Messung der Proteinimportkapazität der Mitochondrien der Skelettmuskulatur

Zusammenfassung

Mitochondrien sind wichtige Stoffwechselorganellen, die eine hohe phänotypische Plastizität in der Skelettmuskulatur aufweisen. Der Import von Proteinen aus dem Zytosol ist ein kritischer Weg für die Organellenbiogenese, der für die Expansion des Retikulums und die Aufrechterhaltung der mitochondrialen Funktion unerlässlich ist. Daher dient der Proteinimport als Barometer für die Zellgesundheit.

Zusammenfassung

Mitochondrien sind wichtige metabolische und regulatorische Organellen, die die Energieversorgung sowie die allgemeine Gesundheit der Zelle bestimmen. In der Skelettmuskulatur existieren Mitochondrien in einer Reihe komplexer Morphologien, die von kleinen ovalen Organellen bis zu einem breiten, retikulumartigen Netzwerk reichen. Zu verstehen, wie sich das mitochondriale Retikulum als Reaktion auf verschiedene Reize wie Veränderungen des Energiebedarfs ausdehnt und entwickelt, ist seit langem ein Forschungsthema. Ein Schlüsselaspekt dieses Wachstums oder der Biogenese ist der Import von Vorläuferproteinen, die ursprünglich vom Kerngenom kodiert, im Zytosol synthetisiert und in verschiedene mitochondriale Unterkompartimente transloziert wurden. Mitochondrien haben einen ausgeklügelten Mechanismus für diesen Importprozess entwickelt, der viele selektive innere und äußere Membrankanäle umfasst, die als Proteinimportmaschinerie (PIM) bekannt sind. Der Import in das Mitochondrium hängt vom lebensfähigen Membranpotential und der Verfügbarkeit von Organellen-abgeleitetem ATP durch oxidative Phosphorylierung ab. Daher kann seine Messung als Maß für die Gesundheit der Organellen dienen. Das PIM weist auch eine hohe adaptive Plastizität in der Skelettmuskulatur auf, die eng an den Energiestatus der Zelle gekoppelt ist. Zum Beispiel hat sich gezeigt, dass Bewegungstraining die Importkapazität erhöht, während Muskelmangel sie reduziert, was mit Veränderungen der Marker des mitochondrialen Inhalts zusammenfällt. Obwohl der Proteinimport ein kritischer Schritt in der Biogenese und Expansion der Mitochondrien ist, ist der Prozess in der Skelettmuskulatur nicht weit verbreitet. Daher beschreibt dieses Papier, wie isolierte und voll funktionsfähige Mitochondrien aus der Skelettmuskulatur verwendet werden können, um die Proteinimportkapazität zu messen, um ein besseres Verständnis der beteiligten Methoden und eine Wertschätzung der Bedeutung des Weges für den Organellenumsatz in Bewegung, Gesundheit und Krankheit zu fördern.

Einleitung

Mitochondrien sind Organellen, die in komplexen Morphologien in verschiedenen Zelltypen vorkommen und eine zunehmende Anzahl von Funktionen besitzen, die für die Zellgesundheit entscheidend sind. Als solche können sie nicht mehr nur auf energieerzeugende Organellen reduziert werden. Mitochondrien sind wichtige Stoffwechselregulatoren, Determinanten des Zellschicksals und Signalknotenpunkte, deren Funktionen als nützliche Indikatoren für die allgemeine Zellgesundheit dienen können. In Skelettmuskelzellen zeigen elektronenmikroskopische Studien das Vorhandensein von geografisch unterschiedlichen subsarkoplemen (SS) und intermyofibrillaren (IMF) Mitochondrien, die einen Grad an Konnektivität aufweisen1,2,3,4, der heute als hochdynamisch und anpassungsfähig an Veränderungen der Skelettmuskelaktivität sowie mit Alter und Krankheit anerkannt ist. Mitochondrialer Gehalt und Funktion im Muskel können auf vielfältige Weise beurteilt ^werden5,6, und traditionelle Methoden der Organellenisolierung wurden angewendet, um die respiratorischen und enzymatischen Kapazitäten (Vmax) der Mitochondrien besser zu verstehen, die sich vom Einfluss des zellulären Milieus ^{unterscheiden7,8}. Insbesondere haben diese traditionellen Methoden subtile biochemische Unterschiede zwischen Mitochondrien aufgedeckt, die aus subsarkoplemalen und intermyofibrillären Regionen isoliert wurden, was mögliche funktionelle Auswirkungen auf den Stoffwechsel in diesen subzellulären Regionen widerlegt8,9,10,11.

Die Biogenese der Mitochondrien ist einzigartig, da sie den Beitrag von Genprodukten sowohl aus der kernigen als auch aus der mitochondrialen DNA erfordert. Die überwiegende Mehrheit davon stammt jedoch aus dem Zellkern, da die mtDNA-Transkription nur zur Synthese von 13 Proteinen führt. Da Mitochondrien normalerweise >1000 Proteine umfassen, die an verschiedenen Stoffwechselwegen beteiligt sind, erfordert die Biogenese der Organelle ein streng reguliertes Mittel zum Import und Zusammenbau von Vorläuferproteinen aus dem Zytosol in die verschiedenen mitochondrialen Unterkompartimente, um eine ordnungsgemäße Stöchiometrie und Funktion ^{aufrechtzuerhalten12,13}. Kernkodierte Proteine, die für Mitochondrien bestimmt sind, tragen normalerweise eine mitochondriale Zielsequenz (MTS), die sie auf die Organelle abstößt und ihre subkompartimentale Lokalisierung erleichtert. Die meisten matrixgebundenen Proteine enthalten ein spaltbares N-terminales MTS, während diejenigen, die für die äußere oder innere mitochondriale Membran bestimmt sind, normalerweise interne Zieldomänen ^haben14. Der Importprozess wird von einer Reihe verschiedener Kanäle durchgeführt, die mehrere Wege für den Eintritt in die ^Organelle13 bieten. Der Translokase-Komplex der äußeren Membran (TOM) transportiert Vorläufer aus dem Zytosol in den Intermembranraum, wo sie vom Translocase-Komplex der inneren Membran (TIM) erkannt werden. Dieser Komplex ist verantwortlich für den Import von kernkodierten Vorläufern in die Matrix, wo Proteasen die N-terminale Zielvorsequenz spalten. Proteine, die für die äußere Membran bestimmt sind, können durch den TOM-Komplex direkt in diese Membran eingefügt werden, während diejenigen, die für die innere Membran bestimmt sind, durch ein TIM-Protein, speziell TIM22, eingefügt werden. Nach ihrem Import werden Proteine von residenten Proteasen und Chaperonen weiterverarbeitet und verbinden sich oft zu größeren Komplexen, wie sie in der Elektronentransportkette vorkommen.

Der mitochondriale Proteinimport selbst dient auch als Messung der mitochondrialen Gesundheit, da dieser Prozess auf dem Vorhandensein von Membranpotential und einer Energiequelle in Form von ^ATP15 beruht. Wenn beispielsweise das Membranpotential dissipiert wird, kann die Proteinkinase PINK1 nicht von der Organelle aufgenommen werden, und dies führt zu Phosphorylierungssignalen, die den Beginn des Abbaus der Organelle über einen Weg namens Mitophagie ^{auslösen16,17}. Unter ähnlichen Umständen kann das Protein ATF5, wenn der Import behindert wird, nicht in die Organelle gelangen und transloziert anschließend in den Zellkern, wo es als Transkriptionsfaktor für die Hochregulierung der UPR-Genexpression ^dient18,19. So kann die Messung der Proteinimporteffizienz einen umfassenden Einblick in die Gesundheit der Organelle geben, während die Genexpressionsantwort verwendet werden kann, um den Grad der retrograden Signalübertragung an den Zellkern anzuzeigen.

Trotz seiner offensichtlichen Bedeutung für die Biogenese der Mitochondrien und für die Zellgesundheit im Allgemeinen ist der Importweg in den Mitochondrien von Säugetieren bemerkenswert wenig erforscht. In diesem Bericht beschreiben wir die spezifischen Schritte zur Messung des Imports von Vorläuferproteinen in die Mitochondrien der Skelettmuskulatur und liefern Daten, um die adaptive Reaktion des Importsystems auf Muskelveränderungen und Nichtgebrauch zu veranschaulichen und den Beitrag des Proteinimports zur adaptiven Plastizität der Skelettmuskulatur zu veranschaulichen.

Protokoll

Alle Tiere, die in diesen Experimenten verwendet werden, werden in der Tierpflegeeinrichtung der York University gehalten. Die Experimente werden in Übereinstimmung mit den Richtlinien des Canadian Council on Animal Care mit Genehmigung des York University Animal Care Committee (Genehmigung: 2017-08) durchgeführt.

1. Funktionelle Isolierung subsarkolumer und intermyofibrillarer Mitochondrien aus der Skelettmuskulatur

1. Vorbereitung des Reagenzes:
   1. Bereiten Sie alle Puffer und Medien wie in Tabelle 1 beschrieben vor.
   2. Die Puffer auf pH 7,4 einstellen und bei 4 °C (bis zu 2 Wochen) lagern, ausgenommen Nagraseprotease.
   3. Bereiten Sie jedes Mal frische Nagarse-Protease (Tabelle 1) zu.
2. Gewebeentnahme und Zerkleinerung
   HINWEIS: Ein Flussdiagramm der folgenden Schritte für die Isolierung von Mitochondrien ist in Abbildung 1 dargestellt.
   1. Füllen Sie eine Glasszintillationsfläschchen mit ~20 ml Puffer 1 (Tabelle 1) und legen Sie sie auf Eis.
   2. Während die Maus unter Narkose steht, ernten Sie Skelettmuskeln (Tibialis anterior, Quadrizeps, Gastrocnemius usw.), etwa 500-1000 mg, und legen Sie die Muskeln in die Szintillationsfläschchen mit gekühltem Puffer 1.
      HINWEIS: Gasförmiges Isofluran wird als Anästhetikum bei 2,5% bei einer Durchflussrate von 0,4 l _O2/min verwendet. Ein Pinch-Test wird durchgeführt, um sicherzustellen, dass das Tier nicht ansprechbar ist.
   3. Nach der Gewebeentnahme wird das Tier durch zervikale Luxation eingeschläfert.
   4. Kühlen Sie ein Uhrenglas vor auf Eis. Entfernen Sie Fett oder Bindegewebe von den Muskeln und zerkleinern Sie das Gewebe auf dem Uhrenglas, bis es eine homogene Aufschlämmung ist.
   5. Legen Sie das zerkleinerte Gewebe in ein vorgekühltes 50 ml Kunststoffzentrifugationsrohr (siehe Materialtabelle) und notieren Sie das genaue Gewicht.
   6. Verdünnen Sie das gehackte Gewebe 10-fach mit Puffer 1 + ATP (Tabelle 1).
   7. Homogenisieren Sie die Muskelprobe mit einem 8 mm Zweiblatt-Homogenisator (siehe Materialtabelle) bei einer Ausgangsleistung von 9,8 Hz für 10 s, um sicherzustellen, dass keine sichtbaren Muskelbrocken übrig bleiben.
   8. Zentrifugieren Sie die Proben bei 800 x g für 10 min mit einer Hochgeschwindigkeitszentrifuge (siehe Materialtabelle).
      HINWEIS: Der Zweck dieses Schritts besteht darin, die mitochondrialen Fraktionen von SS und IMF zu trennen. Das Übergeborene enthält SS-Mitochondrien, während das Pellet IMF-Mitochondrien enthält.
3. SS mitochondriale Isolierung
   1. Filtern Sie das Überkat durch eine einzige Schicht Käsetuch in einen anderen Satz 50 ml Kunststoffzentrifugationsrohre, um große Ablagerungen oder Verunreinigungen zu entfernen.
   2. Zentrifugieren Sie den Übergeborenen bei 9.000 x g für 10 min bei 4 °C mit einer Hochgeschwindigkeitszentrifuge.
   3. Entsorgen Sie das Übergeborene und resuspenieren Sie das Pellet in 3,5 ml Puffer 1 + ATP.
      HINWEIS: Resuspend mit einem P1000 und tun Sie dies vorsichtig. Mitochondrien sind zerbrechliche Organellen. Führen Sie vorsichtig durch und vermeiden Sie es, das Pellet mit der Pipettenspitze zu berühren.
   4. Zentrifugieren Sie die Probe bei 9.000 x g für 10 min bei 4 °C mit einer Hochgeschwindigkeitszentrifuge.
   5. Verwerfen Sie das Übernetz, es sei denn, eine weitere Verarbeitung zur Isolierung einer zytosolischen Fraktion ohne Kerne, Mitochondrien und andere Organellen ist erwünscht. Resuspendieren Sie das Pellet vorsichtig in etwa 95 μL des Resuspensionsmediums (Tabelle 1) mit einer P200-Pipette.
      HINWEIS: Vermeiden Sie es, ähnlich wie bei Schritt 1.3.3, das Pellet mit der Pipettenspitze zu berühren. Das Volumen des Resuspensionsmediums kann je nach Größe des Pellets verändert werden. Dies ist die mitochondriale SS-Fraktion, die auf Eis gespeichert werden kann, bis die IMF-Fraktion isoliert ist. Falls gewünscht, kann die zytosolische Fraktion, frei von Organellen, isoliert werden, indem das Übernetz bei 100.000 x g in einer Ultrazentrifuge zentrifugiert wird (siehe Materialtabelle) und anschließend das Pellet verworfen wird.
4. MITOCHONDRIALE ISOLIERUNG DES IWF
   1. Verdünnen Sie das Pellet ab Schritt 1.2.8 um das 10-fache in Puffer 1 + ATP. Resuspendieren Sie mit einem Teflon-Stößel, indem Sie das Pellet vorsichtig mischen und zusammenpuffern, bis die Probe konsistent ist.
   2. Homogenisieren Sie die Probe mit einem 8 mm Zweiblatt-Homogenisator (siehe Materialtabelle) bei einer Ausgangsleistung von 9,8 Hz für 10 s.
   3. Zentrifugieren Sie die Probe bei 800 x g für 10 min bei 4 °C mit einer Hochgeschwindigkeitszentrifuge.
   4. Verwerfen Sie das Überalter und verdünnen Sie das IMF-Mitochondrienpellet 10-fach mit Puffer 2 und resuspendieren Sie es mit dem Teflonstößel durch vorsichtiges Mischen, bis es homogen ist.
   5. 25 μL/g Gewebe zu 10 mg/ml Nagarseprotease geben (Tabelle 1) und das Zentrifugationsröhrchen auf die Seite auf Eis legen, wobei jede Minute vorsichtig vermischt wird, indem das Röhrchen von Seite zu Seite geschaukelt wird.
      HINWEIS: Die Zugabe von Nagarse hilft, IMF-Mitochondrien freizusetzen, indem eine begrenzte Verdauung der Myofibrillen durchgeführt wird.
   6. Nach 5 min 20 ml Puffer 2 (Tabelle 1) hinzufügen, um die Nagarseprotease bis zur Inaktivität zu verdünnen und die Verdauung zu stoppen.
   7. Zentrifugieren Sie die Probe sofort bei 5.000 x g für 5 min bei 4 °C mit einer Hochgeschwindigkeitszentrifuge.
   8. Entsorgen Sie das Übergewicht und verdünnen Sie das Pellet 10-fach mit Puffer 2 und resuspendieren Sie es mit einem Teflonstößel durch vorsichtiges Mischen.
   9. Zentrifugieren Sie die Probe bei 800 x g für 15 min bei 4 °C, um das Fasermaterial zu pelletieren.
   10. Gießen Sie den Überstrahl in einen neuen Satz von 50 ml Kunststoffzentrifugenröhrchen, achten Sie darauf, das Pellet nicht zu stören, das entsorgt werden kann.
   11. Zentrifugieren Sie die Probe bei 9.000 x g für 10 min bei 4 °C gemäß Schritt 1.4.7.
   12. Entsorgen Sie das Überkat, fügen Sie 3,5 ml Puffer 2 hinzu und resuspenieren Sie das Pellet vorsichtig mit einer P1000-Pipette.
   13. Zentrifugieren Sie die Probe bei 9.000 x g für 10 min bei 4 °C gemäß Schritt 1.4.7.
   14. Entsorgen Sie das Übergewicht und resuspenieren Sie das Pellet vorsichtig mit etwa 180 μL Resuspensionsmedium mit einer P200-Pipette.
       HINWEIS: Das Volumen des Resuspensionsmediums kann je nach Größe des Pellets verändert werden. Dies ist die mitochondriale Fraktion des IWF, die auf Eis gelagert werden kann, bis sie im Importassay verwendet werden soll.

2. Mitochondrialer Proteinimport

1. In vitro Transkription
   HINWEIS: In den folgenden Schritten wird beschrieben, wie ein radioaktiv markiertes Protein für den Import vorbereitet wird. Der untersuchte Importweg kann die Wahl des Zielproteins diktieren, zum Beispiel zur Bewertung des Imports in die mitochondriale Matrix, Ornithincartamyltransferase, OCT, und Malatdehydrogenase, MDH, werden häufig verwendet, während Tom40 häufig als Hinweis auf den Import in die äußere mitochondriale Membran verwendet wird. Für die folgenden Schritte ist Plasmid-DNA erforderlich, die für das Protein der Wahl kodiert. Die Transkription von Plasmid-DNA kann vor der mitochondrialen Isolierung an einem separaten Tag erfolgen, und die aus diesem Experiment gesammelte mRNA kann gespeichert und in zukünftigen Translations- und Importexperimenten verwendet werden.
   1. Linearisieren Sie die DNA: Kombinieren Sie 40 μL Plasmid-DNA (5 μg/μL), 5 μL 10x Enzympuffer und 5 μL Restriktionsenzym und inkubieren Sie bei 37 °C für 30 min.
      HINWEIS: Die verwendeten Restriktionsenzyme können je nach Plasmid variieren, was einen anderen Enzympuffer erfordern kann, und experimentelle Bedingungen DNA kann in beliebiger Menge / Volumen verwendet werden, da die Vorlage nach oben oder unten skaliert werden kann.
   2. Reinigen und niederschlagen Sie die linearisierte DNA mit Phenol und Ethanol. Führen Sie alle nachfolgenden Schritte (2.1.3-2.1.15) in sterilen 1,5 ml Röhrchen durch und verwenden Sie eine Tischzentrifuge (siehe Materialtabelle) für die Zentrifugationsschritte.
   3. Fügen Sie das entsprechende Volumen sterilen _H2O hinzu, so dass das Endvolumen 400 μL entspricht. Dann fügen Sie 400 μL Phenol hinzu.
   4. Kräftig durch Inversion für ~10 s mischen und bei 17.000 x g für 1 min bei 4 °C zentrifugieren. Ziehen Sie die obere Phase zurück und speichern Sie sie.
   5. Fügen Sie 400 μL Phenol:Chloroform:Isoamylalkohol hinzu (25:24:1, v:v:v).
   6. Kräftig durch Inversion für ~10 s mischen und bei 17.000 g für 1 min bei 4 °C zentrifugieren. Ziehen Sie die obere Phase zurück und speichern Sie sie.
   7. Fügen Sie 400 μL Chloroform:Isoamylalkohol hinzu (24:1, v:v).
   8. Kräftig durch Inversion für ~10 s mischen und bei 17.000 g für 1 min bei 4 °C zentrifugieren. Ziehen Sie die obere Phase zurück und speichern Sie sie.
   9. Fügen Sie 40 μL 3M Natriumacetat (pH 7,0) hinzu und fügen Sie 1 ml 95% Ethanol hinzu.
   10. Sterile 1,5 ml Röhrchen für 15 min in -80 °C Gefrierschrank auf die Seite legen.
   11. Zentrifugieren Sie die Proben bei 17.000 x g für 10 min bei 4 °C.
   12. Entsorgen Sie das Übernat und waschen Sie das Pellet mit 300 μL 80% Ethanol.
   13. Zentrifugieren Sie die Proben bei 17.000 x g für 2 min bei 4 °C.
   14. Entsorgen Sie das Übernat und trocknen Sie das Pellet an der Luft. Sobald das Pellet trocken ist, sollte es klar sein.
   15. Resuspendieren Sie das Pellet in 20 μL sterilem _H2O
   16. Messen Sie die DNA-Konzentration mit einem Spektralphotometer (siehe Materialtabelle) und stellen Sie sicher, dass das Verhältnis _A260:280 über 1,8 liegt.
   17. Verdünnen Sie die DNA auf eine Konzentration von 0,8 μg/μL in sterilem _H2O.
   18. Transkribieren sie die DNA: Plasmid (0,8 μg/μL, 60,8 μL), steriles _H2O (8,4 μL), 10 mM NTP (5,2 μL), 10 mM ATP (10,0 μL), 1 mM M-7-G (11,6 μL), die Mischung wie in Schritt 2.1.19 (15,6 μL), RNAsin (5,2 μL) und eine geeignete RNA-Polymerase (4,8 μL) zu "einem Reaktionsmix" (Gesamtvolumen = 121,6 μL) kombinieren und 90 min bei optimaler Temperatur für die Polymerase (37 °C für T7-Polymerase) inkubieren; 40 °C für SP6-Polymerase)
   19. Zur Herstellung der Mischung werden 200 μL 1M HEPES (pH 7,9), 100 μL 1 M _MgAc2, 500 μL 4 M KAc, 100 μL 20 mM Spermidin, 100 μL 0,5 M DTT und 200 μL steriles _H20 hinzugefügt.
       HINWEIS: Die Reaktion kann im Volumen nach oben oder unten skaliert werden, solange die bereitgestellten Anteile an Reagenzien eingehalten werden. Die verwendete RNA-Polymerase wird durch die bakterielle Promotorsequenz innerhalb des verwendeten Plasmids diktiert.
   20. Anschließend wird die mRNA unter Verwendung von Phenol und Ethanol gemäß den Schritten 2.1.2-2.1.15 gereinigt und ausgefällt. Das Volumen wird mit sterilem _H2O auf 400 μL gebracht (280 μL zugegeben) und wie in den Schritten 2.1.2-2.1.15 beschrieben vorgegangen. Resuspendieren Sie das endgültige Pellet in 20 μL sterilem _H2O.
   21. Messen Sie die Konzentration von mRNA mit einem Spektralphotometer und stellen Sie sicher, dass das Verhältnis _{A260: 280} ~ 2,0 beträgt.
   22. Verdünnen Sie die mRNA auf 2,8 μg/μL in sterilem _H2O und lagern Sie sie bei -20 °C in 50 μL Aliquots.
2. In-vitro-Translation
   HINWEIS: Die Translation der gewünschten DNA muss am selben Tag des Importexperiments durchgeführt werden. Dieses Experiment erfordert die Verwendung von radioaktiv markierten Aminosäuren, und daher muss der Benutzer eine Genehmigung für die Verwendung von Radioisotopen haben, und alle Handhabung und Entsorgung müssen in Übereinstimmung mit den Richtlinien / Anforderungen der Institution sein. Schritte mit Radioisotopen-Sicherheitsmaßnahmen wurden weggelassen oder kurz beschrieben, da diese je nach Institution wahrscheinlich unterschiedlich sein werden.
   1. Bereiten Sie genügend Translationsreaktionsmischung (Tabelle 2) vor, um ~ 20 μL pro Probe von Mitochondrien zu liefern, die im Importexperiment verwendet werden sollen, und das gleiche Volumen für eine Translationsspur einzubeziehen.
   2. Inkubieren Sie die Reaktion für 30 min bei 30 °C (Zeit kann mit mRNA variieren, 25-60 min).
   3. Notieren Sie den 35S-Methionin-Konsum gemäß den radioaktiven Sicherheitsanforderungen der Institution und entsorgen Sie alles, was mit dem Radioisotop in Kontakt gekommen ist, gemäß den Richtlinien der Institution.
3. Proteinimport
   HINWEIS: Für die nächsten Schritte werden frisch isolierte Mitochondrien benötigt. Beziehen Sie sich auf das mitochondriale Isolationsprotokoll. Andere Isolationsmethoden können verwendet werden, solange die Mitochondrien lebensfähig und funktionsfähig sind. Für die nachfolgenden Schritte werden die verwendeten mitochondrialen Proben wie oben beschrieben in einem Resuspensionspuffer resuspendiert (Tabelle 1). Die Proteinkonzentration der mitochondrialen Probe muss ebenfalls vor Beginn des Importassays gemessen werden.
   1. Etwa 15 min nach Beginn der Translationsreaktion aliquote 90 μg Mitochondrien in sterile 1,5 ml Röhrchen und bei 30 °C für ~10 min vorinkubieren.
      HINWEIS: Aliquot mehr Mitochondrien als das, was tatsächlich im Experiment verwendet wird; es werden nur 75 μg tatsächlich verbraucht. Aliquoting im Übermaß ist jedoch keine Voraussetzung.
   2. In einem frischen Satz steriler 1,5 ml Röhrchen 75 μg Mitochondrien mit 18 μL der Translationsreaktion kombinieren und bei 30 °C für die gewünschte Zeit inkubieren.
   3. Halten Sie das verbleibende Volumen der Translationsreaktion auf Eis; dies wird später verwendet.
      HINWEIS: Der Import ist ein zeitabhängiger Prozess, daher kann es ratsam sein, mit einem Zeitverlaufsexperiment zu beginnen, dessen Inkubationszeiten zwischen 1 und 60 Minuten liegen. Eine typische Reaktionszeit beträgt 30 min.
   4. Bereiten Sie während dieser Zeit das Saccharosekissen vor, indem Sie 1 g Saccharose, 200 μL 2,5 M KCl, 10 μL 1 M _MgCl2, 100 μL 1 M HEPES (pH 7,4) kombinieren und das Volumen mit sterilem _H2O auf 5 ml bringen.
   5. Bereiten Sie einen neuen Satz steriler 1,5 ml Röhrchen vor, die jedem Röhrchen in der Importreaktion entsprechen. Aliquot 600 μL des Saccharosekissens in jedes Röhrchen und auf Eis aufbewahren, bis die Importreaktion vorbei ist.
   6. Um die Importreaktion nach der entsprechenden Inkubationszeit zu beenden, entfernen Sie das Röhrchen von 30 °C, legen Sie es auf Eis und übertragen Sie dann die Importreaktion vorsichtig mit dem Saccharosekissen auf das Röhrchen.
      HINWEIS: Dieser Schritt muss sehr langsam durchgeführt werden, um sicherzustellen, dass die Mitochondrien nicht beschädigt / gerissen werden. Das Saccharosekissen hilft, die Migration der Mitochondrien zu verlangsamen und "polstert" ihren Abstieg auf den Boden der Röhre während des nachfolgenden Zentrifugationsschritts.
   7. Zentrifugieren Sie die Proben + Saccharosekissen bei 17.000 x g für 15 min bei 4 °C.
   8. Bereiten Sie den Bruchpuffer vor, indem Sie 25 ml 2,4 m Sorbit, 2 ml 1 M HEPES (pH 7,4) und 72 ml doppelt destilliertes _H2O kombinieren.
   9. Lysepuffer für SDS-PAGE-Gelelektrophorese vorbereiten: Kombinieren Sie 50 ml erhitztes Glycerin, 11,5 g SDS, 31,25 ml 1 M Tris (pH 6,8) und bringen Sie das Volumen mit doppelt destilliertem _H2O auf 500 ml.
   10. Für die Probenvorbereitung mischen Sie 475 μL Lysepuffer mit 25 μL β-Mercaptoethanol, um in einem späteren Schritt verwendet zu werden.
       HINWEIS: Lysepuffer kann im Voraus hergestellt und bei Raumtemperatur gelagert werden; die Zugabe von β-Mercaptoethanol ist jedoch frisch zu erfolgen.
   11. Entfernen Sie mit einer P1000-Pipette vorsichtig den Übergeborenen und stören Sie das Pellet nicht. Entsorgen Sie das Übernat in einem geeigneten Behälter für radioaktive Abfälle.
   12. Für den Import in die äußere Membran ist dies mit Tom40 durchzuführen, das Pellet in 50 μL frisch zubereitetem 0,1 M Natriumcarbonat (pH 11,5) zu resuspenieren und 30 min auf Eis zu inkubieren.
   13. Nach der Inkubation wird die Probe 14.000 x g für 5 min bei 4 °C zentrifugiert. Dieser Schritt wird nur für äußere Membranimportreaktionen durchgeführt.
   14. Um die Proben für die SDS-PAGE-Elektrophorese vorzubereiten, fügen Sie 20 μL Bruchpuffer, 20 μL Lysepuffer und β-Mercaptoethanol hinzu und resuspendieren Sie gut. Fügen Sie 5 μL Probenfarbstoff hinzu.
   15. Bereiten Sie die Kontroll-/Translationsspur vor, indem Sie 3 μL der verbleibenden Translationsreaktion aus Schritt 2.3.3 mit 37 μL Lysepuffer und 5 μL Probenfarbstoff kombinieren. Gut mischen.
   16. Kochen Sie die Proben für 5 min bei 95 °C und drehen Sie sie vorsichtig mit niedriger Geschwindigkeit herunter, um eine Pelletierung der Mitochondrien zu vermeiden.
   17. Tragen Sie die Proben auf ein SDS-Polyacrylamid-Gel auf.
       HINWEIS: Der Gelanteil und die anschließende Laufzeit hängen davon ab, welches Protein importiert wird. Zum Beispiel ist OCT 37 kDa, und sein ausgereiftes verarbeitetes Band ist etwas kleiner; Daher ermöglicht ein 12% iges Gel eine gute Trennung dieser Banden.
   18. Sobald die Elektrophorese abgeschlossen ist, entfernen Sie das Gel und legen Sie es in doppelt destilliertes _H2O.
   19. Kochen Sie das Gel in 5% TCA in einem Abzug für 5 min und rühren / bewegen Sie das Gel kontinuierlich, um Risse zu vermeiden.
       HINWEIS: TCA hilft, das Gel für die Visualisierung zu verfestigen; dies kann in einem Metalltablett über einem Bunsenbrenner erfolgen. Verwenden Sie genügend TCA, um das Gel großzügig zu bedecken, ~ 1/2 voll.
   20. Entfernen Sie das Gel und legen Sie es wieder in doppelt destilliertes _H2O. Rühren Sie es für 1 min bei ~ 50 U / min auf eine rotierende Platte.
   21. Waschen Sie das Gel in 10 mM Tris auf einer rotierenden Platte für 5 min bei ~ 50 U / min, wieder mit genug, um das Gel großzügig zu bedecken, ~ 1/2 des Behälters.
   22. Niederschlagen Sie das Protein, indem Sie das Gel in 1 M Saliccyclic Acid auf einer rotierenden Platte für 30 min waschen, wieder mit genügend Saliccyclic Acid, um das Gel großzügig zu bedecken, ~ 1/2 des verwendeten Behälters.
   23. Dehydrieren Sie das Gel wie in den Schritten 2.3.24-2.3.31 beschrieben.
       HINWEIS: Dies kann auf verschiedene Arten erfolgen. Ein Geltrockner (siehe Materialtabelle) bietet eine zeiteffiziente Option (siehe unten); Es können jedoch auch andere kommerziell erhältliche Methoden/Kits verwendet werden, die möglicherweise kostengünstiger, aber zeitaufwändiger sind. Geltrocknungskits können als Alternative verwendet werden, die keine Hitze oder Absaugung erfordert, sondern das Gel zwischen Zellophanblättern an der Luft trocknen lässt, um Verzerrungen zu vermeiden.
   24. Legen Sie ein großes Blatt Löschpapier auf das poröse Bett des Geltrockners. Legen Sie ein Blatt Papiertuch in den Bereich, in dem das Gel aufgetragen wird.
   25. Schneiden Sie ein 15 cm x 20 cm großes Stück Löschpapier aus und legen Sie es auf das Papiertuch.
   26. Schöpfen Sie das Gel mit einem zweiten Stück 15 cm x 20 cm Löschpapier aus dem Behälter und legen Sie es flach auf das erste Stück.
   27. Schneiden Sie ein etwas größeres Stück Plastikfolie, ~ 20 cm x 25 cm, und legen Sie es auf Gel, um sicherzustellen, dass keine Falten oder Blasen unter der Verpackung sind.
       HINWEIS: Dies kann einige Versuche erfordern, aber es ist unerlässlich, dass es keine eingeschlossenen Lufteinschlüsse gibt.
   28. Legen Sie die Kunststoffabdeckung des Geltrockners vorsichtig über die Verpackung und stellen Sie sicher, dass keine Blasen oder Falten vorhanden sind.
   29. Schalten Sie die Pumpe/das Vakuum ein und stellen Sie sicher, dass die Kunststoffabdeckung eine Dichtung gebildet hat. Testen Sie die Dichtung, indem Sie eine Ecke der Kunststoffabdeckung anheben und warten, bis sie wieder versiegelt ist.
   30. Schließen Sie den Geltrockner und lassen Sie ihn 90 Minuten laufen. Stellen Sie die Temperatur auf 30 ° C ein, erreichen Sie allmählich 80 ° C und kehren Sie am Ende des Laufs auf 30 ° C zurück.
   31. Nach der Dehydrierung verfestigt sich das Gel und fühlt sich hauchdünn an. Wickeln Sie das Gel in die Plastikfolie, die im Trocknungsprozess verwendet wird.
   32. Legen Sie das dehydrierte Gel in eine Filmkassette mit einem Phosphorfilm (siehe Materialtabelle), wobei die weiße Seite dem Gel zugewandt ist. Die Belichtungszeiten variieren, können aber für die Visualisierung von Bändern 24-48 h betragen.
   33. Visualisieren Sie mit Autoradiographie mit einem geeigneten Imager, der phosphorbildgebend ist.

Ergebnisse

Wir haben ausführlich dargelegt, dass dieses Protokoll ein gültiger Assay zur Bestimmung der Importrate in funktionelle und intakte isolierte Mitochondrien der Skelettmuskulatur ist. Im Vergleich zu unbehandelten Bedingungen ist der Import typischer Vorläuferproteine wie Malatdehydrogenase (MDH) in die Matrix empfindlich gegenüber dem Membranpotential, da er durch Valinomycin, einen Entkoppler der Atmungskette, gehemmt werden kann (Abbildung 2A).< Der Import wird auch be...

Diskussion

Mitochondrien sind in einzigartiger Weise von der Expression und Koordination sowohl des nuklearen als auch des mitochondrialen Genoms für ihre Synthese und Expansion innerhalb von Zellen abhängig. Das Kerngenom kodiert jedoch für die überwiegende Mehrheit (99%) des mitochondrialen Proteoms, was die Bedeutung der Proteinimportmaschinerie für die Unterstützung der mitochondrialen Biogenese unterstreicht. Der Import dient auch als wichtiges Signalereignis, da ein Nichtimport die Initiierung der entfalteten Proteinant...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.2% BSA	Sigma	A2153
35S-methionine	Perkin Elmer	NEG709A500UC	Purchase requires a valid radioisotope permit
ATP	Sigma	A7699
Blotting paper; Whatman 3MM CHR Paper	Thermo Fisher	05-714-5
Cassette for film	Kodak	Kodak Xomatic
Centrifugation Tube	Thermo Fisher	3138-0050
Chloroform	Thermo Fisher	C298-4
DTT	Sigma	D9779-5G
EDTA	BioShop	EDT002
EGTA	Sigma	E4378
Gel Dryer	BioRad	Model 583
Gel Drying Kit	Sigma or BioRad	Z377570-1PAK or OW-GDF-10	Various options are commercially available through many companies, these are just as few examples.
Glycerol	Caledon Laboratory Chemicals	5350-1-40
HEPES	Sigma	H3375
High Speed Centrifuge	Beckman Coulter	Avanti J-25 Centrifuge
Homogenizer	IKA	T25 Digital Ultra Turrex
Isoamylalcohol, or 3-methylbutanol	Sigma	I9392
KAc	BioShop	POA301.500
KCl	Sigma	P3911
M7G	New England Biolab	S1404S	Dilute with 1000ul 20mM HEPES to make 1mM stock
MgCl	BioShop	MAG510
MgSO4	Thermo Fisher	M65-500
MOPS	BioShop	MOP001
NaCl	BioShop	SOD001
NTP	Thermo Fisher	R0191
OCT Plasmid	-	-	Donated from Dr. G. C. Shore, McGill University, Montreal, Canada; alternative available through Addgene, plasmid #71877
pGEM4Z/hTom40 Plasmid	-	-	Donated from Dr. M. T. Ryan, La Trobe University, Melbourne, Australia
pGMDH Plasmid	-	-	Donated from Dr. A. Strauss, Washington University School of Medicine
Phenol	Sigma	P4557
Phenol:Chloroform:Isoamyalcohol	Sigma	P3803	Can also be made with the ratio provided
Phosphorus Film	Fujifilm	BAS-IP MS 2025
Rabbit reticulocyte lysate	Promega	L4960	Avoid freeze-thaw; aliquot lysate upon arrival; amino acids are provided in the kit as well
RNAsin	Promega	N2311
Rotor for High Speed Centrifuge	Beckman Coulter	JA-25.50
SDS	BioShop	SDS001.500	Caution: harmful if ingested or inhaled, wear a mask.
Sodium acetate	Bioshop	SAA 304
Sodium Carbonate	VWR	BDH9284
Sodium salicylate	Millipore Sigma	106601
Sorbitol	Sigma	S6021
SP6 RNA Polymerase	Promega	P1085
Spectrophotometer	Thermo Fisher	Nanodrop 2000
Spermidine	Sigma	S-2626
Sucrose	BioShop	SUC507
T7 RNA Polymerase	Promega	P2075
Tabletop Centrifuge	Thermo Fisher	AccuSpin Micro 17
Trichloroacetic acid	Thermo Fisher	A322-500
Tris	BioShop	TRS001
β-mercaptoethanol	Sigma	M6250-100ML