Método de eletroporação eficiente e econômico para estudar vias de sinalização dependentes de cítio primário no precursor da célula de grânulo

Resumo

Aqui, apresentamos um protocolo de eletroporação in vitro reprodutível para manipulação genética de precursores primários de células de grânulo cerebelar (GCPs) que é econômico, eficiente e viável. Além disso, este protocolo também demonstra um método simples para o estudo molecular de vias primárias de sinalização de Ouriço dependentes de cílios em células GCP primárias.

Resumo

O cílio primário é uma organela de sinalização crítica encontrada em quase todas as células que transduzem os estímulos de sinalização de Hedgehog (HH) da superfície celular. No precursor da célula de grânulo (GCP), o cílio primário atua como um centro de sinalização crucial que orquestra a proliferação de células precursoras modulando a via de sinalização HH. A investigação do maquinário de sinalização HH, dependente do cítio primário, é facilitada pela manipulação genética in vitro dos componentes da via para visualizar sua localização dinâmica para o círio primário. No entanto, a transfecção de transgenes nas culturas primárias dos GCPs usando os métodos de eletroporação atualmente conhecidos é geralmente cara e muitas vezes resulta em baixa viabilidade celular e eficiência de transfecção indesejável. Este artigo introduz um protocolo de eletroporação eficiente, econômico e simples que demonstra uma alta eficiência de transfecção de ~80-90% e a viabilidade celular ideal. Trata-se de um método de modificação genética simples, reprodutível e eficiente que é aplicável ao estudo da via de sinalização de Ouriço dependente do cilium primário nas culturas primárias do GCP.

Introdução

Os GCPs cerebelares são amplamente utilizados para estudar o maquinário da via de sinalização HH em tipos de células progenitoras neuronais devido à sua alta abundância e alta sensibilidade à via de sinalização HH em vivo1,2,3,4. Em GCPs, o cílio primário atua como um hub de transdução de sinal HH ^crucial5 que orquestra a proliferação das células precursoras6,7,8. A visualização in vitro de componentes de sinalização de HH no cílio primário é muitas vezes desafiadora devido aos seus baixos níveis basais endógenos. Assim, a modificação transgênica dos níveis de expressão proteica e a marcação fluorófora do gene de interesse são abordagens úteis para estudar o caminho na resolução molecular. No entanto, a manipulação genética das culturas primárias do GCP usando abordagens de transfecção baseadas em liposome muitas vezes resultam em baixa eficiência de transfecção, dificultando novas investigações ^moleculares9. A eletroporação aumenta a eficiência, mas geralmente requer reagentes de eletroporação exorbitantes específicos do fornecedor e restritos ao tipo ^celular10.

Este artigo introduz um método de eletroporação de alta eficiência e custo-benefício para manipular os componentes da via de sinalização HH nas culturas primárias GCP. Usando este protocolo de eletroporação modificado, um transgene smoothened smoothened (pEGFP-Smo) com marca verde foi fornecido eficientemente aos GCPs e alcançou altas taxas de sobrevivência celular e transfecção (80-90%). Além disso, como evidenciado pela coloração imunocitômica, os GCPs transfectados mostraram alta sensibilidade à ativação agonista induzida pelo HH pelo tráfico de EGFP-Smo para a cília primária. Este protocolo deve ser diretamente aplicável e benéfico para experimentos que envolvem modificação genética in vitro de tipos celulares difíceis de transfetar, como culturas de células primárias humanas e roedores, bem como células-tronco pluripotentes induzidas pelo homem.

Protocolo

Todos os procedimentos relacionados aos animais foram realizados em conformidade com as diretrizes de manejo animal e o protocolo aprovado pelo Departamento de Saúde de Hong Kong. Licenças de experimentos em animais após a Portaria Animal (Controle de Experimentos) (Cap. 340) foram obtidas do Departamento de Saúde, governo de Hong Kong. O trabalho animal foi realizado em conformidade com a ética de segurança animal aprovada pelo Escritório de Pesquisa da HKBU e pelo Comitê de Segurança laboratorial. Consulte a Tabela de Materiais para obter detalhes sobre todos os materiais utilizados neste protocolo.

1. Preparação pré-experiência

1. Preparação de meios de comunicação culturais e buffers
   1. Meio livre de soro (SFM)
      1. Para preparar 50 mL de SFM, adicione 500 μL de 100x L-glutamina substituto, 500 μL de Penicillin-Streptomicina, 1 mM de piruvanato de sódio e 12,5 μL de 1 M KCl (final 250 μM) a 49 mL de meio neurobásal.
      2. Divida o SFM em 2 alíquotas de 10 mL e 40 mL em tubos cônicos de 50 mL e armazene-os a 4 °C por até um mês.
   2. Meio de bloqueio de digestão: 10% FBS em SFM
      1. Adicione 1,1 mL de FBS inativados a calor a uma alíquota de 10 mL de SFM para preparar o meio de bloqueio de digestão.
   3. Meio de cultura GCP: SFM com B27
      1. Para preparar o meio de cultura GCP, adicione 800 μL de suplemento B-27 sem soro a uma alíquota de 40 mL de SFM.
         NOTA: O SFM com suplemento B-27 pode ser armazenado a 4 °C por até um mês. No entanto, as mídias recém-preparadas produzem resultados ótimos.
   4. Tampão de dissecção: EBSS com glicose + HEPES
      1. Adicione 6 g/L de glicose à Solução de Sal Balanceado (EBSS) sem cálcio e magnésio, contendo 10 mM HEPES (4-(2-hidroxitil)-1-ácido piperazineethanesulfônico).
      2. Esterilize a solução passando por um filtro de seringa de 0,2 μm e armazene-a a 4 °C para armazenamento a longo prazo.
   5. Tampão de digestão
      NOTA: Prepare-se fresco antes do uso.
      1. Prepare 2 mL de tampão de digestão para a digestão de 2-4 tecidos cerebelares e 4 mL para 4-10 tecidos. Para preparar 4 mL de tampão de digestão, dissolva 1,5 mg de L-cisteína (concentração final 200-400 μg/mL) em 4 mL de EBSS. Inverta o tubo repetidamente até que o pó esteja totalmente dissolvido.
      2. Esterilize a solução usando um filtro de seringa de 0,2 μm e uma seringa de 5 mL, e transfira a solução para um prato de cultura celular estéril de 35 mm.
      3. Adicione 4 μL de papain (diluição de 1:1.000 de uma concentração de estoque de 20 unidades/mg) e 40 μL de DNase I (diluição de 1:100 de um estoque de 10 mg/mL para uma concentração final de 0,1 mg/mL).
      4. Incubar a solução a 37 °C em uma incubadora de _CO2 por pelo menos 30 min ou até usar.
         NOTA: Este passo é fundamental para ativar o papain. Para obter resultados ótimos, não exceda 45 min a 37 °C antes de usar. Certifique-se de que a solução se torne transparente e que não haja precipitados brancos antes de usar.
2. Tampas de pré-revestimento
   1. Para preparar as tampas para fixação celular, incubar tampas de vidro autoclaved de 12 mm com 100 μg/mL de poli-D-lisina (PDL, 1 mg/mL em _dH2O estéril) por pelo menos 1 h a 37 °C. Mantenha as tampas na mesma solução PDL a 4 °C até usar.
   2. No dia da cultura celular primária, colete o PDL em um tubo cônico limpo e enxágue as tampas três vezes com _dH2O estéril completamente para remover pDL residual.
      NOTA: O PDL pode ser armazenado a 4 °C para reutilização.
   3. Transfira as tampas de vidro revestidas de PDL para uma placa de 24 poços colocando uma mancha de cobertura em cada poço.
   4. Remova o excesso de água e adicione 200-300 μL de Matrigel (reconstituído de acordo com as instruções na folha de dados do produto no DMEM-F12 sem soro) para cobrir totalmente as tampas.
   5. Incubar as tampas no Matrigel por 1h a 37 °C na incubadora de _CO2 .
      NOTA: Remova o Matrigel antes da semeadura da célula. Este Matrigel pode ser coletado e armazenado a 4 °C para múltiplos reusos.
3. Preparação de prato de cultura de pré-plating
   1. Cubra um prato de cultura celular de 60 mm com 2 mL de 100 μg/mL PDL (reconstitua a solução de estoque PDL de 1 mg/mL em _dH2O estéril) por incubação a 37 °C por 1 h.
   2. Imediatamente antes da semeadura da célula, remova e colete o PDL usado em um tubo cônico limpo e armazene-o a 4 °C para múltiplos reutilizações. Enxágüe e lave o prato revestido de PDL três vezes com _dH2O estéril.
   3. Use um prato de cultura celular de 60 mm para células de sementes colhidas de um máximo de 2 tecidos de cerebelo inteiro.
   4. Prepare pratos de cultura adicionais para cerebelos adicionais.
      NOTA: Veja as etapas 2.1.18 e 2.1.19 para o uso do prato de cultura pré-plating.

2. Dia experimental 0

1. Isolamento e cultivo de GCPs primários do mouse
   NOTA: O método de cultura GCP foi modificado a partir de um protocolo padrão, e o breve protocolo foi brevemente descrito em nosso trabalho anterior^6,11,12. Para o rendimento ideal do GCP, use filhotes pós-natal (P) dia 6 ou P7 para o isolamento do GCP. Complete as seguintes etapas de dissecção 2.1.6-2.1.10 o mais rápido possível para a viabilidade celular ideal.
   1. SFM pré-inaque, médio de bloqueio de digestão, meio de cultura e Opti-MEM a 37 °C durante a dissecção.
   2. Em um banco limpo, prensa todo o aparelho de dissecção em 70% de etanol para desinfecção.
   3. Encha um prato de cultura celular de 60 mm com 2-3 mL de tampão de dissecção e esfrie-o no gelo.
   4. Prepare o tampão de digestão fresco conforme descrito na seção 1.1.5 e mantenha aquecido a 37 °C.
   5. Use 70% de etanol para limpar a cabeça do filhote para desinfecção.
   6. Decapite o filhote sem anestesia. Use fórceps para segurar a cabeça e uma tesoura cirúrgica esterilizada para cortar da parte de trás do crânio para decapitar o filhote. Remova cuidadosamente a pele e o crânio para descobrir o cérebro usando fórceps.
   7. Use fórceps para beliscar o cerebelo e mergulhá-lo rapidamente no tampão de dissecção pré-refrigerado preparado na etapa 2.1.3.
   8. Remova as meninges com o cerebelo submerso no tampão de dissecção sob um microscópio dissecando. Meninges enriquecidos com vasos sanguíneos devem parecer rosados sob o microscópio dissecando.
   9. Remova todas as meninges usando fórceps.
      NOTA: Um cerebelo sem meninges deve ter uma aparência esbranquiçada.
   10. Remova quaisquer tecidos de cérebro médio visíveis e o plexo coroide do cerebelo.
   11. Transfira o cerebelo para um prato de cultura de 35 mm pré-preenchido com tampão de digestão quente preparado na etapa 2.1.4. Evite transferir o buffer de dissecção em excesso. Corte o cerebelo em pedaços finos usando uma tesoura de microspring o mais rápido possível.
   12. Incuba imediatamente o cerebelo picado a 37 °C por 15 min em uma incubadora de _CO2 . Estenda o tempo de incubação para 20 min se mais de 4 cerebelos forem processados.
       NOTA: Após a incubação, o tecido se agrupará.
   13. Transfira imediatamente o tecido digerido para o fundo de um novo tubo de centrífuga estéril de 15 mL usando uma prewet de ponta de pipeta P1000 com meio de bloqueio de digestão (evite transferir tampão de digestão).
   14. Adicione um volume apropriado de meio de bloqueio de digestão (1 mL para 1 cerebelo) para terminar a digestão e pipeta para cima e para baixo suavemente 30 vezes usando uma micropipette P1000 para dissociar ainda mais o tecido em uma suspensão de célula única. Evite a formação de bolhas de ar.
   15. Passe suavemente a suspensão celular através de um coador de células de 70 μm em um novo tubo de centrífuga estéril para remover aglomerados celulares.
   16. Passe um adicional de 1 mL de bloqueio de digestão fresca através do coador celular para coletar células residuais do coador celular.
   17. Centrifugar o filtrado a 200 × g por 5 min a temperatura ambiente (RT). Remova o supernatante e resuspenda a pelota com 1 mL de SFM. Repita este passo duas vezes. Evite formar bolhas de ar.
   18. Resuspenque a pelota em um volume final de 2 mL de cultura GCP média e transfira a suspensão celular para o prato de cultura de pré-chapa de 60 mm revestido de PDL preparado na etapa 1.3. Incubar por 15 min a 37 °C em uma incubadora de _CO2 .
       NOTA: Não exceda 20 min.
   19. Após a incubação, toque o prato de cultura do lado para desalojar as células GCP frouxamente aderentes. Colete as células GCP aderentes em meio de cultura através de pipetas suaves usando uma pipeta P1000. Colete esta suspensão GCP em um novo tubo de centrífuga de 15 mL. Descarte o prato de 60 mm.
       NOTA: As células de astroglia e fibroblasto fortemente aderentes permanecerão presas no fundo da louva de 60 mm e serão separadas nesta etapa. Omitir essa etapa comprometerá a pureza da cultura GCP.
   20. Conte as células e prossiga para eletroporação imediatamente.
2. Dia in vitro (DIV) 0: Eletroporação para superexpressão transgênica do receptor Hh: pEGFP-Smo
   1. Para eletroporação usando um cuvette gap de 2 mm, preparar a seguinte mistura de eletroporação de células plasmidas para cada reação de eletroporação: 1,2 × ¹⁰⁶ células e 10 μg de pEGFP-mSmo (ajuste a concentração de estoque de DNA para ~2-5 μg/μL em tampão Tris-EDTA ou _dH2O estéril) em 100 μL de Opti-MEM.
      NOTA: Reduza o número total de células se as células forem insuficientes (embora isso possa reduzir a eficiência da eletroporação). No entanto, não ajuste a quantidade de plasmídeo nem o volume total de Opti-MEM usado por cuvette. Se o número total de células necessários para o experimento exceder 1,5 × ¹⁰⁶ células, aumente a mistura de eletroporação de acordo e realize múltiplas reações de eletroporação separadamente. O cuvette pode ser reutilizado até 5 vezes.
   2. Prepare a placa de semeadura de células pós-eletroporação adicionando 0,5 mL de meio de cultura em cada poço da placa de cultura de 24 poços contendo tampas revestidas (a partir do passo 1.2) e mantenha-a aquecida a 37 °C em uma incubadora de _CO2 .
   3. A partir do passo 2.1.20, pipeta o número necessário de células em um tubo de microcentrifuge de 1,5 mL e gire a 200 × g por 5 min na RT. Descarte o supernascer e resuspense a pelota de célula em 200 μL de Opti-MEM. Repita esta etapa duas vezes com opti-MEM para garantir que nenhum meio de cultura residual esteja presente no tubo
      NOTA: Para cada poço/cobertura de uma placa de 24 poços, eletroporato e semente 1.2-1.3 × ¹⁰⁶ células/poço para obter ~70-75% de confluência celular no dia seguinte da cultura.
   4. Defina os parâmetros de eletroporação conforme mostrado na Tabela 1.
   5. Pipete a reação de eletroporação suavemente para misturar bem e use uma longa ponta P200 para transferir um volume exato de 100 μL da mistura para o cuvette gap de 2 mm. Evite formar bolhas.
   6. Coloque a cuvette na câmara de cuvette.
   7. Pressione o botão Ω do eletroporador (veja a Tabela de Materiais) e anote o valor de impedância, que deve ser ~30-35. Para garantir que o valor de impedância elétrica Ω se enquadra na faixa de 30-35, adere a um volume preciso de 100 μL.
   8. Pressione o botão de partida para iniciar o pulso.
   9. Registre os valores da corrente medida e os joules mostrados no quadro de leitura.
   10. Remova a cuvette da câmara de cuvette.
   11. Adicione imediatamente 100 μL de meio de cultura pré-armado no cuvette e resuspensá-lo por tubos suaves para cima e para baixo 2-3 vezes. Transfira imediatamente a suspensão do celular para a placa de 24 poços preparada na etapa 2.2.2.
       NOTA: Para minimizar a morte celular, semear as células imediatamente após a eletroporação.
   12. Incubar as células a 37 °C em uma incubadora de _CO2 . Deixe as células imperturbáveis por 3h para evitar o descolamento celular.
   13. Às 3h pós semeadura, aspire suavemente e descarte metade do meio supernante para remover células mortas flutuantes e detritos e substituir pela mesma quantidade de meio de cultura pré-enlouquecida.
   14. Incubar as células a 37 °C na incubadora de _CO2 e reabastecer metade do meio a cada dois dias.
   15. Observe as células sob o microscópio de fluorescência no dia seguinte, ou seja, DIV1 (Figura 1) para sinal GFP para determinar a eficiência da superexpressão do Smo.
   16. Para a estimulação da via de sinalização HH no DIV 1 após a reposição de metade do meio, adicione 0,2 μM Agonista suave (SAG) às células, adicionando um volume igual de DMSO ao controle. Incubar por 24 horas antes da fixação celular.
       NOTA: Mantenha o volume de DMSO/SAG adicionado o mais baixo possível. Aqui, 0,5 μL DMSO ou 0,5 μL de 0,2 mM SAG foi adicionado por 500 μL de médio por poço, que é uma taxa de diluição de 1:1.000.

3. DIV 2: Visualização de cílios primários e investigação da via de sinalização HH

1. Fixação celular
   1. No pós-tratamento 24h, remova o meio de cultura e enxágue as células 2-3 vezes com soro fisiológico tamponado de fosfato (PBS) usando uma pipeta Pasteur descartável enquanto evita desalojar as células.
   2. Fixar as células adicionando ~400 μL de 4% de paraformaldeído (preparado em PBS) e incubar em RT por 10 minutos.
   3. Enxágüe e lave 2-3 vezes com PBS usando uma pipeta Pasteur descartável.
   4. Armazene em PBS a 4 °C por até 2 meses ou proceda para imunossuagem.
2. Coloração imunocitoquímica de GCPs e marcador de cílio primário
   1. Em uma placa de 24 poços, lave as células duas vezes em PBS com agitação suave por 5 minutos cada vez.
   2. Adicione 0,5 mL de cloreto de amônio de 100 mM à célula e incubar na RT por 10 minutos para saciar o fixador.
   3. Enxágüe uma vez e lave 2-3 vezes com PBS com agitação suave por 10 minutos cada vez.
   4. Pipeta suavemente 30 μL de tampão de bloqueio (BB: 0,1% Triton X-100, 1% BSA, 2% soro de cavalo inativado a calor na PBS) em um pedaço de parafilme para formar uma gotícula sem bolhas de ar.
   5. Transfira suavemente o deslizamento do poço para a gota BB com o lado semeado por célula voltado para baixo. Incubar as células com BB em uma câmara úmida por 1 h na RT.
   6. Prepare a mistura de anticorpos primários em BB, conforme mostrado na Tabela de Materiais. Para sondar as células com anticorpos primários, repita as etapas 3.2.4 e 3.2.5, substituindo BB pela mistura de anticorpos primários. Incubar as células com o anticorpo primário por 2 h na RT.
   7. Usando fórceps, transfira as tampas de volta para a placa de 24 poços com o lado semeado de célula voltado para cima. Enxágüe as células uma vez e lave 3-4 vezes em PBS com agitação suave por 10 minutos cada vez.
   8. Prepare o mix secundário de anticorpos em BB, conforme mostrado na Tabela de Materiais. Para incubar as células com o anticorpo secundário, repita as etapas 3.2.4 e 3.2.5, substituindo bb pela mistura de anticorpos secundários. Incubar no escuro por 1h no RT.
   9. Repita o passo 3.2.7 para lavagem pós-secundária de incubação de anticorpos.
   10. Monte a tampa em um slide de vidro microscópico limpo usando meio de montagem.
   11. Seque o escorregador no escuro durante a noite e prossiga para imagens ^confocal13.

Resultados

Utilizando o Opti-MEM (ver a Tabela de Materiais) como reagente universal, esta metodologia de eletroporação proposta poderia alcançar eficiência de eletroporação consistentemente alta em ~80-90% (Figura 1). A eficiência de eletroporação do vetor Smo-EGFP foi determinada em DIV 2 pós eletroporação por quantificação da porcentagem de células positivas de fluorescência verde em todas as células GCP que expressam proteína de caixa emparelhada-6 (Pax6). A efici...

Discussão

A transfecção de transgenes na cultura GCP primária pelo método de eletroporação é tipicamente associada à baixa viabilidade celular e à baixa eficiência de transfecção9,10. Este artigo introduz um protocolo de eletroporação econômico e reprodutível que demonstrou alta eficiência e viabilidade. Além disso, também demonstramos um método simples de estudar a via de sinalização HH dependente do círio primário nas células GCP primárias.

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Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
GCP Culture
B27 supplement	Life Technologies LTD	17504044
Cell strainer, 70 µm	Corning	352350
DNase I from bovine pancreas	Roche	11284932001
Earle’s Balanced Salt Solution	Gibco, Life Technologies	14155063
FBS, qualified	Thermo Scientific	SH30028.02
GlutamMAXTM-I ,100x	Gibco, Life Technologies	35050061	L-glutamine substitute
L-cysteine	Sigma Aldrich	C7352
Matrigel	BD Biosciences	354277	Basement membrane matrix
Neurobasal	Gibco, Life Technologies	21103049
Papain,suspension	Worthington Biochemical Corporation	LS003126
Poly-D-lysine Hydrobromide	Sigma Aldrich	P6407
SAG	Cayman Chemical	11914-1	Smoothened agonist
IF staining
Bovine Serum Albumin	Sigma Aldrich	A7906
Paraformaldehyde	Sigma Aldrich	P6148
Triton X-100	Sigma Aldrich	X100
Primary antibody mix
Anti-GFP-goat ab	Rockland	600-101-215	Dilution Factor: 1 : 1000
Anti-Arl13b mouse monoclonal ab	NeuroMab	75-287	Dilution Factor: 1 : 1000
Anti-Pax6 rabbit polyclonal ab	Covance	PRB-278P	Dilution Factor: 1 : 1000
Secondary antibody mix
Alexa Fluor 488 donkey anti-goat IgG	Invitrogen	A-11055	Dilution Factor: 1 : 1000
Alexa Fluor 555 donkey anti-mouse IgG	Invitrogen	A-31570	Dilution Factor: 1 : 1000
Alexa Fluor 647 donkey anti-rabbit IgG	Invitrogen	A-31573	Dilution Factor: 1 : 1000
DAPI	Thermo Scientific	62247	Dilution Factor: 1 : 1000
Electroporation
CU 500 cuvette chamber	Nepagene	CU500
EPA Electroporation cuvette (2 mm gap)	Nepagene	EC-002
Opti-MEM	Life Technologies LTD	31985070	reduced-serum medium for transfection
pEGFP-mSmo	Addgene	25395
Super Electroporator NEPA21 TYPE II In Vitro and In Vivo Electroporation	Nepagene	NEPA21	electroporator