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Resumen

Aquí, presentamos un protocolo de electroporación in vitro reproducible para la manipulación genética de precursores primarios de células granulares cerebelosas (GCP) que es rentable, eficiente y viable. Además, este protocolo también demuestra un método sencillo para el estudio molecular de las vías de señalización de Hedgehog dependientes del cilio primario en células GCP primarias.

Resumen

El cilio primario es un orgánulo de señalización crítico que se encuentra en casi todas las células que transduce los estímulos de señalización de Hedgehog (Hh) desde la superficie celular. En el precursor de células granulares (GCP), el cilio primario actúa como un centro de señalización fundamental que orquesta la proliferación de células precursoras mediante la modulación de la vía de señalización de Hh. La investigación de la maquinaria de señalización de Hh dependiente del cilio primario se ve facilitada por la manipulación genética in vitro de los componentes de la vía para visualizar su localización dinámica en el cilio primario. Sin embargo, la transfección de transgenes en los cultivos primarios de GCP utilizando los métodos de electroporación actualmente conocidos es generalmente costosa y a menudo resulta en una baja viabilidad celular y una eficiencia de transfección indeseable. Este documento presenta un protocolo de electroporación eficiente, rentable y simple que demuestra una alta eficiencia de transfección de ~ 80-90% y una viabilidad óptima de la celda. Este es un método de modificación genética simple, reproducible y eficiente que es aplicable al estudio de la vía de señalización primaria de Hedgehog dependiente del cilio en cultivos primarios de GCP.

Introducción

Los GCP cerebelosos son ampliamente utilizados para estudiar la maquinaria de la vía de señalización de Hh en tipos de células progenitoras neuronales debido a su alta abundancia y alta sensibilidad a la vía de señalización de Hh in vivo1,2,3,4. En los GCP, el cilio primario actúa como un centro de transducción de señal Hh fundamental5 que orquesta la proliferación de las células precursoras6,7,8. La visualización in vitro de los componentes de señalización de Hh en el cilio primario a menudo es un desafío debido a sus bajos niveles basales endógenos. Por lo tanto, la modificación transgénica de los niveles de expresión de proteínas y el marcado de fluoróforos del gen de interés son enfoques útiles para estudiar la vía a resolución molecular. Sin embargo, la manipulación genética de cultivos primarios de GCP utilizando enfoques de transfección basados en liposomas a menudo resulta en una baja eficiencia de transfección, lo que dificulta futuras investigaciones moleculares9. La electroporación aumenta la eficiencia, pero comúnmente requiere reactivos de electroporación exorbitantes específicos del proveedor y restringidos por el tipo de celda10.

Este artículo presenta un método de electroporación de alta eficiencia y rentable para manipular los componentes de la vía de señalización de Hh en cultivos primarios de GCP. Utilizando este protocolo de electroporación modificado, un transgén suavizado marcado con proteína fluorescente verde (GFP) (pEGFP-Smo) se administró de manera eficiente a los GCP y logró altas tasas de supervivencia y transfección celular (80-90%). Además, como lo demuestra la tinción inmunocitoquímica, los GCP transfectados mostraron una alta sensibilidad a la activación inducida por agonistas suavizados de la vía de señalización de Hh mediante el tráfico de EGFP-Smo a los cilios primarios. Este protocolo será directamente aplicable y beneficioso para los experimentos que impliquen la modificación genética in vitro de tipos de células que sean difíciles de transfectar, como los cultivos de células primarias humanas y de roedores, así como las células madre pluripotentes inducidas por humanos.

Protocolo

Todos los procedimientos relacionados con los animales se llevaron a cabo de conformidad con las directrices de manejo de animales y el protocolo aprobado por el Departamento de Salud de Hong Kong. Las licencias de experimentación con animales siguiendo la Ordenanza de Animales (Control de Experimentos) (Cap. 340) se obtuvieron del Departamento de Salud del Gobierno de Hong Kong. El trabajo con animales se llevó a cabo de conformidad con la ética de seguridad animal aprobada por la Oficina de Investigación de HKBU y el Comité de Seguridad de Laboratorio. Consulte la Tabla de materiales para obtener detalles sobre todos los materiales utilizados en este protocolo.

1. Preparación previa al experimento

  1. Preparación de medios de cultivo y buffers
    1. Medio sin suero (SFM)
      1. Para preparar 50 ml de SFM, agregue 500 μL de sustituto de L-glutamina 100x, 500 μL de penicilina-estreptomicina, 1 mM de piruvato de sodio y 12.5 μL de 1 M KCl (250 μM finales) a 49 ml de medio neurobasal.
      2. Divida la SFM en 2 alícuotas de 10 ml y 40 ml en tubos cónicos de 50 ml y guárdelas a 4 °C durante un máximo de un mes.
    2. Medio de bloqueo de la digestión: 10% FBS en SFM
      1. Agregue 1.1 ml de FBS inactivado por calor a una alícuota de 10 ml de SFM para preparar el medio de bloqueo de la digestión.
    3. Medio de cultivo GCP: SFM con B27
      1. Para preparar el medio de cultivo GCP, agregue 800 μL de suplemento de B-27 sin suero a una alícuota de 40 ml de SFM.
        NOTA: La SFM suplementada con B-27 se puede almacenar a 4 °C durante un máximo de un mes. Sin embargo, los medios recién preparados producen resultados óptimos.
    4. Tampón de disección: EBSS con glucosa + HEPES
      1. Añadir 6 g/L de glucosa a la solución salina equilibrada de Earle (EBSS) libre de calcio y magnesio que contenga 10 mM de HEPES (ácido 4-(2-hidroxietil)-1-piperazinatanosulfónico).
      2. Esterilizar la solución pasando por un filtro de jeringa de 0,2 μm y almacenarla a 4 °C para su almacenamiento a largo plazo.
    5. Tampón de digestión
      NOTA: Preparar recién hecho antes de usar.
      1. Prepare 2 ml de tampón de digestión para la digestión de 2-4 tejidos cerebelosos y 4 ml para 4-10 tejidos. Para preparar 4 ml de tampón de digestión, disuelva 1,5 mg de L-cisteína (concentración final 200-400 μg/ml) en 4 ml de EBSS. Invierta el tubo repetidamente hasta que el polvo se disuelva por completo.
      2. Esterilizar la solución con un filtro de jeringa de 0,2 μm y una jeringa de 5 ml, y transferir la solución a una placa de cultivo celular estéril de 35 mm.
      3. Añadir 4 μL de papaína (dilución 1:1.000 a partir de una concentración de stock de 20 unidades/mg) y 40 μL de DNasa I (dilución 1:100 de una cepa de 10 mg/ml para una concentración final de 0,1 mg/ml).
      4. Incubar la solución a 37 °C en una incubadora de CO2 durante al menos 30 min o hasta su uso.
        NOTA: Este paso es fundamental para activar la papaína. Para obtener resultados óptimos, no exceda de 45 min a 37 °C antes de su uso. Asegúrese de que la solución se vuelva transparente y que no haya precipitados blancos antes de su uso.
  2. Recubrimiento de fundas de prerecubrimiento
    1. Para preparar los recubiertos para la fijación celular, incube los recubiertos de vidrio de 12 mm en autoclave con 100 μg/ml de poli-D-lisina (PDL, 1 mg/ml en dH2O estéril) durante al menos 1 h a 37 °C. Mantenga las fundas en la misma solución de PDL a 4 °C hasta su uso.
    2. El día del cultivo celular primario, recoja el PDL en un tubo cónico limpio y enjuague las fundas tres veces con dH2O estéril a fondo para eliminar el PDL residual.
      NOTA: La PDL se puede almacenar a 4 °C para su reutilización.
    3. Transfiera las cubiertas de vidrio recubiertas de PDL a una placa de 24 pocillos colocando una cubierta en cada pozo.
    4. Retire el exceso de agua y agregue 200-300 μL de Matrigel (reconstituido de acuerdo con las instrucciones de la hoja de datos del producto en DMEM-F12 sin suero) para cubrir completamente los cubrehojas.
    5. Incubar los cobertores en el Matrigel durante 1 h a 37 °C en la incubadora de CO2 .
      NOTA: Retire el Matrigel antes de la siembra celular. Este Matrigel se puede recoger y almacenar a 4 °C para múltiples reutilizaciones.
  3. Preparación del plato de cultivo de preplatado
    1. Cubra una placa de cultivo celular de 60 mm con 2 ml de 100 μg/ml de PDL (reconstituya la solución madre de PDL de 1 mg/ml en dH2O estéril) mediante incubación a 37 °C durante 1 h.
    2. Inmediatamente antes de la siembra celular, retire y recoja el PDL usado en un tubo cónico limpio y guárdelo a 4 °C para múltiples reutilizaciones. Enjuague y lave el plato recubierto de PDL tres veces con dH2O estéril. Seque al aire la placa de cultivo antes de la siembra celular.
    3. Use un plato de cultivo celular de 60 mm para sembrar células cosechadas de un máximo de 2 tejidos de cerebelo entero.
    4. Prepare platos de cultivo adicionales para cerebelos adicionales.
      NOTA: Consulte los pasos 2.1.18 y 2.1.19 para el uso del plato de cultivo de preplatación.

2. Día experimental 0

  1. Aislamiento y cultivo de GCP primarios de ratón
    NOTA: El método de cultivo GCP se modificó a partir de un protocolo estándar, y el breve protocolo se describió brevemente en nuestro trabajo anterior.6,11,12. Para un rendimiento óptimo de GCP, use cachorros postnatales (P) día 6 o P7 para el aislamiento de GCP. Complete los siguientes pasos de disección 2.1.6-2.1.10 lo más rápido posible para una viabilidad celular óptima.
    1. SFM precalentado, medio de bloqueo de la digestión, medio de cultivo y Opti-MEM a 37 °C durante la disección.
    2. En un banco limpio, precongele todo el aparato de disección en etanol al 70% para la desinfección.
    3. Llene una placa de cultivo celular de 60 mm con 2-3 ml de tampón de disección y enfríela en hielo.
    4. Preparar un tampón de digestión fresco como se describe en la sección 1.1.5 y mantenerlo caliente a 37 °C.
    5. Use etanol al 70% para limpiar la cabeza del cachorro para la desinfección.
    6. Decapitar al cachorro sin anestesia. Use fórceps para sostener la cabeza y tijeras quirúrgicas esterilizadas para cortar desde la parte posterior del cráneo para decapitar al cachorro. Retire cuidadosamente la piel y el cráneo para descubrir el cerebro mediante el uso de fórceps.
    7. Use fórceps para pellizcar el cerebelo y remojarlo rápidamente en el tampón de disección preenfriado preparado en el paso 2.1.3.
    8. Retire las meninges con el cerebelo sumergido en el tampón de disección bajo un microscopio de disección. Las meninges enriquecidas con vasos sanguíneos deben aparecer rosadas bajo el microscopio de disección.
    9. Retire todas las meninges usando fórceps.
      NOTA: Un cerebelo sin meninges debe tener una apariencia blanquecina.
    10. Retire cualquier tejido cerebral medio visible y el plexo coroideo del cerebelo.
    11. Transfiera el cerebelo a un plato de cultivo de 35 mm prellenado con tampón de digestión caliente preparado en el paso 2.1.4. Evite transferir el exceso de tampón de disección. Corte el cerebelo en trozos finos usando tijeras de microespring lo más rápido posible.
    12. Incubar inmediatamente el cerebelo picado a 37 °C durante 15 min en una incubadora de CO2 . Extender el tiempo de incubación a 20 min si se van a procesar más de 4 cerebelos.
      NOTA: Después de la incubación, el tejido se agrupará.
    13. Transfiera inmediatamente el tejido digerido al fondo de un nuevo tubo de centrífuga estéril de 15 ml utilizando una punta de pipeta P1000 prehumedecida con medio de bloqueo de la digestión (evite transferir el tampón de digestión).
    14. Agregue un volumen apropiado de medio de bloqueo de la digestión (1 ml por 1 cerebelo) para terminar la digestión y pipetee hacia arriba y hacia abajo suavemente 30 veces usando una micropipeta P1000 para disociar aún más el tejido en una suspensión unicelular. Evite la formación de burbujas de aire.
    15. Pase suavemente la suspensión celular a través de un colador celular de 70 μm en un nuevo tubo de centrífuga estéril para eliminar los grupos celulares.
    16. Pase 1 ml adicional de medio de bloqueo de digestión fresca a través del colador celular para recolectar células residuales del colador celular.
    17. Centrifugar el filtrado a 200 × g durante 5 min a temperatura ambiente (RT). Retire el sobrenadante y vuelva a suspender el pellet con 1 ml de SFM. Repita este paso dos veces. Evite formar burbujas de aire.
    18. Resuspender el pellet en un volumen final de 2 ml de medio de cultivo GCP y transferir la suspensión celular al plato de cultivo preplatado de 60 mm recubierto de PDL preparado en la etapa 1.3. Incubar durante 15 min a 37 °C en una incubadora de CO2 .
      NOTA: No exceda los 20 min.
    19. Después de la incubación, golpee la placa de cultivo desde un lado para desalojar las células GCP poco adherentes. Recoger las células GCP adherentes en medio de cultivo mediante pipeteo suave con una pipeta P1000. Recoja esta suspensión GCP en un nuevo tubo centrífugo de 15 ml. Deseche el plato de 60 mm.
      NOTA: Las células de astroglia y fibroblastos fuertemente adherentes permanecerán unidas en el fondo del plato de 60 mm y se separarán en este paso. Omitir este paso comprometerá la pureza de la cultura GCP.
    20. Cuente las celdas y proceda a la electroporación inmediatamente.
  2. Día in vitro (DIV) 0: Electroporación para la sobreexpresión transgénica del receptor Hh: pEGFP-Smo
    1. Para la electroporación utilizando una cubeta de 2 mm de espacio, prepare la siguiente mezcla de electroporación de células plásmidos para cada reacción de electroporación: 1,2 × 106 celdas y 10 μg de pEGFP-mSmo (ajuste la concentración de existencias de ADN a ~ 2-5 μg / μL en tampón Tris-EDTA o dH2O estéril) en 100 μL de Opti-MEM.
      NOTA: Reduzca el número total de celdas si las celdas son insuficientes (aunque esto puede reducir la eficiencia de la electroporación). Sin embargo, no ajuste la cantidad de plásmido ni el volumen total de Opti-MEM utilizado por cubeta. Si el número total de celdas requerido para el experimento excede 1.5 × 106 celdas, amplíe la mezcla de electroporación en consecuencia y realice múltiples reacciones de electroporación por separado. La cubeta se puede reutilizar hasta 5 veces.
    2. Prepare la placa de siembra de la celda de post-electroporación agregando 0.5 ml de medio de cultivo en cada pocillo de la placa de cultivo de 24 pocillos que contiene hojas de cubierta recubiertas (desde el paso 1.2) y manténgala caliente a 37 ° C en una incubadora de CO2 .
    3. A partir del paso 2.1.20, pipetear el número requerido de células en un tubo de microcentrífuga estéril de 1,5 ml y girar a 200 × g durante 5 min a RT. Deseche el sobrenadante y vuelva a suspender el pellet celular en 200 μL de Opti-MEM. Repita este paso dos veces con Opti-MEM para asegurarse de que no haya medio de cultivo residual presente en el tubo
      NOTA: Por cada pozo/cubierta de una placa de 24 pocillos, electroporato y semilla 1.2-1.3 × 106 células/pozo para obtener ~70-75% de confluencia celular al día siguiente de cultivo.
    4. Establezca los parámetros de electroporación como se muestra en la Tabla 1.
    5. Pipetear la reacción de electroporación suavemente para mezclar bien y usar una punta P200 larga para transferir un volumen exacto de 100 μL de la mezcla a la cubeta de 2 mm de espacio. Evite formar burbujas.
    6. Coloque la cubeta en la cámara de la cubeta.
    7. Presione el botón Ω del electroporador (consulte la Tabla de materiales) y anote el valor de impedancia, que debe ser ~ 30-35. Para garantizar que el valor de impedancia eléctrica Ω se encuentre dentro del rango de 30-35, adherirse a un volumen preciso de 100 μL.
    8. Pulse el botón de inicio para iniciar el pulso.
    9. Registre los valores de la corriente medida y los julios que se muestran en el marco de lectura.
    10. Retire la cubeta de la cámara de la cubeta.
    11. Agregue inmediatamente 100 μL de medio de cultivo precalentado en la cubeta y vuelva a suspenderlo mediante un pipeteo suave hacia arriba y hacia abajo 2-3 veces. Transfiera inmediatamente la suspensión de la celda a la placa de 24 pocillos preparada en el paso 2.2.2.
      NOTA: Para minimizar la muerte celular, sembra las células inmediatamente después de la electroporación.
    12. Incubar las células a 37 °C en una incubadora de CO2 . Deje las células sin perturbar durante 3 h para evitar el desprendimiento celular.
    13. A las 3 h después de la siembra, aspire suavemente y deseche la mitad del medio sobrenadante para eliminar las células muertas flotantes y los desechos y reemplazarlos con la misma cantidad de medio de cultivo precalentado.
    14. Incubar las células a 37 °C en la incubadora de CO2 y reponer la mitad del medio cada dos días.
    15. Observe las células bajo el microscopio de fluorescencia al día siguiente, es decir, DIV1 (Figura 1) para la señal GFP para determinar la eficiencia de la sobreexpresión de Smo.
    16. Para la estimulación de la vía de señalización de Hh en DIV 1 después de reponer la mitad del medio, agregue 0.2 μM agonista suavizado (SAG) a las células mientras agrega un volumen igual de DMSO al control. Incubar durante 24 h antes de la fijación celular.
      NOTA: Mantenga el volumen de DMSO/SAG agregado lo más bajo posible. Aquí, se agregaron 0.5 μL DMSO o 0.5 μL de 0.2 mM SAG por 500 μL de medio por pozo, que es una relación de dilución de 1: 1,000.

3. DIV 2: Visualización de cilios primarios e investigación de la vía de señalización Hh

  1. Fijación celular
    1. A las 24 h después del tratamiento, retire el medio de cultivo y enjuague las células 2-3 veces con solución salina tamponada con fosfato (PBS) con una pipeta Pasteur desechable mientras evita desalojar las células.
    2. Fije las células agregando ~ 400 μL de paraformaldehído al 4% (preparado en PBS) e incube en RT durante 10 min.
    3. Enjuague y lave 2-3 veces con PBS usando una pipeta Pasteur desechable.
    4. Conservar en PBS a 4 °C durante un máximo de 2 meses o proceder a la inmunotinción.
  2. Tinción inmunocitoquímica de GCP y marcador de cilio primario
    1. En una placa de 24 pocillos, lave las células dos veces en PBS con agitación suave durante 5 minutos cada vez.
    2. Agregue 0.5 ml de cloruro de amonio de 100 mM a la célula e incube en RT durante 10 minutos para apagar el fijador.
    3. Enjuague una vez y lave 2-3 veces con PBS con agitación suave durante 10 minutos cada vez.
    4. Pipetee suavemente 30 μL de tampón de bloqueo (BB: 0.1% Triton X-100, 1% BSA, 2% de suero de caballo inactivado por calor en PBS) sobre un trozo de parafilm para formar una gota sin burbujas de aire.
    5. Transfiera suavemente el coverlip desde el pozo a la gota BB con el lado sembrado de célula hacia abajo. Incubar las células con BB en una cámara húmeda durante 1 h en RT.
    6. Prepare la mezcla de anticuerpos primarios en BB como se muestra en la Tabla de materiales. Para sondear las células con anticuerpo primario, repita los pasos 3.2.4 y 3.2.5, reemplazando BB con la mezcla de anticuerpos primarios. Incubar las células con el anticuerpo primario durante 2 h en RT.
    7. Usando fórceps, transfiera las cubiertas de regreso a la placa de 24 pocillos con el lado sembrado de la celda hacia arriba. Enjuague las células una vez y lave 3-4 veces en PBS con agitación suave durante 10 minutos cada vez.
    8. Prepare la mezcla secundaria de anticuerpos en BB como se muestra en la Tabla de materiales. Para incubar las células con el anticuerpo secundario, repita los pasos 3.2.4 y 3.2.5, reemplazando BB con la mezcla de anticuerpos secundarios. Incubar en la oscuridad durante 1 h en RT.
    9. Repita el paso 3.2.7 para el lavado postsecundario de incubación de anticuerpos.
    10. Monte el trozo de cubierta en un portaobjetos de vidrio microscópico limpio utilizando el medio de montaje.
    11. Seque al aire el deslizamiento en la oscuridad durante la noche y proceda a la obtención de imágenes confocales13.

Resultados

Utilizando el Opti-MEM (ver la Tabla de Materiales) como reactivo universal, esta metodología de electroporación propuesta podría lograr una eficiencia de electroporación consistentemente alta a ~ 80-90% (Figura 1). La eficiencia de electroporación del vector Smo-EGFP se determinó en DIV 2 después de la electroporación mediante la cuantificación del porcentaje de células verdes positivas para fluorescencia en todas las células GCP pareadas que expresan la proteín...

Discusión

La transfección de transgenes en cultivo primario de GCP por electroporación se asocia típicamente con baja viabilidad celular y baja eficiencia de transfección9,10. Este documento presenta un protocolo de electroporación rentable y reproducible que ha demostrado una alta eficiencia y viabilidad. Además, también demostramos un método sencillo para estudiar la vía de señalización Hh dependiente del cilio primario en células GCP primarias.

Divulgaciones

Los autores no tienen conflictos de intereses que declarar.

Agradecimientos

Este estudio fue apoyado por HKBU Seed Fund y Tier-2 Start-up Grant (RG-SGT2/18-19/SCI/009), Research Grant Council-Collaborative Research Fund (CRF-C2103-20GF) a C.H.H. Hor.

Materiales

NameCompanyCatalog NumberComments
GCP Culture
B27 supplementLife Technologies LTD17504044
Cell strainer, 70 µmCorning352350
DNase I from bovine pancreasRoche11284932001
Earle’s Balanced Salt SolutionGibco, Life Technologies14155063
FBS, qualifiedThermo ScientificSH30028.02
GlutamMAXTM-I ,100xGibco, Life Technologies35050061L-glutamine substitute
L-cysteineSigma AldrichC7352
MatrigelBD Biosciences354277Basement membrane matrix
NeurobasalGibco, Life Technologies21103049
Papain,suspensionWorthington Biochemical CorporationLS003126
Poly-D-lysine HydrobromideSigma AldrichP6407
SAGCayman Chemical11914-1Smoothened agonist
IF staining
Bovine Serum AlbuminSigma AldrichA7906
ParaformaldehydeSigma AldrichP6148
Triton X-100Sigma AldrichX100
Primary antibody mix
Anti-GFP-goat abRockland600-101-215Dilution Factor: 1 : 1000
Anti-Arl13b mouse monoclonal abNeuroMab75-287Dilution Factor: 1 : 1000
Anti-Pax6 rabbit polyclonal abCovancePRB-278PDilution Factor: 1 : 1000
Secondary antibody mix
Alexa Fluor 488 donkey anti-goat IgGInvitrogenA-11055Dilution Factor: 1 : 1000
Alexa Fluor 555 donkey anti-mouse IgGInvitrogenA-31570Dilution Factor: 1 : 1000
Alexa Fluor 647 donkey anti-rabbit IgGInvitrogenA-31573Dilution Factor: 1 : 1000
DAPIThermo Scientific62247Dilution Factor: 1 : 1000
Electroporation
CU 500 cuvette chamberNepageneCU500
EPA Electroporation cuvette (2 mm gap)NepageneEC-002
Opti-MEMLife Technologies LTD31985070reduced-serum medium for transfection
pEGFP-mSmoAddgene25395
Super Electroporator NEPA21 TYPE II In Vitro and In Vivo ElectroporationNepageneNEPA21electroporator

Referencias

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  2. Dahmane, N., Ruizi Altaba, A. Sonic Hedgehog regulates the growth and patterning of the cerebellum. Development. 126 (14), 3089-3100 (1999).
  3. Lewis, P. M., Gritti-Linde, A., Smeyne, R., Kottmann, A., Mcmahon, A. P. Sonic Hedgehog signaling is required for expansion of granule neuron precursors and patterning of the mouse cerebellum. Developmental Biology. 270 (2), 393-410 (2004).
  4. Wechsler-Reya, R. J., Scott, M. P. Control of neuronal precursor proliferation in the cerebellum by Sonic Hedgehog. Neuron. 22 (1), 103-114 (1999).
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  14. Corbit, K. C., et al. Vertebrate Smoothened functions at the primary cilium. Nature. 437 (7061), 1018-1021 (2005).

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