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要約

ここでは、費用対効果が高く、効率的で実行可能な一次小脳顆粒細胞前駆体(GCP)の遺伝子操作のための再現性のある インビトロ エレクトロポレーションプロトコルを提示する。さらに、このプロトコルはまた、一次GCP細胞における一次シリウム依存性ヘッジホッグシグナル伝達経路の分子的研究のための簡単な方法を示す。

要約

一次シリウムは、ヘッジホッグ(Hh)シグナル伝達刺激を細胞表面から伝達するほぼすべての細胞に見られる重要なシグナル伝達オルガネラである。顆粒細胞前駆体(GCP)において、一次シリウムはHhシグナル伝達経路を調節することによって前駆細胞増殖を調整する極めて重要なシグナル伝達センターとして機能する。一次シリウム依存性Hhシグナル伝達機械の調査は、経路成分の インビトロ 遺伝子操作によって促進され、一次シリウムへの動的局在化を可視化する。しかし、現在知られているエレクトロポレーション法を用いたGCPの一次培養におけるトランスフェインのトランスフェクションは、一般にコストがかかり、しばしば低い細胞生存率および望ましくないトランスフェクション効率をもたらす。この論文では、高いトランスフェクション効率が80~90%、最適な細胞生存率を実証する、効率的で費用対効果の高いシンプルなエレクトロポレーションプロトコルを紹介します。これは、一次GCP培養における主要なシリウム依存性ヘッジホッグシグナル伝達経路の研究に適用可能な、単純で再現性のある効率的な遺伝子改変方法である。

概要

小脳GCPは、生体内のHhシグナル伝達経路に対する高い存在量と高感度性のために、ニューロン前駆細胞型におけるHhシグナル伝達経路の機械を研究するために広く使用されています。GCPにおいて、一次シリウムは、前駆細胞6,7,8の増殖を調整する極めて重要なHhシグナル伝達ハブ5として機能する。一次シリウム上のHhシグナル伝達成分のインビジュアライゼーションは、内因性の基底レベルが低いため、しばしば困難です。したがって、目的の遺伝子のタンパク質発現レベルおよびフルオロフォアタグ付けの遺伝子導入修飾は、分子分解能で経路を研究するのに有用なアプローチである。しかし、リポソームベースのトランスフェクションアプローチを用いたGCP一次培養の遺伝子操作は、トランスフェクション効率が低いことが多く、さらなる分子調査を妨げる9。エレクトロポレーションは効率を高めるが、一般的には法外なベンダー固有および細胞型制限型エレクトロポレーション試薬10を必要とする。

本論文では、GCP一次培養におけるHhシグナル伝達経路成分を操作するための高効率かつ費用対効果の高いエレクトロポレーション法を紹介する。この改変エレクトロポレーションプロトコルを用いて、緑色蛍光タンパク質(GFP)タグ付きスムージングトランスジーン(pEGFP-Smo)をGCPに効率よく送達し、高い細胞生存率とトランスフェクション率(80~90%)を達成しました。さらに、免疫細胞化学的染色によって証明されるように、トランスフェクトGCPは、EGFP-Smoをプライマリ繊毛に密売することによってHhシグナル伝達経路のSmoothedアゴニスト誘発活性化に対して高い感受性を示した。このプロトコルは、ヒトおよびげっ歯類の一次細胞培養、ならびにヒト人工多能性幹細胞など、トランスフェクトが困難な細胞型の インビトロ 遺伝子改変を伴う実験に対して直接的に適用され、有益である。

プロトコル

すべての動物関連の手順は、動物の取り扱いガイドラインと香港保健省によって承認されたプロトコルに従って行われました。動物実験免許(実験管理)条例(キャップ340)は、香港保健省から取得した。動物の仕事はHKBUの調査事務所および実験室安全委員会によって承認された動物の安全倫理に従って行われた。このプロトコルで使用されるすべての材料の詳細については、 資料表 を参照してください。

1. 実験前準備

  1. 培養メディアとバッファーの調製
    1. 無血清培地(SFM)
      1. SFMの50 mLを調製するには、100x L-グルタミン置換物500μL、ペニシリンストレプトマイシン500μL、ピルビン酸ナトリウム1mM、1MLの1ML(最終250μM)から49mLの神経基底培地を加えます。
      2. SFMを50 mL円錐形チューブで10mLと40mLの2つのアリコートに分割し、4°Cで最大1ヶ月間保管します。
    2. 消化遮断媒体:SFMで10%FBS
      1. 1.1 mLの熱不活化FBSをSFMの10 mLアリコートに加え、消化遮断培地を調製する。
    3. GCP培地:B27を用いてSFM
      1. GCP培地を調製するには、800 μLの無血清B-27サプリメントをSFMの40 mLアリコートに加えます。
        注:B-27サプリメントSFMは、4°Cで最大1ヶ月間保存することができます。しかし、新しく準備されたメディアは、最適な結果を生み出します。
    4. 解剖バッファー: グルコース + HEPES を有する EBSS
      1. 10 mM HEPES(4-(2-hydroxyethyl)-1-ピペラジネタンスルホン酸を含むカルシウムおよびマグネシウムフリーのアールのバランス塩溶液(EBSS)にグルコース6 g/Lを加えます。
      2. 0.2 μmのシリンジフィルターを通過して溶液を殺菌し、4°Cで長期保存を行います。
    5. 消化バッファー
      注:使用前に新しく準備してください。
      1. 2-4小脳組織の消化のための消化バッファーの2 mLと4-10組織のための4 mLを調製します。4 mLの消化バッファーを調製するには、1.5 mgの L-システイン (最終濃度 200-400 μg/mL) を EBSS の 4 mL に溶解します。粉末が完全に溶解するまでチューブを繰り返し反転させます。
      2. 0.2 μmのシリンジフィルターと5 mLのシリンジを使用して溶液を殺菌し、滅菌35mm細胞培養皿に溶液を移す。
      3. パパイン4 μL(20単位/mgのストック濃度から1:1,000希釈)とDNase Iの40 μL(10 mg/mLストックから1:100希釈して最終濃度0.1mg/mL)を加えます。
      4. 37°CのCO2 インキュベーターで、30分以上かけて使用するまで、溶液をインキュベートします。
        注: この手順は、パパインを有効にするために重要です。最適な結果を得る場合は、使用前に37°Cで45分を超えないでください。ソリューションが透明になり、使用前に白色の沈殿物がないことを確認します。
  2. カバーリップの前塗り
    1. 細胞付着用のカバースリップを調製するために、100 μg/mLのポリD-リジン(PDL、滅菌dH2Oで1 mg/mL)を37°Cで少なくとも1時間用いて、12mmガラスカバーリップをインキュベートオートクレーブした。 使用するまで、同じPDL溶液内のカバーリップを4°Cに保ちます。
    2. 一次細胞培養の日に、PDLをきれいな円錐形のチューブに集め、滅菌dH2Oでカバーリップを完全に洗浄して、残留PDLを完全に除去します。
      注: PDL は、再利用のために 4 °C で保管することができます。
    3. PDLコーティングされたガラスカバーリップを24ウェルプレートに移し、各ウェルにカバースリップを1枚置きます。
    4. 余分な水を取り除き、カバーリップを完全にカバーするために200-300 μLのMatrigel(無血清DMEM-F12の製品データシートの指示に従って再構成)を加えます。
    5. CO2インキュベーターで37°Cで1時間マトリゲルにカバースリップをインキュベートします。
      メモ:セルのシード処理の前にマトリゲルを取り除きます。このマトリゲルは、4°Cで回収して、複数の再利用のために保存することができます。
  3. プレメッキ培養皿の作製
    1. 60 mmの細胞培養皿に2 mLの100 μg/mL PDL(滅菌dH2Oで1mg/mL PDLストック溶液を再構成)を37°Cで1時間インキュベーションしてコーティングします。
    2. 細胞の播種の直前に、使用したPDLをきれいな円錐形チューブに取り出して集め、4°Cで保管して、複数の再利用を行います。PDLコーティングされた皿を滅菌dH2Oで3回洗い、洗浄します。
    3. 最大2個の全小脳組織から採取した細胞を播種するために、1つの60mm細胞培養皿を使用してください。
    4. 追加の小脳のための追加の文化料理を準備します。
      注:プレメッキの文化ディッシュの使用については、ステップ2.1.18と2.1.19を参照してください。

2. 実験日 0

  1. マウスプライマリGCPの分離と培養
    注: GCP のカルチャ方法は標準プロトコルから変更され、前の作業で簡単なプロトコルについて簡単に説明しました。6,11,12.最適なGCP収率のために、GCPの分離のために出生後(P)6日目またはP7の子犬を使用してください。最適な細胞の生存率を得るための解剖ステップ2.1.6~2.1.10をできるだけ早く完了してください。
    1. プレウォームSFM、消化遮断培地、培養培地、及び解剖中37°CでのOpti-MEM。
    2. クリーンベンチで、除菌のために70%エタノールにすべての解剖装置を予め入れ。
    3. 60mmの細胞培養皿に2〜3mLの解剖バッファーを充填し、氷の上で冷やします。
    4. セクション1.1.5に記載されているように新鮮な消化バッファーを準備し、37 °Cで暖かく保ちます。
    5. 70%エタノールを使用して、消毒のために子犬の頭を拭いてください。
    6. 麻酔なしで子犬の首を切る。鉗子を使って頭を保持し、手術用はさみを殺菌して頭蓋骨の後ろから切り取り、子犬を切断します。皮膚と頭蓋骨を慎重に取り除き、鉗子を使用して脳を明らかにする。
    7. 鉗子を使用して小脳をつまみ、ステップ2.1.3で準備した冷やされた解剖バッファーに素早く浸します。
    8. 解剖顕微鏡下で解剖バッファーに沈んだ小脳を持つ髄膜を除去します。血管を豊富に含む髄系は、解剖顕微鏡の下でピンクがかったように見えるはずです。
    9. 鉗子を使用してすべての髄を取り除く。
      注:髄を持たない小脳は、白っぽい外観を持っている必要があります。
    10. 小脳から目に見える中脳組織と脈絡膜叢を取り除く。
    11. ステップ2.1.4で調製した温かい消化バッファーをあらかじめ充填した35mm培養皿に小脳を移す。余分な解剖バッファーの転送を避けます。できるだけ早くマイクロスプリングハサミを使って小脳を細かく切ります。
    12. 37°Cで、CO2 インキュベーターで15分間、すぐにミンチ小脳をインキュベートします。4つ以上の小脳を処理する場合は、インキュベーション時間を20分に延長します。
      注:インキュベーション後、組織は凝集します。
    13. 消化遮断媒体を用いてP1000ピペット先端プリウェットを使用して、消化した組織を新しい滅菌15 mL遠心分離管の底に直ちに移します(消化バッファーの転送を避ける)。
    14. 適切な量の消化遮断媒体(1つの小脳の場合は1mL)を加え、P1000マイクロピペットを使用して消化とピペットを30回穏やかに上下に終了させ、組織をさらに単一細胞懸濁液に解離する。気泡の形成を避けてください。
    15. 70 μmのセルストレーナーを通して、細胞の塊を除去するために新しい滅菌遠心分離管に細胞懸濁液をそっと渡します。
    16. さらに1 mLの新鮮な消化遮断培地を細胞ストレーナーを通して、細胞ストレーナーから残留細胞を採取する。
    17. 200× g で濾液を室温で5分間遠心する(RT)。上清を取り除き、SFMの1 mLでペレットを再懸濁します。この手順を 2 回繰り返します。気泡を形成しないでください。
    18. GCP培地の2mLの最終容積でペレットを再懸濁し、ステップ1.3で調製したPDLコーティングされた60mmプレめっき培養皿に細胞懸濁液を移す。CO2インキュベーターで37°Cで15分間インキュベートします。
      注:20分を超えないようにしてください。
    19. インキュベーション後、側から培養皿をタップして、緩やかに接着性のGCP細胞を外します。P1000ピペットを用いて穏やかなピペット処理を行い、培養培地中の接着性GCP細胞を回収する。新しい15 mL遠心分離管にこのGCP懸濁液を収集します。60mm皿を捨てます。
      注:強く付着したアストログリアと線維芽細胞は、60 mm皿底に付着したままで、このステップで分離されます。このステップを省略すると、GCP培養の純度が損なわれます。
    20. 細胞を数え、すぐにエレクトロポレーションに進みます。
  2. 日 インビトロ (DIV) 0: Hh受容体トランスジーン過発現のエレクトロポレーション: pEGFP-Smo
    1. 2mmギャップキュベットを使用したエレクトロポレーションの場合、エレクトロポレーションの反応ごとにプラスミド細胞エレクトロポレーション混合物を調製します:1.2×106 細胞と10μgのpEGFP-mSmo(DNAストック濃度をTris-EDTAバッファーまたは無菌dH2Oで〜2〜5 μG/μLに調整する)をOPTI-ME-M-Me-MM-ME-MeM-100 μLで調整します。
      メモ:セルが不足している場合は、セルの総数を減らします(ただし、エレクトロポレーション効率が低下する可能性があります)。ただし、プラスミドの量や、1キュベットあたりに使用されるOpti-MEMの総量を調整しないでください。実験に必要な細胞総数が1.5×106細胞を超える場合は、それに応じてエレクトロポレーション混合物をスケールアップし、複数のエレクトロポレーション反応を別々に行います。キュベットは5回まで再利用できます。
    2. コーティングされたカバーリップを含む24ウェル培養プレートの各ウェルに0.5mLの培養培地を加えて、エレクトロポレーション後の細胞播種板を準備し(ステップ1.2から)、CO2 インキュベーターで37°Cで暖かく保ちます。
    3. ステップ2.1.20から、必要な数の細胞を無菌1.5 mLマイクロ遠心分離管にピペットし、RTで200× gで5分間回転します。このステップをOpti-MEMで2回繰り返して、チューブに残留培地が存在しないようにします。
      注:24ウェルプレートのすべてのウェル/カバースリップについて、106 個の細胞/ウェル×1.2-1.3の電気ポレートおよびシードは、次の日に〜70〜75%の細胞合流を得る。
    4. エレクトロポレーションのパラメータを 表1に示すように設定します。
    5. 穏やかに混ぜ合わせ、長いP200チップを使用して、混合物の正確な体積を2mmギャップキュベットに移します。泡を形成しないでください。
    6. キュベットをキュベットチャンバーに置きます。
    7. エレクトロポレーターのΩボタンを押して( 材料表を参照)、インピーダンス値をメモします(~30~35)。電気インピーダンス値Ω 30~35の範囲内に収まるように、100 μLの正確な体積に接着します。
    8. 開始ボタンを押してパルスを開始します。
    9. 読み取りフレームに表示される測定電流とジュールの値を記録します。
    10. キュベットチャンバーからキュベットを取り外します。
    11. すぐに100μLのプリウォーム培養培地をキュベットに加え、2〜3回上下に穏やかなピペットで再中断します。ステップ2.2.2で調製した24ウェルプレートに細胞懸濁液を直ちに移す。
      注:細胞死を最小限に抑えるために、エレクトロポレーションの直後に細胞を播種してください。
    12. 細胞を37°CでCO2 インキュベーターでインキュベートします。細胞の剥離を避けるために、3時間、邪魔されずにセルを残します。
    13. 3時間ポストシード処理時に、上清培地の半分を軽く吸引して捨てて、浮遊死細胞や残骸を除去し、同量のプリウォームド培養培地に置き換える。
    14. CO2インキュベーターで37°Cの細胞をインキュベートし、一日おきに培地の半分を補充します。
    15. 翌日に蛍光顕微鏡下で細胞を観察し、すなわち、DIV1(図1)GFP信号について、Smo過剰発現の効率を決定する。
    16. 培地の半分を補充した後、DIV 1のHhシグナル伝達経路の刺激のために、コントロールにDMSOの等しい量を加えながら、細胞に0.2 μM平滑化アゴニスト(SAG)を加えます。細胞固定の前に24時間インキュベートする。
      注: DMSO/SAG の追加量はできるだけ低くしてください。ここでは、0.5 μL DMSO または 0.5 μL の 0.2 mM SAG をウェル当たり 500 μL の培地あたりに添加し、希釈比は 1:1,000 です。

3. DIV 2:一次繊毛の可視化とHhシグナル伝達経路の調査

  1. 細胞固定
    1. 24時間後処理時に、培養培地を取り出し、細胞を除去しながら、使い捨てのパスツールピペットを使用してリン酸緩衝生理食塩水(PBS)で細胞を2〜3回リンスし、細胞を除去する。
    2. 4%パラホルムアルデヒド(PBSで調製)の約400μLを添加して細胞を固定し、RTで10分間インキュベートします。
    3. 使い捨てのパスツールピペットを使用してPBSで2〜3回洗浄します。
    4. 4°Cで2ヶ月間保管するか、免疫染色に進みます。
  2. GCPと一次シリウムマーカーの免疫細胞化学的染色
    1. 24ウェルプレートで、細胞をPBSで2回洗浄し、毎回5分間穏やかに揺れる。
    2. 100 mM の塩化アンモニウムを 0.5 mL 加え、RT で 10 分間インキュベートして固定液をクエンチします。
    3. 一度洗い流し、PBSで2〜3回、毎回10分間穏やかに振って洗います。
    4. ブロックバッファーのピペット 30 μL (BB: 0.1% トリトン X-100, 1% BSA, 2% PBS の熱不活性化馬血清) にパラフィルムの一部に気泡のない液滴を形成します。
    5. ウェルから BB 液滴にカバースリップをそっと移し、セルシード側を下向きにします。BBで細胞を高温多湿のチャンバーにRTで1時間インキュベートする。
    6. 材料表に示すように、BBで一次抗体ミックスを調製します。一次抗体で細胞をプローブするには、ステップ3.2.4と3.2.5を繰り返し、BBを一次抗体ミックスに置き換えます。RTで2時間一次抗体で細胞をインキュベートする。
    7. 鉗子を使用して、カバースリップを24ウェルプレートに戻し、セルシード側を上向きにします。細胞を一度洗い流し、PBSで3〜4回、毎回10分間穏やかに振る。
    8. 材料表に示すように、BBで二次抗体ミックスを準備します。二次抗体で細胞をインキュベートするには、ステップ3.2.4および3.2.5を繰り返し、BBを二次抗体ミックスに置き換えます。RTで1時間暗闇の中でインキュベート。
    9. 二次後抗体インキュベーション洗浄に対して、ステップ3.2.7を繰り返します。
    10. 取り付け媒体を使用して、きれいな顕微鏡ガラススライドにカバースリップを取り付けます。
    11. スライドを一晩暗く乾燥させて、共焦点イメージング13に進む。

結果

この提案されたエレクトロポレーション方法論は、オプティ-MEM( 材料表参照)を汎用試薬として用い、一貫して80~90%で高いエレクトロポレーション効率を達成できる(図1)。Smo-EGFPベクターのエレクトロポレーション効率は、全てのペアドボックスタンパク質-6(Pax6)発現GCP細胞における緑色蛍光陽性細胞の割合を定量することにより、DIV2ポストエレクトロポレ?...

ディスカッション

エレクトロポレーション法による原発GCP培養におけるトランスフェインのトランスフェクションは、典型的には低い細胞生存率と低いトランスフェクション効率9,10と関連している。この論文では、高効率と生存率を実証した、費用対効果が高く、再現性の高いエレクトロポレーションプロトコルを紹介する。また、一次GCP細胞における一次シリウ?...

開示事項

著者は宣言する利害の対立を持っていません。

謝辞

この研究は、HKBUシードファンドとティア2スタートアップグラント(RG-SGT2/18-19/SCI/009)、研究助成金協議会共同研究基金(CRF-C2103-20GF)からC.H.H.Horに支援されました。

資料

NameCompanyCatalog NumberComments
GCP Culture
B27 supplementLife Technologies LTD17504044
Cell strainer, 70 µmCorning352350
DNase I from bovine pancreasRoche11284932001
Earle’s Balanced Salt SolutionGibco, Life Technologies14155063
FBS, qualifiedThermo ScientificSH30028.02
GlutamMAXTM-I ,100xGibco, Life Technologies35050061L-glutamine substitute
L-cysteineSigma AldrichC7352
MatrigelBD Biosciences354277Basement membrane matrix
NeurobasalGibco, Life Technologies21103049
Papain,suspensionWorthington Biochemical CorporationLS003126
Poly-D-lysine HydrobromideSigma AldrichP6407
SAGCayman Chemical11914-1Smoothened agonist
IF staining
Bovine Serum AlbuminSigma AldrichA7906
ParaformaldehydeSigma AldrichP6148
Triton X-100Sigma AldrichX100
Primary antibody mix
Anti-GFP-goat abRockland600-101-215Dilution Factor: 1 : 1000
Anti-Arl13b mouse monoclonal abNeuroMab75-287Dilution Factor: 1 : 1000
Anti-Pax6 rabbit polyclonal abCovancePRB-278PDilution Factor: 1 : 1000
Secondary antibody mix
Alexa Fluor 488 donkey anti-goat IgGInvitrogenA-11055Dilution Factor: 1 : 1000
Alexa Fluor 555 donkey anti-mouse IgGInvitrogenA-31570Dilution Factor: 1 : 1000
Alexa Fluor 647 donkey anti-rabbit IgGInvitrogenA-31573Dilution Factor: 1 : 1000
DAPIThermo Scientific62247Dilution Factor: 1 : 1000
Electroporation
CU 500 cuvette chamberNepageneCU500
EPA Electroporation cuvette (2 mm gap)NepageneEC-002
Opti-MEMLife Technologies LTD31985070reduced-serum medium for transfection
pEGFP-mSmoAddgene25395
Super Electroporator NEPA21 TYPE II In Vitro and In Vivo ElectroporationNepageneNEPA21electroporator

参考文献

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