNAsinPromegaN2311
Rotor for High Speed CentrifugeBeckman CoulterJA-25.50
SDSBioShopSDS001.500Caution: harmful if ingested or inhaled, wear a mask.
Sodium acetateBioshopSAA 304
Sodium CarbonateVWRBDH9284
Sodium salicylateMillipore Sigma106601
SorbitolSigmaS6021
SP6 RNA PolymerasePromegaP1085
SpectrophotometerThermo FisherNanodrop 2000
SpermidineSigmaS-2626
SucroseBioShopSUC507
T7 RNA PolymerasePromegaP2075
Tabletop CentrifugeThermo FisherAccuSpin Micro 17
Trichloroacetic acidThermo FisherA322-500
TrisBioShopTRS001
β-mercaptoethanolSigmaM6250-100ML

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