骨格筋ミトコンドリアのタンパク質輸入能の測定

要約

ミトコンドリアは、骨格筋の表皮形成性の高いレベルを示す重要な代謝小器官です。細胞質ゾルからのタンパク質のインポートは、レチクルムの拡張とミトコンドリア機能の維持に不可欠なオルガネラ生物形成のための重要な経路です。 したがって、タンパク質のインポートは、細胞の健康のバロメーターとして機能します。

要約

ミトコンドリアは、細胞の全体的な健康と同様にエネルギー供給を決定する主要な代謝および調節オルガネラである。骨格筋では、ミトコンドリアは、小さな楕円形のオルガネラから広いレチクルムのようなネットワークに至るまで、一連の複雑な形態に存在する。 ミトコンドリアレチクルムがエネルギー需要の変化などの多様な刺激に対応してどのように拡大し発展するかを理解することは、長い間研究のトピックとなっています。 この成長の重要な側面、または生物形成は、核ゲノムによって元々コードされた前駆体タンパク質の輸入であり、サイトゾルで合成され、様々なミトコンドリアサブコンパートメントに転位する。ミトコンドリアは、タンパク質輸入機械(PIM)として知られている多くの選択的な内膜および外膜チャネルを含む、この輸入プロセスのための洗練されたメカニズムを開発しました。ミトコンドリアへの輸入は、酸化リン酸化による生存可能な膜電位およびオルガネラ由来ATPの利用可能性に依存する。したがって、その測定はオルガネラの健康の尺度として役立ちます。PIMはまた細胞のエネルギー状態に密接に結合される骨格筋の適応可塑性の高レベルを示す。 例えば, 運動訓練は、輸入能力を高めるために示されています, 筋肉の使用が減少しながら, ミトコンドリアの含有量のマーカーの変化と一致.タンパク質のインポートは、ミトコンドリアの生物形成と拡張の重要なステップであるが、このプロセスは骨格筋で広く研究されていません。 本稿では、骨格筋から孤立した完全機能ミトコンドリアを使用してタンパク質の輸入能力を測定し、運動、健康、疾患におけるオルガネラターンオーバー経路の重要性をより深く理解する方法を概説する。

概要

ミトコンドリアは、異なる細胞型の複雑な形態に存在するオルガネラであり、細胞の健康に不可欠な機能の増加配列を有すると認識されている。したがって、彼らはもはやエネルギーを生み出すオルガネラに打ちのめすることはできません。ミトコンドリアは、主要な代謝調節因子であり、細胞運命の決定因子であり、シグナルハブであり、その機能は全体的な細胞の健康の有用な指標として役立つ可能性がある。骨格筋細胞では、電子顕微鏡検査研究は、地理的に異なる皮質下(SS)およびミトコンドリア間(IMF)ミトコンドリアの存在を明らかにし、現在は非常にダイナミックで、骨格筋活動レベルの変化に適応可能であると認識されている。ミトコンドリアの筋肉の含有量および機能は、多くの方法で評価することができます^5,6、および細胞milieu7,8の影響とは異なるミトコンドリアの呼吸および酵素能力(Vmax)をよりよく理解するためにオルガネラ分離の伝統的な方法が適用されています。特に、これらの伝統的な方法は、サブサルコレム領域とミノフィブリラー領域から単離されたミトコンドリアの微妙な生化学的区別を明らかにし、これらの細胞下領域における代謝に対する機能的な影響の可能性を示唆している^8,9,10,11。

ミトコンドリアの生物形成は、核およびミトコンドリアDNAの両方からの遺伝子産物の寄与を必要とする唯一の特徴である。しかし、mtDNAの転写は13個のタンパク質の合成につながるだけなので、これらの大部分は核に由来しています。ミトコンドリアは通常、多様な代謝経路に関与する>1000タンパク質を含むため、オルガネラの生物形成は、適切な化学測定および機能を維持するために、細胞質ゾルから様々なミトコンドリアサブコンパートメントへの前駆体タンパク質の輸入および組み立ての厳重に調節された手段を必要とする^12,13。ミトコンドリアに向かう核コード化タンパク質は、通常、ミトコンドリアターゲティング配列(MTS)を運び、それらを標的とし、そのサブ区画局在化を促進する。ほとんどのマトリックス結合タンパク質はクレアブルN末端MTSを含み、外側または内側のミトコンドリア膜に向かうタンパク質は通常、内部標的ドメイン¹⁴を有する。インポートプロセスは、オルガネル¹³に入るための複数の道を提供する多様なチャネルのセットによって行われます。外膜(TOM)のトランスロケースは、細胞質ゾルから膜間空間に前駆体をシャトルし、そこで内膜(TIM)複合体のトランスロケースによって認識される。この複合体は、核コード化された前駆体をマトリックスにインポートし、プロテアーゼがN末端ターゲティング前配列を切断する役割を担う。外膜に向かうタンパク質は、TOM複合体を介してこの膜に直接挿入することができ、内膜に向かうタンパク質はTIMタンパク質、特にTIM22によって挿入される。タンパク質は、インポート後に、共存プロテアーゼとシャペロンによってさらに処理され、しばしば結合して電子輸送鎖に見られるようなより大きな複合体を形成します。

ミトコンドリアタンパク質のインポート自体は、このプロセスは、膜電位と^ATP15の形でエネルギー源の存在に依存しているので、ミトコンドリアの健康の測定としても機能します。例えば、膜電位が消滅すると、プロテインキナーゼPINK1はオルガネラによって取り込むことができず、これは^{mitophagy16,17}と呼ばれる経路を介して小器官の分解の発症を引き起こすリン酸化シグナルにつながります。同様の状況下では、インポートが妨げられると、タンパク質ATF5はオルガネラに入ることができず、その後核に移り変え、UPR遺伝子発現のアップレギュレーションの転写因子として機能します^18,19。したがって、タンパク質のインポート効率を測定することで、オルガネラの健康に関する包括的な洞察を提供することができ、一方、遺伝子発現応答は、核への逆行シグナル伝達の程度を示すために使用することができる。

ミトコンドリアの生物形成と一般的な細胞の健康にとって明らかな重要性にもかかわらず、哺乳類ミトコンドリアの輸入経路は著しく研究されている。本報告では、骨格筋ミトコンドリアへの前駆体タンパク質のインポート測定に関わる具体的なステップを説明し、筋肉や使用の変化に対する輸入系の適応応答を示すデータを提供し、骨格筋の適応可塑性に対するタンパク質のインポートの寄与を示す。

プロトコル

これらの実験で使用されるすべての動物は、ヨーク大学の動物ケア施設で維持されています。実験は、ヨーク大学動物ケア委員会(許可:2017-08)の承認を得て、カナダ動物ケア評議会のガイドラインに従って行われます。

1. 骨格筋からのサブサルコレムとミトコンドリア間の機能的分離

1. 試薬の準備:
   1. 表 1 に示すように、すべてのバッファーとメディアを準備します。
   2. バッファーを pH 7.4 に設定し、ナガーゼプロテアーゼを除く 4 °C (最大 2 週間) で保存します。
   3. 毎回新鮮なナグアーセプロテアーゼ(表1)を準備します。
2. 組織除去とミンチ
   注: ミトコンドリアの分離に関する以下の手順のフローチャートを 図 1 に示します。
   1. ガラスシンチレーションバイアルに緩衝液1の〜20mL(表1)を充填し、氷の上に置きます。
   2. マウスが麻酔下にある間、骨格筋(脛骨前、四頭筋、胃腸炎など)を収穫し、約500〜1000mg、チルド緩衝液1を含むシンチレーションバイアルに筋肉を入れる。
      注:気体イソフルランは、_O2/minの0.4 Lの流量で2.5%の麻酔薬として使用されます。ピンチテストを行い、動物が応答しないことを確認します。
   3. 組織の採取に続いて、子宮頸部脱臼を介して動物を安楽死させる。
   4. 氷の上で時計ガラスを事前に冷やします。筋肉から脂肪または結合組織を取り除き、均質なスラリーになるまで時計ガラスの組織をミンチします。
   5. 細切り組織を冷やした50 mLプラスチック遠心チューブ( 材料表を参照)に入れ、正確な重量を記録します。
   6. ひき肉を10倍に希釈し、バッファー1+ATP(表1)で希釈します。
   7. 10 sの9.8 Hzの出力で8mm双刃ホモジナイザー( 材料表を参照)を使用して筋肉サンプルを均質化し、筋肉の目に見える塊が残らないようにします。
   8. 高速遠心分離機を使用して、800 x g でサンプルを 10 分間遠心します( 材料表を参照)。
      注: このステップの目的は、SS と IMF ミトコンドリアの分数を分離することです。スーパーネイトにはSSミトコンドリアが含まれ、ペレットにはIMFミトコンドリアが含まれています。
3. SSミトコンドリア分離
   1. チーズクロスの単層を通して50 mLプラスチック遠心分離チューブの別のセットにスーパーネイトをフィルタリングして、大きな破片や汚染物質を除去します。
   2. 高速遠心分離機を使用して4°Cで10分間、9,000 x g で遠心分離機。
   3. スーパーネイトを廃棄し、バッファー 1 + ATP の 3.5 mL でペレットを再懸濁します。
      注: P1000 で再中断し、慎重に行ってください。ミトコンドリアは壊れやすいオルガネラです。ピペットチップでペレットに触れないように、穏やかに実行してください。
   4. 高速遠心分離機を使用して、4°Cで10分間9,000 x g でサンプルを遠心します。
   5. 核、ミトコンドリア、および他のオルガネラを欠いた細胞種画分を分離するさらなる処理が望まれる場合を除き、超在性を捨てる。P200ピペットを用いて、約95μLの再懸濁液媒体(表1)にペレットを慎重に再懸濁します。
      注:ステップ1.3.3と同様に、ピペットチップでペレットに触れないようにしてください。再懸濁液の体積はペレットの大きさに応じて変えることができる。これは、IMFの分数が分離されるまで氷の上に保存することができるSSミトコンドリア分画です。所望であれば、細胞質画分は、オルガネラを欠き、超遠心分離機で100,000xgで遠心し(材料表を参照)、その後ペレットを廃棄することによって単離することができる。
4. IMFミトコンドリア分離
   1. ステップ1.2.8のペレットをバッファー1+ATPで10倍希釈します。サンプルが一貫するまでペレットとバッファーを穏やかに混合して、テフロンの害虫を使用して再中断します。
   2. 10 sの場合は9.8 Hzの出力で8mm双刃ホモジナイザー( 材料表を参照)を使用してサンプルを均質化します。
   3. 高速遠心分離機を使用して4°Cで10分間800 x g でサンプルを遠心します。
   4. 超素子を廃棄し、バッファー2を使用してIMFミトコンドリアペレットを10倍希釈し、均質になるまで穏やかに混合してテフロン害虫を使用して再中断します。
   5. 25 μL/gの組織を10 mg/mLナグアルセプロテアーゼ(表1)に加え、遠心チューブを氷の上に置き、チューブを左右に揺らすことで毎分軽く混合します。
      注:ナガセの添加は、筋原線維の限定的な消化を行うことによってIMFミトコンドリアを解放するのに役立ちます。
   6. 5分後、20mLのバッファー2(表1)を加えて、ナゲセプロテアーゼを非活動のポイントまで希釈し、消化を止めます。
   7. 高速遠心分離機を使用して、4°Cで5分間5分間5,000 x g でサンプルを直ちに遠心します。
   8. スーパーネイトを捨て、バッファー2を使用してペレットを10倍希釈し、軽く混合してテフロン害虫を使用して再中断します。
   9. サンプルを4°Cで15分間800xgで遠心分離し、繊維状材料をペレットする。
   10. 50 mLプラスチック遠心分離チューブの新しいセットにスーパーネイトを注ぎ、廃棄することができるペレットを破壊しないように注意してください。
   11. ステップ1.4.7のように4°Cで10分間9,000 x g でサンプルを遠心する。
   12. スーパーネイトを捨て、バッファー2の3.5mLを加え、P1000ピペットを使用してペレットを静かに再中断します。
   13. ステップ1.4.7のように4°Cで10分間9,000 x g でサンプルを遠心する。
   14. P200ピペットを使用して、スーパーネイトを廃棄し、約180 μLの再懸濁液媒体でペレットを緩やかに再懸濁します。
       注:再懸濁液媒体の体積はペレットのサイズに応じて変更することができます。これはIMFミトコンドリア分画であり、輸入アッセイで使用されるまで氷上に保存することができます。

2. ミトコンドリアタンパク質の輸入

1. In vitro 転写
   注:これらの後続の手順は、インポート用に放射ラベル付きタンパク質を準備する方法を概説します。調査中のインポート経路は、例えばミトコンドリアマトリックスへの輸入を評価するために、標的タンパク質の選択を指示し得る、オルニチンカルバミルトランスファーゼ、OCT、およびマレートデヒドロゲナーゼ、MDHは、一般的に使用され、Tom40は、一般的に外ミトコンドリア膜への輸入の指標として使用される。以下の工程では、好みのタンパク質をコードするプラスミドDNAが必要である。プラスミドDNAの転写は、ミトコンドリア分離の前に別の日に行うことができるので、この実験から採取したmRNAは、将来の翻訳および輸入実験で保存され、使用することができます。
   1. DNAを直線化する:プラスミドDNA40μL(5μg/μL)、10x酵素緩衝液5μL、制限酵素5μLを組み合わせ、37°Cで30分間インキュベートします。
      注:使用される制限酵素は、異なる酵素バッファーを必要とするプラスミドに基づいて変化する可能性があり、テンプレートをスケールアップまたはスケールダウンすることができるため、DNA は任意の量/体積で使用できます。
   2. フェノールとエタノールを用いて、リニア化されたDNAを精製し、沈殿させる。滅菌1.5 mLチューブで後続のステップ(2.1.3-2.1.15)をすべて実行し、遠心分離工程には卓上遠心分離機( 材料表を参照)を使用します。
   3. 最終ボリュームが400 μLになるように、適切な無菌_H2Oのボリュームを追加します。その後、400 μLのフェノールを加えます。
   4. ~10sの反転で激しく混ぜ、遠心分離機を17,000 x g で4°Cで1分間混ぜます。 上のフェーズを撤回して保存します。
   5. 400 μLのフェノールを加える:クロロホルム:イソアミルアルコール(25:24:1、v:v:v)。
   6. ~10sの反転で激しく混ぜ、遠心分離機を17,000gで4°Cで1分間混ぜます。 上のフェーズを撤回して保存します。
   7. 400 μL のクロロホルム:イソアミルアルコール (24:1、 v:v) を加えます。
   8. ~10sの反転で激しく混ぜ、遠心分離機を17,000gで4°Cで1分間混ぜます。 上のフェーズを撤回して保存します。
   9. 3M酢酸ナトリウム(pH 7.0)を40μL加え、1mLの95%エタノールを加えます。
   10. 滅菌1.5mLチューブを-80°C冷凍庫に15分間置きます。
   11. サンプルを17,000 x g で4°Cで10分間遠心します。
   12. スーパーネイトを捨て、80%エタノールの300 μLでペレットを洗います。
   13. サンプルを4°Cで2分間17,000 x g で遠心します。
   14. 上天を捨て、ペレットを空気乾燥させます。ペレットが乾燥したら、それは明確でなければなりません。
   15. 滅菌_H2Oの20 μLでペレットを再懸濁
   16. 分光光度計( 材料表を参照)を使用してDNA濃度を測定し、_A260:280 比が1.8以上であることを確認します。
   17. DNAを滅菌_H2O中の0.8 μG/μLの濃度に希釈します。
   18. DNAを書き起こす:プラスミド(0.8 μg/μL、60.8 μL)、無菌_H2O(8.4 μL)、10mM NTP(5.2 μL)、10 mM ATP(10.0 μL)、1 mM M-7-G(11.6 μL)、前述のミックスステップ2と同じミックス 1.19(15.6 μL)、RNAsin(5.2 μL)、適切なRNAポリメラーゼ(4.8 μL)を形成して「1つの反応ミックス」(全容量= 121.6 μL)を形成し、ポリメラーゼの最適温度(T7ポリメラーゼでは37°C)で90分間インキュベートする。SP6ポリメラーゼの場合は40°C)
   19. 1M HEPES(pH 7.9)の200 μL、1M _MgAc2の100 μL、4 M KAcの500 μL、20mMのマッミジンの100 μL、0.5 M DTTの100 μL、滅菌_H20の200 μLを加えてミックスを調製します。
       注:反応は、提供された試薬の割合が維持されている限り、ボリュームをスケールアップまたはスケールダウンすることができます。使用されるRNAポリメラーゼは、使用されているプラスミド内の細菌プロモーター配列によって決定される。
   20. 次いで、ステップ2.1.2-2.1.15のようにフェノールとエタノールを用いてmRNAを精製し沈殿させます。滅菌_H2O(280 μLを追加)で最大400 μLまでボリュームを持ち、ステップ2.1.2-2.1.15の説明に従って進みます。滅菌_H2Oの20 μLで最終ペレットを再懸濁します。
   21. 分光光度計を用いてmRNAの濃度を測定し、_A260:280 比が〜2.0であることを確認する。
   22. mRNAを滅菌_H2Oで2.8 μg/μLに希釈し、50 μLアリコートで-20°Cで保存します。
2. インビトロ 翻訳
   注: 目的の DNA の翻訳は、インポート実験の同じ日に行う必要があります。この実験では、放射性標識アミノ酸の使用が必要であり、したがって、ユーザは放射性同位元素の使用のための許可を持っている必要があり、すべての取り扱いと処分は、機関のポリシー/要件に従ってでなければなりません。放射性同位元素の安全対策に関する措置は、機関に基づいて異なる可能性が高いため、省略または簡単に説明されています。
   1. インポート実験で使用するミトコンドリアのサンプルあたり〜20μLを供給するのに十分な翻訳反応ミックス(表2)を準備し、翻訳レーンに同じ体積を含めます。
   2. 30°Cで30分間の反応をインキュベートする(時間はmRNA、25〜60分で変化し得る)。
   3. 施設の放射性安全要件に従って ^35S-メチオニンの使用を記録し、機関のガイドラインに従って放射性同位元素に接触したものを処分します。
3. タンパク質のインポート
   注:次のステップでは、孤立したばかりのミトコンドリアが必要です。ミトコンドリア絶縁プロトコルを参照してください。他の分離方法は、ミトコンドリアが実行可能で機能的である限り使用することができる。以降のステップでは、上述のリサスペンションバッファーに使用されるミトコンドリアサンプルが再懸濁される(表 1).ミトコンドリア試料のタンパク質濃度は、輸入アッセイを開始する前に測定する必要があります。
   1. 翻訳反応開始後約15分、ミトコンドリア90μgを無菌1.5mLチューブにアリコートし、30°Cで約10分間培養する。
      注:アリクォートは、実際に実験で使用されるものよりも多くのミトコンドリア。実際に使用されるのは75μgだけです。しかし、過剰にアリクォートすることは要件ではありません。
   2. 無菌1.5mLチューブの新鮮なセットで、ミトコンドリアの75 μgと18 μLの翻訳反応を組み合わせ、30°Cでインキュベートして所望の時間を過ごせます。
   3. 氷の上に翻訳反応の残りの量を保ちます。これは後で使用されます。
      注:インポートは時間依存のプロセスであるため、1〜60分のインキュベーション時間に及ぶタイムコースの実験から始める方が賢明かもしれません。典型的な反応時間は30分です。
   4. この間、スクロース1g、2.5M KClの200 μL、10μL 1 M _MgCl2、1M HEPES(pH 7.4)の100 μLを組み合わせてショ糖クッションを調製し、滅菌_H2Oを使用して体積を5 mLにします。
   5. インポート反応の各チューブに対応する無菌1.5 mLチューブの新しいセットを準備します。各チューブにスクロースクッションのアリコート600 μLを取り込み、インポート反応が終わるまで氷の上に保管します。
   6. 適切なインキュベーション時間後にインポート反応を終了するには、30°Cからチューブを取り出し、氷の上に置き、スクロースクッションでチューブの上にインポート反応を慎重に移します。
      注:このステップは、ミトコンドリアが損傷/破裂していないことを確認するために非常にゆっくりと行う必要があります。スクロースクッションはミトコンドリアの移動を遅くし、その後の遠心段階の間に管の底への降下を「クッション」するのに役立ちます。
   7. サンプル+スクロースクッションを17,000 x g で4°Cで15分間遠心分離します。
   8. 2.4 Mソルビトール25 mL、1 M HEPES(pH 7.4)の2mL、ダブル蒸留_H2Oの72 mLを組み合わせて、ブレークバッファーを準備します。
   9. SDS-PAGEゲル電気泳動用のリシスバッファーを調製する:50 mLの加熱グリセロール、11.5 gのSDS、31.25 mLの1 Mトリス(pH 6.8)を組み合わせ、2倍蒸留_H2Oで体積を500 mLにします。
   10. サンプル調製のために、後のステップで使用される25 μLのβメルカプトエタノールと475 μLのリシスバッファーを混合します。
       注意:Lysisバッファーは、事前に作られ、室温で保存することができます。しかし、βメルカプトエタノールの添加は新鮮に行われる。
   11. P1000ピペットを使用して、慎重にスーパーネイトを除去し、ペレットを乱しません。適切な放射性廃棄物容器にスーパーネートを処分する。
   12. 外膜へのインポートの場合は、Tom40を使用してこれを実行し、作りたての0.1 M炭酸ナトリウム(pH 11.5)の50μLでペレットを再懸濁し、氷上で30分間インキュベートします。
   13. インキュベーションに続き、サンプル14,000xgを4°Cで5分間遠心する。 このステップは、外膜のインポート反応に対してのみ行われます。
   14. SDS-PAGE電気泳動用のサンプルを調製するには、20 μLのブレークバッファー、20 μL のリシスバッファー、およびβメルカプトエタノールを加え、再中断します。5 μLのサンプル染料を加えます。
   15. ステップ2.3.3からの残りの翻訳反応の3μLと37μLのリシスバッファーと5μLのサンプル色素を組み合わせて、制御/翻訳レーンを準備します。よく混ぜます。
   16. サンプルを95°Cで5分間沸騰させ、ミトコンドリアをペレット化しないように低速で軽くスピンダウンします。
   17. サンプルをSDSポリアクリルアミドゲルに塗布します。
       注: ゲルの割合と後続の実行時間は、インポートされるタンパク質によって異なります。たとえば、OCT は 37 kDa で、成熟したバンドは少し小さくなります。したがって、12%のゲルは、これらのバンドの良好な分離を可能にする。
   18. 電気泳動が完了したら、ゲルを取り出し、二重蒸留_H2Oに入れ。
   19. ヒュームフードで5%TCAのゲルを5分間沸騰させ、ひび割れを避けるためにゲルを継続的に攪拌/移動させます。
       注:TCAは、可視化のためのゲルを固めるのに役立ちます。これは、ブンゼンバーナーの上の金属トレイで行うことができます。ゲルを寛大にカバーするのに十分なTCAを使用してください, 〜1/2 満杯.
   20. ゲルを取り出し、二重蒸留_H2Oに戻し、~50rpmで1分間回転板に攪拌します。
   21. 10 mMトリスで5分間回転プレートで洗浄し、容器の1/2を十分にカバーするのに十分な量を再び使用します。
   22. 1 Mのサリ環酸を回転板上で30分間洗浄してタンパク質を沈殿させ、再びゲルを寛大に覆うのに十分なサリチル酸を使用し、使用されている容器の〜1/2。
   23. ステップ 2.3.24-2.3.31 に記載されているようにゲルを脱水します。
       注: これは、いくつかの方法で行うことができます。ゲルドライヤー( 材料表を参照)は、時間効率の高いオプション(下記を参照)を提供します。しかし、他の市販の方法/キットは、より費用対効果が高いが、より時間がかかる可能性がある使用することができます。ゲル乾燥キットは、熱や吸引の適用を必要とせず、代わりにゲルがセロファンシート間で空気乾燥して歪みを防ぐ代替手段として利用することができます。
   24. 大きなブロッティングペーパーをゲルドライヤーの多孔質ベッドの上に置きます。ゲルを塗布する場所にペーパータオルを1枚置きます。
   25. 15cm×20cmのブロッティング紙を切り、ペーパータオルの上に置きます。
   26. 15cm x 20 cmブロッティングペーパーの2枚目を使用して容器からゲルをすくい取り、最初の部分の上に平らに置きます。
   27. 少し大きなラップを20cm x 25cm切り、ゲルの上に置き、折り目や泡を包み込まないようにします。
       注:これはいくつかの試みが必要な場合がありますが、閉じ込められたエアポケットが存在することが不可欠です。
   28. ジェルドライヤーのプラスチックカバーをラップの上にそっと置き、泡や折り目がないことを再び確認します。
   29. ポンプ/真空をオンにし、プラスチックカバーがシールを形成していることを確認します。プラスチックカバーの角を持ち上げてシールをテストし、再シールするのを待ちます。
   30. ゲル乾燥機を閉じ、90分間実行します。温度を30°Cから始め、80°Cに徐々に達し、その後、走行終了時に30°Cに戻します。
   31. 脱水するとゲルが固まり、紙が薄く感じるようにします。乾燥工程で使用したラップでゲルを包みます。
   32. 脱水ゲルをリンフィルム( 材料表参照)を使用したフィルムカセットに入れ、白い側をゲルに向けます。露光時間は変化しますが、バンドの可視化には24〜48時間です。
   33. リンイメージングが可能な任意の適切なイメージャーを使用して、オートラジオグラフィーを使用して視覚化します。

結果

我々は、このプロトコルが機能的で無傷の骨格筋ミトコンドリアへの輸入率を決定するための有効なアッセイであることを広く示している。未処置の状態と比較して、マレートデヒドロゲナーゼ(MDH)などの典型的な前駆体タンパク質をマトリックスにインポートすると、気相鎖アンカプラであるバリノマイシンによって阻害され得るため、膜電位に敏感である (図2A

ディスカッション

ミトコンドリアは、核ゲノムとミトコンドリアゲノムの両方の発現と協調性に依存し、細胞内での合成と拡張に対して独自に依存しています。しかし、核ゲノムはミトコンドリアプロテオームの大部分(99%)をコードしており、ミトコンドリア生物新生をサポートするタンパク質輸入機械の重要性を強調しています。インポートは、インポートの失敗が展開されたタンパク質応答および/またはm...

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.2% BSA	Sigma	A2153
35S-methionine	Perkin Elmer	NEG709A500UC	Purchase requires a valid radioisotope permit
ATP	Sigma	A7699
Blotting paper; Whatman 3MM CHR Paper	Thermo Fisher	05-714-5
Cassette for film	Kodak	Kodak Xomatic
Centrifugation Tube	Thermo Fisher	3138-0050
Chloroform	Thermo Fisher	C298-4
DTT	Sigma	D9779-5G
EDTA	BioShop	EDT002
EGTA	Sigma	E4378
Gel Dryer	BioRad	Model 583
Gel Drying Kit	Sigma or BioRad	Z377570-1PAK or OW-GDF-10	Various options are commercially available through many companies, these are just as few examples.
Glycerol	Caledon Laboratory Chemicals	5350-1-40
HEPES	Sigma	H3375
High Speed Centrifuge	Beckman Coulter	Avanti J-25 Centrifuge
Homogenizer	IKA	T25 Digital Ultra Turrex
Isoamylalcohol, or 3-methylbutanol	Sigma	I9392
KAc	BioShop	POA301.500
KCl	Sigma	P3911
M7G	New England Biolab	S1404S	Dilute with 1000ul 20mM HEPES to make 1mM stock
MgCl	BioShop	MAG510
MgSO4	Thermo Fisher	M65-500
MOPS	BioShop	MOP001
NaCl	BioShop	SOD001
NTP	Thermo Fisher	R0191
OCT Plasmid	-	-	Donated from Dr. G. C. Shore, McGill University, Montreal, Canada; alternative available through Addgene, plasmid #71877
pGEM4Z/hTom40 Plasmid	-	-	Donated from Dr. M. T. Ryan, La Trobe University, Melbourne, Australia
pGMDH Plasmid	-	-	Donated from Dr. A. Strauss, Washington University School of Medicine
Phenol	Sigma	P4557
Phenol:Chloroform:Isoamyalcohol	Sigma	P3803	Can also be made with the ratio provided
Phosphorus Film	Fujifilm	BAS-IP MS 2025
Rabbit reticulocyte lysate	Promega	L4960	Avoid freeze-thaw; aliquot lysate upon arrival; amino acids are provided in the kit as well
RNAsin	Promega	N2311
Rotor for High Speed Centrifuge	Beckman Coulter	JA-25.50
SDS	BioShop	SDS001.500	Caution: harmful if ingested or inhaled, wear a mask.
Sodium acetate	Bioshop	SAA 304
Sodium Carbonate	VWR	BDH9284
Sodium salicylate	Millipore Sigma	106601
Sorbitol	Sigma	S6021
SP6 RNA Polymerase	Promega	P1085
Spectrophotometer	Thermo Fisher	Nanodrop 2000
Spermidine	Sigma	S-2626
Sucrose	BioShop	SUC507
T7 RNA Polymerase	Promega	P2075
Tabletop Centrifuge	Thermo Fisher	AccuSpin Micro 17
Trichloroacetic acid	Thermo Fisher	A322-500
Tris	BioShop	TRS001
β-mercaptoethanol	Sigma	M6250-100ML