طريقة كهربية فعالة وفعالة من حيث التكلفة لدراسة مسارات الإشارات الأولية المعتمدة على السيليوم في سلائف الخلايا الحبيبية

Summary

هنا ، نقدم بروتوكولا كهربائيا قابلا للتكرار في المختبر للتلاعب الجيني بسلائف الخلايا الحبيبية المخيخية الأولية (GCPs) وهو فعال من حيث التكلفة وفعال وقابل للحياة. علاوة على ذلك ، يوضح هذا البروتوكول أيضا طريقة مباشرة للدراسة الجزيئية لمسارات إشارات القنفذ الأولية المعتمدة على السيليوم في خلايا GCP الأولية.

Abstract

السيليوم الأولي هو عضية إشارات حرجة موجودة في كل خلية تقريبا تنقل محفزات إشارات القنفذ (Hh) من سطح الخلية. في سلائف الخلايا الحبيبية (GCP) ، يعمل السيليوم الأولي كمركز إشارات محوري ينظم تكاثر خلايا السلائف عن طريق تعديل مسار إشارات Hh. يتم تسهيل التحقيق في آلية إشارات Hh الأولية المعتمدة على السيليوم من خلال التلاعب الجيني في المختبر لمكونات المسار لتصور توطينها الديناميكي إلى السيليوم الأولي. ومع ذلك ، فإن نقل الجينات المحورة في الثقافات الأولية ل GCPs باستخدام طرق electroporation المعروفة حاليا مكلف بشكل عام وغالبا ما يؤدي إلى انخفاض صلاحية الخلايا وكفاءة النقل غير المرغوب فيها. تقدم هذه الورقة بروتوكولا كهربائيا فعالا وفعالا من حيث التكلفة وبسيطا يوضح كفاءة نقل عالية تبلغ ~ 80-90٪ وجدوى الخلية المثلى. هذه طريقة تعديل وراثي بسيطة وقابلة للتكرار وفعالة تنطبق على دراسة مسار إشارات القنفذ الأولي المعتمد على السيليوم في مزارع GCP الأولية.

Introduction

تستخدم GCPs المخيخية على نطاق واسع لدراسة آلية مسار إشارات Hh في أنواع الخلايا السلفية العصبية بسبب وفرتها العالية وحساسيتها العالية لمسار إشارات Hh في الجسم الحي1,2,3,4. في GCPs ، يعمل السيليوم الأولي كمركز محوري لنقل إشارة ^Hh5 الذي ينظم تكاثر خلايا السلائف6,7,8. غالبا ما يكون التصور المختبري لمكونات إشارات Hh على السيليوم الأساسي أمرا صعبا بسبب انخفاض مستوياتها القاعدية الذاتية. وبالتالي ، فإن تعديل الجينات المحورة لمستويات التعبير عن البروتين ووضع علامات الفلوروفور على الجين محل الاهتمام هي طرق مفيدة لدراسة المسار بدقة جزيئية. ومع ذلك، فإن التلاعب الجيني بالمزارع الأولية لبرنامج GCP باستخدام نهج النقل القائمة على الجسيمات الشحمية غالبا ما يؤدي إلى انخفاض كفاءة النقل، مما يعوق إجراء المزيد من التحقيقات ^{الجزيئية9}. يزيد التفريغ الكهربائي من الكفاءة ولكنه يتطلب عادة كواشف كهربائية باهظة خاصة بالبائع ومقيدة بنوع ^{الخلية10}.

تقدم هذه الورقة طريقة كهربية عالية الكفاءة وفعالة من حيث التكلفة لمعالجة مكونات مسار إشارات Hh في الثقافات الأولية ل GCP. باستخدام بروتوكول الإلكتروبوراتيون المعدل هذا، تم تسليم بروتين الفلورسنت الأخضر (GFP) الموسوم بالجين المتحول السلس (pEGFP-Smo) بكفاءة إلى GCPs وحقق معدلات عالية من بقاء الخلايا ونقلها (80-90٪). وعلاوة على ذلك، وكما يتضح من التلطيخ الكيميائي المناعي، أظهرت GCPs المنقولة حساسية عالية للتنشيط الناجم عن الناهض السلس لمسار إشارات Hh عن طريق الاتجار ب EGFP-Smo إلى الأهداب الأولية. يجب أن يكون هذا البروتوكول قابلا للتطبيق بشكل مباشر ومفيدا للتجارب التي تنطوي في المختبر على تعديل جيني لأنواع الخلايا التي يصعب نقلها ، مثل مزارع الخلايا الأولية البشرية والقوارض ، وكذلك الخلايا الجذعية متعددة القدرات التي يسببها الإنسان.

Protocol

تم تنفيذ جميع الإجراءات المتعلقة بالحيوانات وفقا للمبادئ التوجيهية للتعامل مع الحيوانات والبروتوكول الذي وافقت عليه وزارة الصحة في هونغ كونغ. تم الحصول على تراخيص التجارب على الحيوانات بعد قانون الحيوانات (مراقبة التجارب) (الفصل 340) من وزارة الصحة ، حكومة هونغ كونغ. تم تنفيذ العمل الحيواني وفقا لأخلاقيات سلامة الحيوان المعتمدة من قبل مكتب أبحاث HKBU ولجنة سلامة المختبرات. راجع جدول المواد للحصول على تفاصيل حول جميع المواد المستخدمة في هذا البروتوكول.

1. إعداد ما قبل التجربة

1. إعداد وسائل الإعلام الثقافية والحواجز
   1. وسط خال من المصل (SFM)
      1. لإعداد 50 مل من SFM ، أضف 500 ميكرولتر من 100x L-glutamine بديل ، و 500 ميكرولتر من البنسلين الستربتومايسين ، و 1 mM من بيروفات الصوديوم ، و 12.5 ميكرولتر من 1 M KCl (النهائي 250 ميكرومتر) إلى 49 مل من الوسط العصبي القاعدي.
      2. قسم SFM إلى 2 درجة حرارة من 10 مل و 40 مل في أنابيب مخروطية سعة 50 مل وقم بتخزينها عند 4 درجات مئوية لمدة تصل إلى شهر واحد.
   2. وسيط حجب الهضم: 10٪ FBS في SFM
      1. أضف 1.1 مل من FBS المعطل للحرارة إلى 10 مل من SFM لإعداد وسط مانع للهضم.
   3. وسيط ثقافة GCP: SFM مع B27
      1. لتحضير وسط زراعة GCP، أضف 800 ميكرولتر من مكمل B-27 الخالي من المصل إلى 40 مل من SFM.
         ملاحظة: يمكن تخزين SFM المكمل B-27 عند 4 درجات مئوية لمدة تصل إلى شهر واحد. ومع ذلك ، فإن وسائل الإعلام المعدة حديثا تنتج نتائج مثالية.
   4. المخزن المؤقت للتشريح: EBSS مع الجلوكوز + HEPES
      1. أضف 6 جم / لتر من الجلوكوز إلى محلول الملح المتوازن الخالي من الكالسيوم والمغنيسيوم (EBSS) الذي يحتوي على 10 mM HEPES (4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid).
      2. تعقيم المحلول عن طريق المرور عبر مرشح حقنة 0.2 ميكرومتر وتخزينه عند 4 درجات مئوية للتخزين على المدى الطويل.
   5. المخزن المؤقت للهضم
      ملاحظة: تحضير طازجة قبل الاستخدام.
      1. تحضير 2 مل من المخزن المؤقت للهضم لهضم 2-4 أنسجة مخيخية و 4 مل ل 4-10 أنسجة. لإعداد 4 مل من المخزن المؤقت للهضم ، قم بإذابة 1.5 ملغ من L-cysteine (التركيز النهائي 200-400 ميكروغرام / مل) في 4 مل من EBSS. اقلب الأنبوب مرارا وتكرارا حتى يذوب المسحوق بالكامل.
      2. تعقيم المحلول باستخدام مرشح حقنة 0.2 ميكرومتر ومحقنة 5 مل ، ونقل المحلول إلى طبق معقم لزراعة الخلايا 35 مم.
      3. أضف 4 ميكرولتر من الغراء (تخفيف 1:1000 من تركيز مخزون 20 وحدة/ملغ) و40 ميكرولتر من DNase I (تخفيف 1:100 من مخزون 10 ملغم/مل لتركيز نهائي قدره 0.1 ملغم/مل).
      4. احتضن المحلول عند 37 درجة مئوية في حاضنة _CO2 لمدة 30 دقيقة على الأقل أو حتى الاستخدام.
         ملاحظة: هذه الخطوة ضرورية لتنشيط غراء. للحصول على أفضل النتائج، لا تتجاوز 45 دقيقة عند 37 درجة مئوية قبل الاستخدام. تأكد من أن المحلول يتحول إلى شفاف ولا توجد رواسب بيضاء قبل الاستخدام.
2. أغطية الطلاء المسبق
   1. لإعداد الأغطية لربط الخلايا، قم باحتضان أغطية زجاجية معقمة مقاس 12 مم مع 100 ميكروغرام/مل من البولي دي ليسين (PDL، 1 ملغم/مل في _dH2O المعقم) لمدة 1 ساعة على الأقل عند 37 درجة مئوية. احتفظ بأغطية الغطاء في نفس محلول PDL عند 4 درجات مئوية حتى الاستخدام.
   2. في يوم زراعة الخلايا الأولية ، اجمع PDL في أنبوب مخروطي نظيف واشطف الأغطية ثلاث مرات باستخدام _dH2O المعقم جيدا لإزالة PDL المتبقي.
      ملاحظة: يمكن تخزين PDL عند 4 درجات مئوية لإعادة الاستخدام.
   3. انقل الأغطية الزجاجية المطلية ب PDL إلى صفيحة مكونة من 24 بئرا عن طريق وضع غطاء واحد في كل بئر.
   4. قم بإزالة الماء الزائد وأضف 200-300 ميكرولتر من Matrigel (أعيد تشكيله وفقا للتعليمات الواردة في ورقة بيانات المنتج في DMEM-F12 الخالي من المصل) لتغطية الأغطية بالكامل.
   5. احتضن الأغطية في Matrigel لمدة 1 ساعة عند 37 درجة مئوية في حاضنة _CO2 .
      ملاحظة: قم بإزالة Matrigel قبل بذر الخلايا. يمكن جمع هذا Matrigel وتخزينه عند 4 درجات مئوية لإعادة الاستخدام المتعدد.
3. إعداد طبق الاستزراع التحضيري
   1. قم بطلاء طبق زراعة الخلايا 60 مم ب 2 مل من 100 ميكروغرام / مل PDL (أعد تشكيل محلول مخزون PDL 1 مجم / مل في _dH2O المعقم) عن طريق الحضانة عند 37 درجة مئوية لمدة 1 ساعة.
   2. مباشرة قبل بذر الخلايا ، قم بإزالة وجمع PDL المستخدم في أنبوب مخروطي نظيف وتخزينه عند 4 درجات مئوية لإعادة الاستخدام المتعدد. شطف وغسل الطبق المغلف PDL ثلاث مرات مع _dH2O المعقمة.
   3. استخدم طبقا واحدا من زراعة الخلايا 60 مم لخلايا البذور التي يتم حصادها من 2 أنسجة مخيخ كاملة كحد أقصى.
   4. قم بإعداد أطباق استزراع إضافية للمخيخ الإضافي.
      ملاحظة: راجع الخطوتين 2-1-18 و2-1-19 للاطلاع على استخدام طبق الاستزراع التحضيري.

2. يوم تجريبي 0

1. عزل وزراعة GCPs الأولية للماوس
   ملاحظة: تم تعديل طريقة ثقافة GCP من بروتوكول قياسي ، وتم وصف البروتوكول الموجز بإيجاز في عملنا السابق^6,11,12. للحصول على العائد الأمثل ل GCP ، استخدمي جراء ما بعد الولادة (P) في اليوم 6 أو P7 لعزل GCP. أكمل خطوات التشريح التالية 2.1.6-2.1.10 في أسرع وقت ممكن للحصول على البقاء الأمثل للخلية.
   1. SFM قبل الدفء ، وسط حجب الهضم ، وسط الثقافة ، و Opti-MEM عند 37 درجة مئوية أثناء التشريح.
   2. على مقعد نظيف ، قم بمسح جميع أجهزة التشريح في 70٪ من الإيثانول للتطهير.
   3. املأ طبق زراعة الخلايا مقاس 60 مم ب 2-3 مل من المخزن المؤقت للتشريح وقم بتبريده على الثلج.
   4. قم بإعداد المخزن المؤقت الطازج للهضم كما هو موضح في القسم 1.1.5 واجعله دافئا عند 37 درجة مئوية.
   5. استخدم 70٪ من الإيثانول لمسح رأس الجرو للتطهير.
   6. قطع رأس الجرو دون تخدير. استخدم الملقط لحمل الرأس والمقص الجراحي المعقم للقطع من الجزء الخلفي من الجمجمة لقطع رأس الجرو. قم بإزالة الجلد والجمجمة بعناية للكشف عن الدماغ باستخدام الملقط.
   7. استخدم الملقط لقرصة المخيخ وانقعه بسرعة في المخزن المؤقت للتشريح المبرد مسبقا المعد في الخطوة 2.1.3.
   8. قم بإزالة السحايا مع المخيخ المغمور في المخزن المؤقت للتشريح تحت مجهر تشريح. يجب أن تظهر السحايا الغنية بالأوعية الدموية وردية اللون تحت المجهر التشريحي.
   9. إزالة جميع السحايا باستخدام ملقط.
      ملاحظة: يجب أن يكون للمخيخ بدون سحايا مظهر أبيض.
   10. قم بإزالة أي أنسجة دماغية متوسطة مرئية والضفيرة المشيمية من المخيخ.
   11. انقل المخيخ إلى طبق استزراع 35 مم مملوء مسبقا بمخزن مؤقت للهضم الدافئ تم إعداده في الخطوة 2.1.4. تجنب نقل المخزن المؤقت للتشريح الزائد. قطع المخيخ إلى قطع دقيقة باستخدام مقص microspring في أسرع وقت ممكن.
   12. احتضن المخيخ المفروم على الفور عند 37 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة في حاضنة _CO2 . قم بتمديد وقت الحضانة إلى 20 دقيقة إذا كان سيتم معالجة أكثر من 4 مخيخ.
       ملاحظة: بعد الحضانة ، سوف تتجمع الأنسجة معا.
   13. انقل الأنسجة المهضومة على الفور إلى الجزء السفلي من أنبوب طرد مركزي معقم جديد سعة 15 مل باستخدام غطاء طرف ماصة P1000 مع وسيط مانع للهضم (تجنب نقل المخزن المؤقت للهضم).
   14. أضف حجما مناسبا من وسط حجب الهضم (1 مل لمخيخ واحد) لإنهاء الهضم والماصة لأعلى ولأسفل بلطف 30 مرة باستخدام أنبوبة صغيرة P1000 لزيادة فصل الأنسجة إلى تعليق أحادي الخلية. تجنب تكوين فقاعة الهواء.
   15. مرر تعليق الخلية بلطف عبر مصفاة خلية 70 ميكرومتر في أنبوب طرد مركزي معقم جديد لإزالة كتل الخلايا.
   16. مرر 1 مل إضافي من وسط حجب الهضم الطازج عبر مصفاة الخلية لجمع الخلايا المتبقية من مصفاة الخلية.
   17. جهاز الطرد المركزي الترشيح في 200 × غرام لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة (RT). قم بإزالة supernatant وأعد تعليق الكريات ب 1 مل من SFM. كرر هذه الخطوة مرتين. تجنب تشكيل فقاعات الهواء.
   18. أعد تعليق الكريات في حجم نهائي قدره 2 مل من وسط زراعة GCP وانقل تعليق الخلية إلى طبق الاستزراع المسبق 60 مم المطلي ب PDL المعد في الخطوة 1.3. الحضانة لمدة 15 دقيقة عند 37 درجة مئوية في حاضنة _CO2 .
       ملاحظة: لا تتجاوز 20 دقيقة.
   19. بعد الحضانة ، انقر فوق طبق الثقافة من الجانب لإزاحة خلايا GCP الملتصقة بشكل فضفاض. اجمع خلايا GCP الملتصقة في وسط الثقافة عن طريق السحب اللطيف باستخدام ماصة P1000. اجمع نظام تعليق GCP هذا في أنبوب طرد مركزي جديد سعة 15 مل. تخلص من الطبق مقاس 60 مم.
       ملاحظة: ستبقى الخلايا الدبقية النجمية والخلايا الليفية الملتصقة بشدة متصلة بقاع الطبق الذي يبلغ طوله 60 مم وسيتم فصلها في هذه الخطوة. إن حذف هذه الخطوة سيضر بنقاء ثقافة GCP.
   20. عد الخلايا وانتقل إلى الكهربية على الفور.
2. يوم في المختبر (DIV) 0: Electroporation ل Hh مستقبلات عبر الجينات التعبير: pEGFP-Smo
   1. بالنسبة للتبخر الكهربائي باستخدام كوفيت فجوة 2 مم ، قم بإعداد خليط كهربية خلايا البلازميد التالي لكل تفاعل من إلكتروباتوريشن: 1.2 × ¹⁰⁶ خلايا و 10 ميكروغرام من pEGFP-mSmo (اضبط تركيز مخزون الحمض النووي إلى ~ 2-5 ميكروغرام / ميكرولتر في المخزن المؤقت Tris-EDTA أو _dH2O المعقم) في 100 ميكرولتر من Opti-MEM.
      ملاحظة: تقليل إجمالي عدد الخلايا إذا كانت الخلايا غير كافية (على الرغم من أن هذا قد يقلل من كفاءة electroporation). ومع ذلك ، لا تقم بضبط كمية البلازميد ولا الحجم الإجمالي ل Opti-MEM المستخدم لكل كوفيت. إذا تجاوز العدد الإجمالي للخلية المطلوبة للتجربة 1.5 × ¹⁰⁶ خلايا، فقم بتوسيع نطاق خليط الكهربية وفقا لذلك وقم بإجراء تفاعلات كهربائية متعددة بشكل منفصل. يمكن إعادة استخدام الكوفيت حتى 5 مرات.
   2. قم بإعداد صفيحة بذر الخلايا بعد الكهربية عن طريق إضافة 0.5 مل من وسط الاستزراع إلى كل بئر من لوحة الاستزراع المكونة من 24 بئرا والتي تحتوي على أغطية مغلفة (من الخطوة 1.2) واحتفظ بها دافئة عند 37 درجة مئوية في حاضنة _CO2 .
   3. من الخطوة 2.1.20 ، قم بتقطيع العدد المطلوب من الخلايا إلى أنبوب طرد مركزي دقيق معقم سعة 1.5 مل وقم بالدوران عند 200 × جم لمدة 5 دقائق في RT. تخلص من supernatant وأعد تعليق حبيبات الخلية في 200 ميكرولتر من Opti-MEM. كرر هذه الخطوة مرتين باستخدام Opti-MEM لضمان عدم وجود وسيط استزراع متبقي في الأنبوب
      ملاحظة: لكل بئر / غطاء صفيحة 24 بئرا ، الكهروبورات والبذور 1.2-1.3 × ¹⁰⁶ خلية / بئر للحصول على ~ 70-75 ٪ التقاء الخلايا في اليوم التالي من الثقافة.
   4. اضبط معلمات الإلكتروباتوريون كما هو موضح في الجدول 1.
   5. ماصة تفاعل electroporation بلطف لخلط جيدا واستخدام طرف P200 طويل لنقل حجم دقيق من 100 ميكرولتر من الخليط إلى كوفيت الفجوة 2 مم. تجنب تشكيل الفقاعات.
   6. ضع الكوفيت في غرفة الكوفيت.
   7. اضغط على زر Ω الخاص بالمؤنث الكهربائي (انظر جدول المواد) وقم بتدوين قيمة المعاوقة ، والتي يجب أن تكون ~ 30-35. لضمان أن قيمة المعاوقة الكهربائية Ω تقع ضمن نطاق 30-35 ، التزم بحجم دقيق يبلغ 100 ميكرولتر.
   8. اضغط على زر البدء لبدء النبض.
   9. سجل قيم التيار المقاس والجول الموضح في إطار القراءة.
   10. قم بإزالة الكوفيت من غرفة الكوفيت.
   11. أضف على الفور 100 ميكرولتر من وسط الاستزراع المحموم مسبقا إلى الكوفيت وأعد تعليقه عن طريق السحب اللطيف لأعلى ولأسفل 2-3 مرات. انقل تعليق الخلية على الفور إلى لوحة 24 بئرا المعدة في الخطوة 2.2.2.
       ملاحظة: لتقليل موت الخلايا، قم بزرع الخلايا مباشرة بعد التفريغ الكهربائي.
   12. احتضان الخلايا عند 37 درجة مئوية في حاضنة _CO2 . اترك الخلايا دون إزعاج لمدة 3 ساعات لتجنب انفصال الخلايا.
   13. في الساعة 3 بعد البذر ، قم بشفط نصف الوسط الفائق بلطف وتخلص منه لإزالة الخلايا الميتة العائمة والحطام واستبداله بنفس الكمية من وسط الاستزراع قبل الدفء.
   14. احتضان الخلايا عند 37 درجة مئوية في حاضنة _CO2 وتجديد نصف الوسط كل يومين.
   15. راقب الخلايا تحت المجهر الفلوري في اليوم التالي ، أي DIV1 (الشكل 1) لإشارة GFP لتحديد كفاءة التعبير المفرط ل Smo.
   16. لتحفيز مسار إشارات Hh على DIV 1 بعد تجديد نصف الوسط ، أضف ناهض 0.2 ميكرومتر الناعم (SAG) إلى الخلايا مع إضافة حجم متساو من DMSO إلى عنصر التحكم. احتضان لمدة 24 ساعة قبل تثبيت الخلية.
       ملاحظة: حافظ على إضافة حجم DMSO/SAG إلى أدنى مستوى ممكن. هنا ، تمت إضافة 0.5 ميكرولتر DMSO أو 0.5 ميكرولتر من 0.2 mM SAG لكل 500 ميكرولتر من الوسط لكل بئر ، وهي نسبة تخفيف تبلغ 1: 1000.

3. DIV 2: تصور الأهداب الأولية والتحقيق في مسار إشارات Hh

1. تثبيت الخلايا
   1. في 24 ساعة بعد العلاج ، قم بإزالة وسط المزرعة وشطف الخلايا 2-3 مرات باستخدام محلول ملحي مخزن بالفوسفات (PBS) باستخدام ماصة باستور يمكن التخلص منها مع تجنب إزاحة الخلايا.
   2. إصلاح الخلايا عن طريق إضافة ~ 400 ميكرولتر من 4٪ بارافورمالدهيد (أعدت في PBS) واحتضان في RT لمدة 10 دقائق.
   3. شطف وغسل 2-3 مرات مع PBS باستخدام ماصة باستور يمكن التخلص منها.
   4. تخزينها في PBS في 4 °C لمدة تصل إلى 2 أشهر أو المضي قدما في التلطيخ المناعي.
2. تلطيخ كيميائي مناعي ل GCPs وعلامة السيليوم الأولية
   1. في طبق من 24 بئرا ، اغسل الخلايا مرتين في PBS مع اهتزاز لطيف لمدة 5 دقائق في كل مرة.
   2. أضف 0.5 مل من كلوريد الأمونيوم 100 ملليمتر إلى الخلية واحتضن في RT لمدة 10 دقائق لإخماد المثبت.
   3. شطف مرة واحدة وغسل 2-3 مرات مع PBS مع هز لطيف لمدة 10 دقائق في كل مرة.
   4. ماصة بلطف 30 ميكرولتر من المخزن المؤقت المانع (BB: 0.1٪ Triton X-100 ، 1٪ BSA ، 2٪ مصل الحصان المعطل للحرارة في PBS) على قطعة من parafilm لتشكيل قطرة بدون فقاعات هواء.
   5. انقل الغطاء برفق من البئر إلى قطرة BB مع توجيه الجانب المزروع بالخلية لأسفل. احتضان الخلايا مع BB في غرفة رطبة لمدة 1 ساعة في RT.
   6. تحضير مزيج الأجسام المضادة الأولية في BB كما هو موضح في جدول المواد. لفحص الخلايا ذات الأجسام المضادة الأولية ، كرر الخطوتين 3.2.4 و 3.2.5 ، مع استبدال BB بمزيج الأجسام المضادة الأساسي. احتضان الخلايا مع الجسم المضاد الأساسي لمدة 2 ساعة في RT.
   7. باستخدام الملقط ، انقل الأغطية مرة أخرى إلى اللوحة المكونة من 24 بئرا مع توجيه الجانب المزروع بالخلايا لأعلى. شطف الخلايا مرة واحدة وغسل 3-4 مرات في PBS مع هز لطيف لمدة 10 دقائق في كل مرة.
   8. تحضير مزيج الأجسام المضادة الثانوية في BB كما هو موضح في جدول المواد. لاحتضان الخلايا بالجسم المضاد الثانوي ، كرر الخطوتين 3.2.4 و 3.2.5 ، مع استبدال BB بمزيج الأجسام المضادة الثانوي. احتضن في الظلام لمدة 1 ساعة في RT.
   9. كرر الخطوة 3.2.7 لغسل حضانة الأجسام المضادة بعد المرحلة الثانوية.
   10. قم بتركيب زلة الغطاء على شريحة زجاجية مجهرية نظيفة باستخدام وسيط التركيب.
   11. جفف الشريحة في الظلام طوال الليل وانتقل إلى التصوير ^{البؤري13}.

النتائج

باستخدام Opti-MEM (انظر جدول المواد) ككاشف عالمي ، يمكن لمنهجية electroporation المقترحة هذه تحقيق كفاءة عالية باستمرار في الكهربية بنسبة ~ 80-90٪ (الشكل 1). تم تحديد كفاءة التفريغ الكهربائي لناقل Smo-EGFP في DIV 2 بعد الإلكتروبورات عن طريق القياس الكمي للنسبة المئوية للخلايا الإيجاب?...

Discussion

عادة ما يرتبط نقل الجينات المحورة في ثقافة GCP الأولية عن طريق طريقة electroporation بانخفاض صلاحية الخلايا وضعف كفاءة ^{النقل9,10}. تقدم هذه الورقة بروتوكولا كهربائيا فعالا من حيث التكلفة وقابلا للتكرار أظهر كفاءة عالية وقابلية للتطبيق. بالإضافة إلى ذلك ، نعرض أيضا طر?...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
GCP Culture
B27 supplement	Life Technologies LTD	17504044
Cell strainer, 70 µm	Corning	352350
DNase I from bovine pancreas	Roche	11284932001
Earle’s Balanced Salt Solution	Gibco, Life Technologies	14155063
FBS, qualified	Thermo Scientific	SH30028.02
GlutamMAXTM-I ,100x	Gibco, Life Technologies	35050061	L-glutamine substitute
L-cysteine	Sigma Aldrich	C7352
Matrigel	BD Biosciences	354277	Basement membrane matrix
Neurobasal	Gibco, Life Technologies	21103049
Papain,suspension	Worthington Biochemical Corporation	LS003126
Poly-D-lysine Hydrobromide	Sigma Aldrich	P6407
SAG	Cayman Chemical	11914-1	Smoothened agonist
IF staining
Bovine Serum Albumin	Sigma Aldrich	A7906
Paraformaldehyde	Sigma Aldrich	P6148
Triton X-100	Sigma Aldrich	X100
Primary antibody mix
Anti-GFP-goat ab	Rockland	600-101-215	Dilution Factor: 1 : 1000
Anti-Arl13b mouse monoclonal ab	NeuroMab	75-287	Dilution Factor: 1 : 1000
Anti-Pax6 rabbit polyclonal ab	Covance	PRB-278P	Dilution Factor: 1 : 1000
Secondary antibody mix
Alexa Fluor 488 donkey anti-goat IgG	Invitrogen	A-11055	Dilution Factor: 1 : 1000
Alexa Fluor 555 donkey anti-mouse IgG	Invitrogen	A-31570	Dilution Factor: 1 : 1000
Alexa Fluor 647 donkey anti-rabbit IgG	Invitrogen	A-31573	Dilution Factor: 1 : 1000
DAPI	Thermo Scientific	62247	Dilution Factor: 1 : 1000
Electroporation
CU 500 cuvette chamber	Nepagene	CU500
EPA Electroporation cuvette (2 mm gap)	Nepagene	EC-002
Opti-MEM	Life Technologies LTD	31985070	reduced-serum medium for transfection
pEGFP-mSmo	Addgene	25395
Super Electroporator NEPA21 TYPE II In Vitro and In Vivo Electroporation	Nepagene	NEPA21	electroporator