İskelet Kas Mitokondrilerinin Protein İthalat Kapasitesinin Ölçümü

Özet

Mitokondri, iskelet kasında yüksek düzeyde fenotipik plastisite gösteren anahtar metabolik organellerdir. Sitozolden protein ithalatı, retikülün genişlemesi ve mitokondriyal fonksiyonun sürdürülmesi için gerekli olan organel biyogenez için kritik bir yoldur. Bu nedenle, protein ithalatı hücresel sağlığın barometresi olarak hizmet eder.

Özet

Mitokondri, enerji arzını ve hücrenin genel sağlığını belirleyen önemli metabolik ve düzenleyici organellerdir. İskelet kasında mitokondri, küçük oval organellerden geniş, retikülum benzeri bir ağa kadar bir dizi karmaşık morfolojide bulunur. Mitokondriyal retikülün enerji talebindeki değişiklikler gibi çeşitli uyaranlara yanıt olarak nasıl genişlediğini ve geliştiğini anlamak uzun zamandır bir araştırma konusudur. Bu büyümenin veya biyogenezin önemli bir yönü, başlangıçta nükleer genom tarafından kodlanan, sitozolde sentezlenen ve çeşitli mitokondriyal alt bölmelere dönüştürülen öncül proteinlerin ithalatıdır. Mitokondri, protein ithalat makineleri (PIM) olarak bilinen birçok seçici iç ve dış zar kanalını içeren bu ithalat süreci için sofistike bir mekanizma geliştirmiştir. Mitokondryona ithalat, uygulanabilir membran potansiyeline ve oksidatif fosforilasyon yoluyla organel türevi ATP'nin mevcudiyetine bağlıdır. Bu nedenle ölçümü organel sağlığının bir ölçüsü olarak hizmet edebilir. PIM ayrıca iskelet kasında hücrenin enerji durumuna sıkıca bağlı yüksek düzeyde adaptif plastisite sergiler. Örneğin, egzersiz eğitiminin ithalat kapasitesini artırdığı, kas disuse'un ise mitokondriyal içerik belirteçlerindeki değişikliklerle çakıştığı gösterilmiştir. Protein ithalatı mitokondrilerin biyogenezinde ve genişlemesinde kritik bir adım olmasına rağmen, iskelet kasında süreç yaygın olarak incelenmemektedir. Bu nedenle, bu makale, ilgili yöntemlerin daha iyi anlaşılmasını ve egzersiz, sağlık ve hastalıkta organel ciro için yolun öneminin takdirini teşvik etmek için protein ithalat kapasitesini ölçmek için iskelet kasından izole edilmiş ve tamamen işlevsel mitokondrilerin nasıl kullanılacağını özetlemektedir.

Giriş

Mitokondriler, farklı hücre tiplerindeki karmaşık morfolojilerde bulunan ve hücresel sağlık için kritik olan artan bir işlev dizisine sahip olduğu kabul edilen organellerdir. Bu nedenle, artık sadece enerji üreten organellere indirgenemezler. Mitokondriler, temel metabolik düzenleyiciler, hücre kaderinin belirleyicileri ve işlevleri genel hücresel sağlığın yararlı göstergeleri olarak hizmet edebilecek sinyal merkezleridir. İskelet kas hücrelerinde elektron mikroskopi çalışmaları, şu anda iskelet kası aktivite düzeylerindeki değişikliklerin yanı sıra yaş ve hastalıkla birlikte son derece dinamik ve uyarlanabilir olduğu kabul edilen bir bağlantı derecesi sergileyen coğrafi olarak farklı subsarkolemal (SS) ve intermyofibriller (IMF) mitokondrilerin varlığını ortaya koymaktadır. Kastaki mitokondriyal içerik ve fonksiyon çok sayıda şekilde ^{değerlendirilebilir5,6} ve hücresel milieu7,8'in etkisinden farklı mitokondrilerin solunum ve enzimatik kapasitelerini (Vmax) daha iyi anlamak için geleneksel organel izolasyon yöntemleri uygulanmıştır. Özellikle, bu geleneksel yöntemler, subsarkolemal ve intermiyofibriller bölgelerden izole edilen mitokondriler arasındaki ince biyokimyasal ayrımları ortaya çıkarmış ve bu hücre altı bölgelerde metabolizma için olası fonksiyonel etkileri ortaya çıkarmıştır8,9,10,11.

Mitokondri biyogenez, hem nükleer hem de mitokondriyal DNA'dan gen ürünlerinin katkısını gerektirmede benzersizdir. Bununla birlikte, bunların büyük çoğunluğu çekirdekten türetilmiştir, çünkü mtDNA transkripsiyonu sadece 13 proteinin sentezine yol açar. Mitokondri normalde çeşitli metabolik yollarda yer alan >1000 proteinden oluştuğundan, organel biyogenez, uygun stoichiometry ve fonksiyonu korumak için sitozolden çeşitli mitokondriyal alt bölmelere öncül proteinlerin sıkı bir şekilde düzenlenmiş bir ithalat ve montaj aracı ^{gerektirir12,13}. Mitokondrilere yönelik nükleer kodlanmış proteinler normalde onları organellere hedefleyen ve alt bölümler arası lokalizasyonlarını kolaylaştıran bir mitokondriyal hedefleme dizisi (MTS) taşırlar. Matrise bağlı proteinlerin çoğu bölünebilir bir N-terminal MTS içerirken, dış veya iç mitokondriyal membran için uygun olanlar genellikle iç hedefleme alanlarına ^sahiptir14. İthalat işlemi, ^organel13'e giriş için birden fazla yol sağlayan bir dizi farklı kanal tarafından gerçekleştirilir. Dış membran (TOM) kompleksinin translokazı, sitozolden iç zar (Tİm) kompleksinin translokazı tarafından tanındıkları intermembran uzayına öncüller. Bu kompleks, proteazların N-terminali hedefleme ön sırasını ayırdığı matrise nükleer kodlanmış öncüllerin içe aktarıcılarından sorumludur. Dış zara yönelik proteinler tom kompleksi aracılığıyla doğrudan bu zara yerleştirilebilirken, iç zara yönelik olanlar bir TIM proteini, özellikle TIM22 tarafından yerleştirilir. İthalatlarından sonra, proteinler yerleşik proteazlar ve refakatçiler tarafından daha fazla işlenir ve genellikle elektron taşıma zincirinde bulunanlar gibi daha büyük kompleksler oluşturmak için birleştirilir.

Mitokondriyal protein ithalatının kendisi de mitokondriyal sağlığın bir ölçümü olarak hizmet eder, çünkü bu işlem membran potansiyelinin varlığına ve ^ATP15 şeklinde bir enerji kaynağına dayanır. Örneğin, membran potansiyeli dağıldığında, protein kinaz PINK1 organel tarafından alınamaz ve bu, mitophagy16,17 adı verilen bir yoldan organeldeki bozulmanın başlangıcını tetikleyen fosforilasyon sinyallerine yol açar. Benzer durumlarda, ithalat engellendiğinde, ATF5 proteini organel içine giremez ve daha sonra UPR gen ekspresyonunun yukarı regülasyonu için bir transkripsiyon faktörü olarak hizmet ettiği çekirdeğe yer ^{değişir18,19}. Bu nedenle, protein ithalat verimliliğini ölçmek organel sağlığı hakkında kapsamlı bir içgörü sağlarken, gen ekspresyon yanıtı çekirdeğe retrograd sinyal verme derecesini belirtmek için kullanılabilir.

Mitokondri biyogenezinin ve genel olarak hücresel sağlığın bariz önemine rağmen, memeli mitokondrilerinde ithalat yolu dikkat çekici bir şekilde yetersizdir. Bu raporda, öncül proteinlerin iskelet kası mitokondrilerine ithalatının ölçülmesinde yer alan belirli adımları açıklar ve ithalat sisteminin kas ve disuse değişikliklere adaptif tepkisini göstermek için veriler sağlayarak, protein ithalatının iskelet kasının adaptif plastisitesine katkısını gösterir.

Protokol

Bu deneylerde kullanılan tüm hayvanların bakımı York Üniversitesi'ndeki hayvan bakımevindedir. Deneyler, York Üniversitesi Hayvan Bakım Komitesi'nin onayıyla Kanada Hayvan Bakımı Konseyi yönergelerine uygun olarak gerçekleştirilir (İzin: 2017-08).

1. İskelet kasından subsarkolemal ve intermyofibriller mitokondrilerin fonksiyonel izolasyonu

1. Reaktif hazırlama:
   1. Tablo 1'de belirtildiği gibi tüm arabellekleri ve ortamları hazırlayın.
   2. Tamponları pH 7.4 olarak ayarlayın ve nagrase proteaz hariç 4 °C'de (2 haftaya kadar) saklayın.
   3. Her seferinde taze nagarse proteaz (Tablo 1) hazırlayın.
2. Doku alma ve kıyma
   NOT: Mitokondrilerin izolasyonu için aşağıdaki adımların bir akış çizelgesi Şekil 1'de verilmiştir.
   1. Bir cam scintillation şişeyi ~20 mL Tampon 1 (Tablo 1) ile doldurun ve buza yerleştirin.
   2. Fare anestezi altındayken, iskelet kaslarını (tibialis ön, kuadriseps, gastrocnemius vb.), yaklaşık 500-1000 mg hasat edin ve kasları soğutulmuş Tampon 1 içeren scintillation şişesine yerleştirin.
      NOT: Gazlı izofluran, 0,4 L O2/dk akış hızında %_2,5 oranında anestezik olarak kullanılır. Hayvanın yanıt vermemesini sağlamak için bir çimdik testi yapılır.
   3. Doku toplanmasından sonra, servikal çıkık yoluyla hayvanı ötenazi yapın.
   4. Buzda bir saat bardağı önceden soğutun. Kaslardan herhangi bir yağ veya bağ dokusunu çıkarın ve homojen bir bulamaç olana kadar saat camındaki dokuyu kıydırın.
   5. Kıyılmış dokuyu önceden soğutulmuş 50 mL plastik santrifüj tüpüne yerleştirin (bkz. Malzeme Tablosu) ve tam ağırlığı kaydedin.
   6. Kıyılmış dokuyu Tampon 1 + ATP (Tablo 1) ile 10 kat seyreltin.
   7. 10 s için 9,8 Hz güç çıkışında 8 mm çift bıçaklı homojenizatör (bkz. Malzeme Tablosu) kullanarak kas örneğini homojenize edin ve görünür kas parçalarının kalmamasını sağlayın.
   8. Numuneleri 800 x g'da yüksek hızlı bir santrifüj kullanarak 10 dakika boyunca santrifüj edin (bkz. Malzeme Tablosu).
      NOT: Bu adımın amacı SS ve IMF mitokondriyal fraksiyonlarını ayırmaktır. Süpernat SS mitokondri içerirken, pelet IMF mitokondri içerir.
3. SS mitokondriyal izolasyonu
   1. Büyük kalıntıları veya kirleticileri gidermek için üst tabakayı tek bir peynir örtüsü tabakasından başka bir 50 mL plastik santrifüj tüpü kümesine filtreleyin.
   2. Yüksek hızlı bir santrifüj kullanarak 4 °C'de 10 dakika boyunca 9.000 x g'da süpernatı santrifüj edin.
   3. Üstnatı atın ve peletin 3,5 mL Tampon 1 + ATP'de yeniden kullanılabilir.
      NOT: P1000 ile yeniden biriktirin ve bunu dikkatlice yapın. Mitokondriler kırılgan organellerdir. Hafifçe gerçekleştirin ve pipet ucuyla peletin dokunmasını önlayın.
   4. Numuneyi 9.000 x g'da 4 °C'de 10 dakika boyunca yüksek hızlı bir santrifüj kullanarak santrifüj edin.
   5. Çekirdek, mitokondri ve diğer organellerden yoksun bir sitosolik fraksiyonu izole etmek için daha fazla işlem istenmediği sürece süpernatı atın. Peletin P200 pipet kullanarak resüspenzyon ortamının (Tablo 1) kabaca 95 μL'sinde dikkatlice yeniden biriktirin.
      NOT: 1.3.3. adıma benzer şekilde, pipet ucuyla peletin dokunmasından kaçının. Resüspensyon ortamının hacmi peletin büyüklüğüne bağlı olarak değiştirilebilir. Bu, IMF fraksiyonu izole edilene kadar buz üzerinde saklanabilen SS mitokondriyal fraksiyonudur. İstenirse, organellerden yoksun sitosolik fraksiyon, süpernatı bir ultrasantrifüjde 100.000 x g'da santrifüj ederek izole edilebilir (bkz. Malzeme Tablosu) ve daha sonra pelet atılabilir.
4. IMF mitokondriyal izolasyonu
   1. Tampon 1 + ATP'de peleti adım 1.2.8'den 10 kat seyreltin. Numune tutarlı olana kadar pelet ve tamponu hafifçe karıştırarak bir Teflon pestle kullanarak yeniden depolayın.
   2. Numuneyi 10 sn için 9,8 Hz güç çıkışında 8 mm çift bıçaklı homojenizatör (bkz. Malzeme Tablosu) kullanarak homojenize edin.
   3. Numuneyi 800 x g'da 4 °C'de 10 dakika boyunca yüksek hızlı bir santrifüj kullanarak santrifüj edin.
   4. Süpernate atın ve Tampon 2 kullanarak IMF mitokondriyal pelet 10 kat seyreltin ve homojen olana kadar hafifçe karıştırarak Teflon pestle kullanarak yeniden dürt.
   5. 10 mg/mL nagarse proteaz (Tablo 1) için 25 μL/g doku ekleyin ve santrifüj tüpünü buzun üzerine yerleştirin, tüpü yan yana sallayarak her dakika hafifçe karıştırın.
      NOT: Nagarse ilavesi, miyofibrillerin sınırlı sindirimini gerçekleştirerek IMF mitokondrisinin özgürleştirilmesine yardımcı olur.
   6. 5 dakika sonra, nagarse proteazını hareketsizlik noktasına seyreltmek ve sindirimi durdurmak için 20 mL Tampon 2 (Tablo 1) ekleyin.
   7. Numuneyi yüksek hızlı bir santrifüj kullanarak 4 °C'de 5 dakika boyunca 5.000 x g'da hemen santrifüj edin.
   8. Üstnat atın ve Tampon 2 kullanarak peleti 10 kat seyreltin ve hafifçe karıştırarak bir Teflon pestle kullanarak yeniden ıslatın.
   9. Lifli malzemeyi peletmek için numuneyi 800 x g'da 4 °C'de 15 dakika santrifüj edin.
   10. Süpernatı 50 mL plastik santrifüj tüplerinden oluşan yeni bir sete dökün, atılabilen peletin bozulmamasına dikkat edin.
   11. Numuneyi 1.4.7 adımında olduğu gibi 4 °C'de 10 dakika boyunca 9.000 x g'da santrifüj edin.
   12. Üstnat atın, 3,5 mL Tampon 2 ekleyin ve peleti bir P1000 pipet kullanarak hafifçe yeniden biriktirin.
   13. Numuneyi 1.4.7 adımında olduğu gibi 4 °C'de 10 dakika boyunca 9.000 x g'da santrifüj edin.
   14. Süpernate atın ve peleti bir P200 pipet kullanarak kabaca 180 μL resüspenzyon ortamı ile hafifçe yeniden biriktirin.
       NOT: Resüspensyon ortamının hacmi peletin boyutuna bağlı olarak değiştirilebilir. Bu, ithalat tahlilinde kullanılacak kadar buz üzerinde saklanabilen IMF mitokondriyal fraksiyonudur.

2. Mitokondriyal protein ithalatı

1. In vitro transkripsiyon
   NOT: Bu sonraki adımlar, radyo etiketli bir proteinin ithalat için nasıl hazırlanacağını özetler. Araştırılan ithalat yolu, örneğin mitokondriyal matrise ithalatı değerlendirmek için hedef protein seçimini dikte edebilir, ornitin karbamil transferaz, OCT ve malat dehidrogenaz, MDH yaygın olarak kullanılırken, Tom40 genellikle dış mitokondriyal membran içine ithalatın bir göstergesi olarak kullanılır. Aşağıdaki adımlar için, tercih edilen proteini kodlayan plazmid DNA gereklidir. Plazmid DNA'sının transkripsiyonu ayrı bir günde mitokondriyal izolasyondan önce yapılabilir ve bu deneyden toplanan mRNA gelecekteki çeviri ve ithalat deneylerinde saklanabilir ve kullanılabilir.
   1. DNA'yı doğrusallaştırın: 40 μL plazmid DNA (5 μg/μL), 5 μL 10x enzim tamponu ve 5 μL kısıtlama enzimini birleştirin ve 37 °C'de 30 dakika kuluçkaya yatın.
      NOT: Kullanılan kısıtlama enzimleri plazmidlere göre değişebilir, bu da farklı bir enzim tamponu gerektirebilir ve şablon yukarı veya aşağı ölçeklendirilebildiği için deneysel koşullar DNA herhangi bir miktarda / hacimde kullanılabilir.
   2. Fenol ve etanol kullanarak doğrusallaştırılmış DNA'yı arındırın ve çökeltin. Sonraki tüm adımları (2.1.3-2.1.15) steril 1.5 mL tüplerde gerçekleştirin ve santrifüj adımları için bir masa üstü santrifüj kullanın (bkz. Malzeme Masası).
   3. Son hacmin 400 μL'ye eşit olması için uygun steril _H2O hacmini ekleyin. Ardından, 400 μL fenol ekleyin.
   4. ~10 sn için ters çevirme ile kuvvetlice karıştırın ve 4 °C'de 1 dakika boyunca 17.000 x g'da santrifüj. Geri çekilin ve üst aşamayı kaydedin.
   5. 400 μL fenol ekleyin:kloroform:izoamylalcohol (25:24:1, v:v:v).
   6. ~10 sn için ters çevirme ile kuvvetlice karıştırın ve 4 °C'de 1 dakika boyunca 17.000 g'da santrifüj. Geri çekilin ve üst aşamayı kaydedin.
   7. 400 μL kloroform ekleyin:izoamylalcohol (24:1, v:v).
   8. ~10 sn için ters çevirme ile kuvvetlice karıştırın ve 4 °C'de 1 dakika boyunca 17.000 g'da santrifüj. Geri çekilin ve üst aşamayı kaydedin.
   9. 40 μL 3M sodyum asetat (pH 7.0) ekleyin ve 1 mL% 95 etanol ekleyin.
   10. Steril 1,5 mL tüpleri -80 °C dondurucuya 15 dakika boyunca yanlarına yerleştirin.
   11. Numuneleri 17.000 x g'da 4 °C'de 10 dakika santrifüj edin.
   12. Süpernate atın ve peletin% 80 etanol 300 μL ile yıkayın.
   13. Numuneleri 17.000 x g'da 4 °C'de 2 dakika santrifüj edin.
   14. Üst salnat atın ve peletin havayla kurutun. Pelet kurudıktan sonra net olmalıdır.
   15. Peletin 20 μL steril _H2O'da yeniden süzülmesi
   16. Spektrofotometre kullanarak DNA konsantrasyonunu ölçün (bkz. Malzeme Tablosu) ve _A260:280 oranının 1,8'in üzerinde olduğundan emin olun.
   17. DNA'yı steril _H2O'da 0,8 μg/μL konsantrasyona seyreltin.
   18. DNA'yı yazıya dökün: Plazmidi birleştirin (0,8 μg/μL, 60,8 μL), steril _H2O (8,4 μL), 10 mM NTP (5,2 μL), 10 mM ATP ( 10,0 μL), 1 mM M-7-G (11,6 μL), belirtildiği gibi karışım adım 2.1.19 (15.6 μL), RNAsin (5.2 μL) ve uygun bir RNA polimeraz (4.8 μL) "bir reaksiyon karışımı" (toplam hacim = 121,6 μL) oluşturur ve polimeraz için optimum sıcaklıkta 90 dakika kuluçkaya yaslayın (T7 polimeraz için 37 °C); SP6 polimeraz için 40 °C)
   19. Karışımı hazırlamak için 200 μL 1M HEPES (pH 7.9), 100 μL 1 M _MgAc2, 500 μL 4 M KAc, 100 μL 20 mM spermidin, 100 μL 0.5 M DTT ve 200 μL steril _H20 ekleyin.
       NOT: Reaktiflerin sağlanan oranları korunduğunda reaksiyon hacim olarak yukarı veya aşağı ölçeklendirilebilir. Kullanılan RNA polimeraz, kullanılan plazmid içindeki bakteriyel promotör dizisi tarafından dikte edilir.
   20. Daha sonra, 2.1.2-2.1.15 adımlarında olduğu gibi fenol ve etanol kullanarak mRNA'yı arındırın ve çökeltin. Steril _H2O ile hacmi 400 μL'ye kadar getirin (280 μL ekleyin) ve 2.1.2-2.1.15 adımlarında açıklandığı gibi devam edin. Son peletin 20 μL steril _H2O'da yeniden süzülmesi.
   21. Spektrofotometre kullanarak mRNA konsantrasyonunu ölçün, _A260:280 oranının ~2.0 olduğundan emin olun.
   22. mRNA'yı _steril H2O'da 2,8 μg/μL'ye seyreltin ve 50 μL aliquots'ta -20 °C'de saklayın.
2. In vitro çeviri
   NOT: İstenilen DNA'nın çevirisi ithalat deneyinin aynı günü yapılmalıdır. Bu deney radyolabelli amino asitlerin kullanılmasını gerektirir ve bu nedenle kullanıcının radyoisotopların kullanımı için bir izni olmalıdır ve tüm kullanım ve bertaraf kurumun politikalarına / gereksinimlerine uygun olmalıdır. Radyoizotop güvenlik önlemlerini içeren adımlar, büyük olasılıkla kuruma göre farklılık gösterecekleri için kısa bir süre atlanmış veya tanımlanmıştır.
   1. İthalat deneyinde kullanılacak mitokondri örneği başına ~20 μL sağlamak ve bir çeviri şeridi için aynı hacmi dahil etmek için yeterli çeviri reaksiyon karışımı (Tablo 2) hazırlayın.
   2. Reaksiyonun 30 °C'de 30 dakika kuluçkaya yatması (zaman mRNA ile değişebilir, 25-60 dk).
   3. 35S-metiyonin kullanımını kurumun radyoaktif güvenlik gereksinimlerine göre kaydedin ve kurumun yönergelerine göre radyoizotopla temas eden her şeyi atın.
3. Protein ithalatı
   NOT: Sonraki adımlar için yeni izole mitokondri gereklidir. Mitokondriyal izolasyon protokolüne bakın. Mitokondriler uygulanabilir ve işlevsel olduğu sürece diğer izolasyon yöntemleri kullanılabilir. Sonraki adımlar için, kullanılan mitokondriyal örnekler yukarıda açıklandığı gibi bir resüspenzyon tamponunda yeniden kullanılır (Tablo 1). İthalat testine başlamadan önce mitokondriyal numunenin protein konsantrasyonu da ölçülmelidir.
   1. Çeviri reaksiyonunun başlamasından yaklaşık 15 dakika sonra, steril 1,5 mL tüplere aliquot 90 μg mitokondri ve ~10 dakika boyunca 30 °C'de önceden kuluçkaya yatır.
      NOT: Aliquot deneyde gerçekten kullanılacak olandan daha fazla mitokondri; sadece 75 μg gerçekten kullanılacaktır. Ancak, fazla miktarda aliquoting bir gereklilik değildir.
   2. Steril 1,5 mL tüplerden oluşan yeni bir sette, 75 μg mitokondriyi 18 μL çeviri reaksiyonla birleştirin ve istenen süre boyunca 30 °C'de kuluçkaya yatırın.
   3. Çeviri reaksiyonunun kalan hacmini buzda tutun; bu daha sonra kullanılacaktır.
      NOT: İthalat zamana bağlı bir süreçtir, bu nedenle kuluçka süreleri 1-60 dakika arasında değişen bir zaman kursu denemesi ile başlamak ihtiyatlı olabilir. Tipik bir reaksiyon süresi 30 dakikadır.
   4. Bu süre zarfında, 1 g sakkaroz, 200 μL 2,5 M KCl, 10 μL 1 M _MgCl2, 100 μL 1 M HEPES (pH 7,4) birleştirerek sakkaroz yastığını hazırlayın ve steril _H2O kullanarak hacmi 5 mL'ye getirin.
   5. İthalat reaksiyonunda her tüpe karşılık gelen yeni bir steril 1,5 mL tüp seti hazırlayın. Sakkaroz yastığının aliquot 600 μL'si her tüpe girer ve ithalat reaksiyonu bitene kadar buzda tutun.
   6. İthalat reaksiyonunu uygun kuluçka süresinden sonra sonlandırmak için, tüpü 30 ° C'den çıkarın, buza yerleştirin ve ardından ithalat reaksiyonunu sakkaroz yastığı ile tüpün üzerine dikkatlice aktarın.
      NOT: Mitokondrilerin zarar görmemesi/yırtılması için bu adımın çok yavaş yapılması gerekir. Sakkaroz yastığı, mitokondrilerin göçünü yavaşlatmaya yardımcı olur ve sonraki santrifüj adımı sırasında tüpün dibine inişini "yastıklar".
   7. Numuneleri santrifüj + sakkaroz yastığı 17.000 x g'da 4 °C'de 15 dakika boyunca santrifüj edin.
   8. 25 mL 2,4 M sorbitol, 2 mL 1 M HEPES (pH 7,4) ve 72 mL çift damıtılmış _H2O birleştirerek kırılma tamponu hazırlayın.
   9. SDS-PAGE jel elektroforezi için lizis tamponu hazırlayın: 50 mL ısıtılmış gliserol, 11,5 g SDS, 31,25 mL 1 M Tris (pH 6,8) birleştirin ve hacmi çift damıtılmış _H2O ile 500 mL'ye getirin.
   10. Numune hazırlama için, 475 μL lizis tamponu daha sonraki bir adımda kullanılmak üzere 25 μL β-mercaptoethanol ile karıştırın.
       NOT: Lizis tamponu önceden yapılabilir ve oda sıcaklığında saklanabilir; ancak, β-mercaptoethanol ilavesi taze yapılmalıdır.
   11. Bir P1000 pipet kullanarak, süpernat'ı dikkatlice çıkarın ve peletin rahatsız etmeyin. Süpernatı uygun bir radyoaktif atık kabına atın.
   12. Dış zara ithal etmek için, Tom40 kullanarak bunu gerçekleştirin, peletin 50 μL taze hazırlanmış 0,1 M sodyum karbonat (pH 11,5) ile yeniden biriktirin ve 30 dakika boyunca buz üzerinde kuluçkaya yatırın.
   13. Kuluçkadan sonra, numuneyi 4 °C'de 5 dakika boyunca 14.000 x g santrifüj edin. Bu adım sadece dış zar içe aktarma reaksiyonları için yapılır.
   14. SDS-PAGE elektroforezi için numuneleri hazırlamak için, 20 μL kırma tamponu, 20 μL lizis tamponu ve β-mercaptoethanol ekleyin ve iyice yeniden kullanın. 5 μL numune boyası ekleyin.
   15. 2.3.3 adımından kalan çeviri reaksiyonunun 3 μL'sini 37 μL lizis tamponu ve 5 μL numune boyası ile birleştirerek kontrol/çeviri şeridini hazırlayın. İyice karıştırın.
   16. Numuneleri 95 °C'de 5 dakika kaynatın ve mitokondrileri saçmaktan kaçınmak için düşük hızda hafifçe aşağı doğru döndürün.
   17. Numuneleri bir SDS poliakrilamid jeline uygulayın.
       NOT: Jel yüzdesi ve sonraki çalışma süresi, hangi proteinin ithal edildiğine bağlı olacaktır. Örneğin, OCT 37 kDa'dır ve olgun işlenmiş bandı biraz daha küçüktür; bu nedenle,% 12 jel bu bantların iyi ayrılmasını sağlar.
   18. Elektroforez tamamlandıktan sonra jeli çıkarın ve çift damıtılmış _H2O'ya yerleştirin.
   19. Jeli% 5 TCA'da 5 dakika boyunca duman kaputunda kaynatın, çatlamayı önlemek için jeli sürekli karıştırın / hareket ettinin.
       NOT: TCA, görselleştirme için jelin katılaşmasına yardımcı olur; bu, Bunsen brülörü üzerinde metal bir tepside yapılabilir. Jeli cömertçe örtmek için yeterli TCA kullanın, ~1/2 dolu.
   20. Jeli çıkarın ve çift damıtılmış _H2O'ya geri yerleştirin.
   21. Jeli 10 mM Tris'te ~ 50 rpm'de 5 dakika dönen bir plakada yıkayın, yine jeli cömertçe örtmek için yeterli kullanarak, kabın ~ 1/2'si.
   22. Jeli 1 M Salisiklik asit içinde 30 dakika boyunca dönen bir plakada yıkayarak, yine jeli cömertçe örtmek için yeterli Salisilik asit kullanarak proteini çökeltin, kullanılan kabın ~ 1/2'si.
   23. 2.3.24-2.3.31 adımlarında açıklandığı gibi jeli susuzlun.
       NOT: Bu çeşitli şekillerde yapılabilir. Jel kurutucu (bkz. Malzeme Tablosu) zaman verimli bir seçenek sunar (aşağıda açıklanmıştır); ancak daha uygun maliyetli ancak daha zaman alıcı olabilecek diğer ticari yöntemler/kitler kullanılabilir. Jel kurutma kitleri, ısı veya emme uygulaması gerektirmeyen, bunun yerine bozulmayı önlemek için jelin selofan levhalar arasında havayla kurumasını sağlayan bir alternatif olarak kullanılabilir.
   24. Jel kurutucunun gözenekli yatağına büyük bir lekeleme kağıdı yerleştirin. Jelin uygulanacağı alana bir yaprak kağıt havlu yerleştirin.
   25. 15 cm x 20 cm'lik bir şişkinlik kağıdı kesin ve kağıt havluya yerleştirin.
   26. 15 cm x 20 cm'lik ikinci bir kağıt parçası kullanarak jeli kaptan çıkar ve ilk parçanın üzerine düz bir şekilde yerleştirin.
   27. Biraz daha büyük bir plastik sargı parçası olan ~20 cm x 25 cm kesin ve jel üzerine yerleştirin, sargının altında kırışıklık veya kabarcık olmamasını sağlayın.
       NOT: Bu birkaç deneme sürebilir, ancak sıkışmış hava ceplerinin olmaması zorunludur.
   28. Jel kurutucunun plastik kapağını yavaşça sargının üzerine koyun, tekrar kabarcık veya kırışıklık olmamasını sağlayın.
   29. Pompayı/vakumyu açın ve plastik kapağın bir conta oluşturduğundan emin olun. Plastik kapağın bir köşesini kaldırarak mührü test edin ve yeniden mühürlemesini bekleyin.
   30. Jel kurutucuyu kapatın ve 90 dakika çalıştırın. Sıcaklığı 30 °C'de başlayacak şekilde ayarlayın, kademeli olarak 80 °C'ye ulaşın ve koşunun sonunda 30 °C'ye geri dönün.
   31. Susuz kaldıktan sonra jel katılaşmalı ve kağıt inceliğinde hissedecektir. Jeli kurutma işleminde kullanılan plastik sargıya sarın.
   32. Susuz jeli fosfor filmi olan bir film kasetine yerleştirin (bkz. Malzeme Tablosu), beyaz tarafı jelle bakacak şekilde. Pozlama süreleri değişir, ancak bantların görselleştirilmesi için 24-48 saat olabilir.
   33. Fosfor görüntüleme yapabilen uygun bir görüntüleyiç kullanarak otoradyografi kullanarak görselleştirin.

Sonuçlar

Bu protokolün fonksiyonel ve sağlam izole iskelet kası mitokondrilerine ithalat oranını belirlemek için geçerli bir test olduğunu kapsamlı bir şekilde gösterdik. Tedavi edilmeyen koşullara kıyasla, malat dehidrogenaz (MDH) gibi tipik öncül proteinlerin matrise ithal edilmesi membran potansiyeline duyarlıdır, çünkü bir solunum zinciri uncoupler olan valinomycin tarafından inhibe edilebilir (Şekil 2A). Triton X-100 deterjanı varlığında mitokondriyal i...

Tartışmalar

Mitokondriler, hücreler içindeki sentezleri ve genişlemeleri için hem nükleer hem de mitokondriyal genomların ifade ve koordinasyonuna benzersiz bir şekilde bağlıdır. Bununla birlikte, nükleer genom mitokondriyal proteomun büyük çoğunluğunu (%99) kodlar ve bu, protein ithalat makinelerinin mitokondriyal biyogenezin desteklenmesindeki öneminin altını çizmektedir. İthalat aynı zamanda önemli bir sinyal olayı olarak hizmet eder, çünkü ithalat başarısızlığı, katlanmış protein yanıtının v...

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.2% BSA	Sigma	A2153
35S-methionine	Perkin Elmer	NEG709A500UC	Purchase requires a valid radioisotope permit
ATP	Sigma	A7699
Blotting paper; Whatman 3MM CHR Paper	Thermo Fisher	05-714-5
Cassette for film	Kodak	Kodak Xomatic
Centrifugation Tube	Thermo Fisher	3138-0050
Chloroform	Thermo Fisher	C298-4
DTT	Sigma	D9779-5G
EDTA	BioShop	EDT002
EGTA	Sigma	E4378
Gel Dryer	BioRad	Model 583
Gel Drying Kit	Sigma or BioRad	Z377570-1PAK or OW-GDF-10	Various options are commercially available through many companies, these are just as few examples.
Glycerol	Caledon Laboratory Chemicals	5350-1-40
HEPES	Sigma	H3375
High Speed Centrifuge	Beckman Coulter	Avanti J-25 Centrifuge
Homogenizer	IKA	T25 Digital Ultra Turrex
Isoamylalcohol, or 3-methylbutanol	Sigma	I9392
KAc	BioShop	POA301.500
KCl	Sigma	P3911
M7G	New England Biolab	S1404S	Dilute with 1000ul 20mM HEPES to make 1mM stock
MgCl	BioShop	MAG510
MgSO4	Thermo Fisher	M65-500
MOPS	BioShop	MOP001
NaCl	BioShop	SOD001
NTP	Thermo Fisher	R0191
OCT Plasmid	-	-	Donated from Dr. G. C. Shore, McGill University, Montreal, Canada; alternative available through Addgene, plasmid #71877
pGEM4Z/hTom40 Plasmid	-	-	Donated from Dr. M. T. Ryan, La Trobe University, Melbourne, Australia
pGMDH Plasmid	-	-	Donated from Dr. A. Strauss, Washington University School of Medicine
Phenol	Sigma	P4557
Phenol:Chloroform:Isoamyalcohol	Sigma	P3803	Can also be made with the ratio provided
Phosphorus Film	Fujifilm	BAS-IP MS 2025
Rabbit reticulocyte lysate	Promega	L4960	Avoid freeze-thaw; aliquot lysate upon arrival; amino acids are provided in the kit as well
RNAsin	Promega	N2311
Rotor for High Speed Centrifuge	Beckman Coulter	JA-25.50
SDS	BioShop	SDS001.500	Caution: harmful if ingested or inhaled, wear a mask.
Sodium acetate	Bioshop	SAA 304
Sodium Carbonate	VWR	BDH9284
Sodium salicylate	Millipore Sigma	106601
Sorbitol	Sigma	S6021
SP6 RNA Polymerase	Promega	P1085
Spectrophotometer	Thermo Fisher	Nanodrop 2000
Spermidine	Sigma	S-2626
Sucrose	BioShop	SUC507
T7 RNA Polymerase	Promega	P2075
Tabletop Centrifuge	Thermo Fisher	AccuSpin Micro 17
Trichloroacetic acid	Thermo Fisher	A322-500
Tris	BioShop	TRS001
β-mercaptoethanol	Sigma	M6250-100ML