高效且具有成本效益的电穿孔方法研究颗粒细胞前体中的原代纤毛依赖性信号通路

摘要

在这里，我们提出了一种可重复的 体外 电穿孔方案，用于原代小脑颗粒细胞前体（GCP）的遗传操作，具有成本效益，高效且可行。此外，该协议还展示了一种简单的方法，用于原代GCP细胞中原代纤毛依赖性刺猬信号通路的分子研究。

摘要

原代纤毛是一种关键的信号细胞器，几乎存在于从细胞表面转导刺猬（Hh）信号刺激的每个细胞上。在颗粒细胞前体（GCP）中，原代纤毛充当关键信号中心，通过调节Hh信号通路来协调前体细胞增殖。通过对通路成分的 体外 遗传操作来促进原发性纤毛依赖性Hh信号传导机制的研究，以可视化它们对原发性纤毛的动态定位。然而，使用目前已知的电穿孔方法在GCP的初级培养物中转染转基因通常成本高昂，并且通常导致细胞活力低和不良转染效率。本文介绍了一种高效、经济且简单的电穿孔方案，该方案显示出~80-90%的高转染效率和最佳的细胞活力。这是一种简单、可重复且高效的遗传修饰方法，适用于研究原代 GCP 培养物中原发性纤毛依赖性刺猬信号通路。

引言

小脑GCP由于其在体内对Hh信号通路的高丰度和高敏感性，被广泛用于研究神经元祖细胞类型中Hh信号通路的机制^{1，2，3，4}。在GCP中，原发纤毛充当关键的Hh信号转导中枢⁵，协调前体细胞的增殖^6，7，8。原发性纤毛上Hh信号传导成分的体外可视化通常具有挑战性，因为它们的内源性基础水平较低。因此，蛋白质表达水平的转基因修饰和目标基因的荧光团标记是在分子分辨率下研究该途径的有用方法。然而，使用基于脂质体的转染方法对 GCP 原代培养物进行遗传操作通常会导致转染效率低下，从而阻碍进一步的分子研究⁹。电穿孔可提高效率，但通常需要过多的供应商专用和电池类型受限的电穿孔试剂¹⁰。

本文介绍了一种高效且具有成本效益的电穿孔方法，用于操纵基仕伯原代培养物中的Hh信号通路组分。使用这种改良的电穿孔方案，绿色荧光蛋白（GFP）标记的平滑转基因（pEGFP-Smo）有效地递送到GCP，并实现了高细胞存活率和转染率（80-90%）。此外，如免疫细胞化学染色所证明的那样，转染的GCP对平滑激动剂诱导的Hh信号通路激活表现出高度敏感性，方法是将EGFP-Smo转运到原代纤毛。该协议应直接适用于涉及难以转染的细胞类型的 体外 遗传修饰的实验，例如人类和啮齿动物原代细胞培养物，以及人类诱导多能干细胞。

研究方案

所有与动物有关的程序均按照动物处理指引及香港卫生署批准的规程进行。根据《动物（实验控制）条例》（第340章）取得动物实验牌照，已向香港政府卫生署索取。动物工作是按照香港浸会大学研究处及实验室安全委员会批准的动物安全道德规范进行的。有关此协议中使用的所有材料的详细信息，请参阅材料 表 。

1. 体验前准备

1. 培养基和缓冲液的制备
   1. 无血清培养基 （SFM）
      1. 为了制备50mL SFM，向49mL神经基础培养基中加入500μL100x L-谷氨酰胺替代品，500μL青霉素链霉素，1mM丙酮酸钠和12.5μL1M KCl（最终250μM）。
      2. 将SFM分成2个等分试样，在50 mL锥形管中加入10 mL和40 mL，并在4°C下储存长达一个月。
   2. 消化阻断培养基:SFM中10%FBS
      1. 将 1.1 mL 热灭活 FBS 加入 10 mL 等分试样 SFM 中，以制备消化阻断培养基。
   3. 基仕伯培养基:SFM与B27
      1. 要制备 GCP 培养基，将 800 μL 无血清 B-27 补充剂加入 40 mL 等分试样 SFM 中。
         注意:补充B-27的SFM可以在4°C下储存长达一个月。然而，新鲜制备的培养基会产生最佳结果。
   4. 解剖缓冲液:EBSS 与葡萄糖 + HEPES
      1. 将6克/升葡萄糖加入含有10 mM HEPES（4-（2-羟乙基）-1-哌嗪乙烷磺酸）的无钙和镁厄尔平衡盐溶液（EBSS）中。
      2. 通过0.2μm注射器过滤器对溶液进行灭菌，并将其储存在4°C下以进行长期储存。
   5. 消化缓冲液
      注意:使用前请新鲜准备。
      1. 准备2 mL消化缓冲液用于消化2-4个小脑组织，4 mL用于4-10个组织。为了制备4mL消化缓冲液，将1.5mgL半胱氨酸（终浓度200-400μg/ mL）溶解在4mL EBSS中。反复倒置管子，直到粉末完全溶解。
      2. 使用0.2μm注射器过滤器和5mL注射器对溶液进行灭菌，并将溶液转移到无菌的35mm细胞培养皿中。
      3. 加入4μL木瓜蛋白酶（从20单位/mg的储备浓度中稀释1:1，000）和40μLDNase I（从10mg / mL储备液中以1:100稀释，终浓度为0.1mg / mL）。
      4. 将溶液在37°C下在_CO2 培养箱中孵育至少30分钟或直到使用。
         注意:此步骤对于激活木瓜蛋白酶至关重要。为了获得最佳效果，使用前不要在37°C下超过45分钟。使用前确保溶液变透明，没有白色沉淀物。
2. 预涂盖玻片
   1. 为了准备用于细胞附着的盖玻片，在37°C下用100μg/ mL聚-D-赖氨酸（PDL，无菌dH2 O中的1mg / mL）高压灭菌的_12mm玻璃盖玻片孵育至少1小时。 将盖玻片保存在相同的PDL溶液中，温度为4°C，直到使用。
   2. 在原代细胞培养当天，将PDL收集在干净的锥形管中，并用无菌dH ₂ O彻底冲洗盖玻片三次以除去残留的PDL。
      注意:PDL可以储存在4°C下以供重复使用。
   3. 通过将PDL涂层的玻璃盖玻片转移到24孔板上，在每个孔中放置一个盖玻片。
   4. 除去多余的水，加入200-300μL基质凝胶（根据无血清DMEM-F12产品数据表中的说明重组）以完全覆盖盖玻片。
   5. 在_CO2 培养箱中将盖玻片在37°C下在基质凝胶中孵育1小时。
      注意:在细胞接种前取出基质胶。这种基质胶可以收集并储存在4°C下进行多次重复使用。
3. 预镀培养皿的制备
   1. 通过在37°C下孵育1小时，用2mL 100μg/ mL PDL（在无菌dH _2O中重建1mg / mL PDL储备溶液）包衣60mm细胞培养皿。
   2. 在细胞接种之前，立即将用过的PDL取出并收集在干净的锥形管中，并将其储存在4°C以进行多次重复使用。用无菌dH ₂ O冲洗并洗涤PDL包被的培养皿三次。在细胞接种前风干培养皿。
   3. 使用一个60毫米细胞培养皿来接种从最多2个全小脑组织收获的细胞。
   4. 为额外的小脑准备额外的培养皿。
      注意:关于预电镀培养皿的使用，请参见步骤2.1.18和2.1.19。

2. 实验第0天

1. 小鼠原代GCP的分离和培养
   注意:GCP培养方法是从标准协议修改而来的，在我们之前的工作中简要描述了简短的协议^6,11,12.为了获得最佳的 GCP 产量，使用产后 （P） 第 6 天或 P7 幼崽分离 GCP。尽快完成以下解剖步骤2.1.6-2.1.10，以获得最佳细胞活力。
   1. 在解剖过程中，在37°C下预热SFM，消化阻断培养基，培养基和Opti-MEM。
   2. 在干净的工作台上，将所有解剖装置预浸泡在70%乙醇中进行消毒。
   3. 在60 mm细胞培养皿中加入2-3mL解剖缓冲液，并在冰上冷却。
   4. 按照第1.1.5节所述准备新鲜的消化缓冲液，并将其保持在37°C。
   5. 使用70%乙醇擦拭幼崽的头部进行消毒。
   6. 在没有麻醉的情况下将幼崽斩首。使用镊子固定头部，并使用消毒的手术剪刀从颅骨后部切开以斩首幼犬。小心地去除皮肤和颅骨，使用镊子露出大脑。
   7. 使用镊子捏掉小脑，并将其快速浸泡在步骤2.1.3中制备的预冷解剖缓冲液中。
   8. 在解剖显微镜下将小脑浸没在解剖缓冲液中，取出脑膜。富含血管的脑膜在解剖显微镜下应呈粉红色。
   9. 使用镊子去除所有脑膜。
      注意:没有脑膜的小脑应具有白色外观。
   10. 从小脑中去除任何可见的中脑组织和脉络丛。
   11. 将小脑转移到预先填充了步骤2.1.4中制备的温消化缓冲液的35mm培养皿中。避免转移过多的解剖缓冲液。使用微型弹簧剪刀尽快将小脑切成细片。
   12. 立即在_CO2 培养箱中将切碎的小脑在37°C下孵育15分钟。如果要处理超过4个小脑，将孵育时间延长至20分钟。
       注意:孵育后，组织将聚集在一起。
   13. 立即将消化的组织转移到新的无菌15 mL离心管的底部，使用P1000移液器尖端预湿和消化阻塞培养基（避免转移消化缓冲液）。
   14. 加入适当体积的消化阻断培养基（1 mL用于1个小脑）以终止消化，并使用P1000微量移液器轻轻上下移液30次，以进一步将组织解离成单细胞悬浮液。避免气泡形成。
   15. 将细胞悬浮液轻轻地通过70μm细胞过滤器进入新的无菌离心管以除去细胞团块。
   16. 通过细胞过滤器再加入1mL新鲜消化阻断培养基，从细胞过滤器中收集残留细胞。
   17. 在室温（RT）下以200× g 离心滤液5分钟。除去上清液并用1mL SFM重悬沉淀。重复此步骤两次。避免形成气泡。
   18. 将沉淀重悬于最终体积的2mL GCP培养基中，并将细胞悬浮液转移到步骤1.3中制备的PDL包衣的60mm预接种培养皿中。在_CO2 培养箱中在37°C下孵育15分钟。
       注意:不要超过20分钟。
   19. 孵育后，从侧面敲击培养皿以移走松散贴壁的GCP细胞。通过使用P1000移液器轻柔移液，将贴壁的GCP细胞收集培养基中。将这种 GCP 悬浮液收集到新的 15 mL 离心管中。丢弃60毫米培养皿。
       注意:强粘附的星形胶质细胞和成纤维细胞将保持附着在60mm培养皿底部，并将在此步骤中分离。省略此步骤将损害 GCP 培养物的纯度。
   20. 计数细胞并立即进行电穿孔。
2. 日体外（DIV）0:Hh受体转基因过表达的电穿孔:pEGFP-Smo
   1. 对于使用2 mm间隙比色皿的电穿孔，在100μL Opti-MEM中为电穿孔的每次反应制备以下质粒 - 细胞电穿孔混合物:1.2×¹⁰⁶ 个细胞和10μgpEGFP-mSmo（将DNA储备浓度调节到Tris-EDTA缓冲液或无菌dH _2O中的〜2-5μg/ μL）。
      注意:如果电池不足，请减少电池总数量（尽管这可能会降低电穿孔效率）。但是，不要调整质粒的量，也不要调整每个比色皿使用的Opti-MEM的总体积。如果实验所需的总细胞数超过1.5×¹⁰⁶个细胞，请相应地放大电穿孔混合物并分别进行多次电穿孔反应。比色皿最多可重复使用 5 次。
   2. 通过将0.5mL培养基加入含有包衣盖玻片的24孔培养板的每个孔中（从步骤1.2开始）中，将其在_CO2 培养箱中保持在37°C下，来制备电穿孔后细胞接种板。
   3. 从步骤2.1.20开始，将所需数量的细胞移液到无菌的1.5mL微量离心管中，并在室温下以200× g旋转5分钟。使用Opti-MEM重复此步骤两次，以确保管中不存在残留培养基
      注意:对于24孔板的每个孔/盖玻片，电穿孔和种子1.2-1.3×¹⁰⁶ 个细胞/孔，以便在培养的第二天获得〜70-75%的细胞汇合度。
   4. 设置电穿孔参数， 如表1所示。
   5. 轻轻移取电穿孔反应以充分混合，并使用长P200吸头将精确体积的100μL混合物转移到2mm间隙比色皿中。避免形成气泡。
   6. 将比色皿放入比色皿室。
   7. 按下电致变器的Ω按钮（见 材料表），记下阻抗值，应~30-35。为确保Ω电阻抗值在30-35范围内，请坚持100μL的精确体积。
   8. 按下 开始 按钮以启动脉冲。
   9. 记录读数框上显示的测量电流和焦耳值。
   10. 从比色皿室中取出比色皿。
   11. 立即将100μL预热培养基加入比色皿中，并通过轻轻上下移液2-3次将其重悬。立即将细胞悬浮液转移到步骤2.2.2中制备的24孔板中。
       注意:为了尽量减少细胞死亡，请在电穿孔后立即接种细胞。
   12. 将细胞在37°C下孵育在_CO2 培养箱中。使细胞不受干扰3小时以避免细胞脱离。
   13. 在接种后3小时，轻轻吸出并丢弃一半的上清液培养基，以除去漂浮的死细胞和碎屑，并用相同量的预热培养基替换。
   14. 将细胞在37°C下孵育在_CO2 培养箱中，并每隔一天补充一半的培养基。
   15. 第二天在荧光显微镜下观察细胞，即DIV1（图1）的GFP信号，以确定Smo过表达的效率。
   16. 为了在补充一半培养基后刺激DIV 1上的Hh信号通路，向细胞中加入0.2μM平滑激动剂（SAG），同时向对照组添加等体积的DMSO。在细胞固定前孵育24小时。
       注意:将添加的 DMSO/SAG 的音量保持在尽可能低的水平。在这里，每孔500μL培养基加入0.5μLDMSO或0.5μL0.2mM SAG，稀释比为1:1，000。

3. DIV 2:原发性纤毛的可视化和Hh信号通路的研究

1. 细胞固定
   1. 在处理后24小时，取出培养基并使用一次性巴斯德移液管用磷酸盐缓冲盐水（PBS）冲洗细胞2-3次，同时避免细胞移位。
   2. 通过加入〜400μL的4%多聚甲醛（在PBS中制备）固定细胞，并在室温下孵育10分钟。
   3. 使用一次性巴斯德移液器用PBS冲洗并清洗2-3次。
   4. 在4°C的PBS中储存长达2个月或进行免疫染色。
2. GCP 和原发性纤毛标志物的免疫细胞化学染色
   1. 在24孔板中，在PBS中洗涤细胞两次，每次轻轻摇动5分钟。
   2. 向细胞中加入0.5mL的100mM氯化铵，并在室温下孵育10分钟以淬灭固定剂。
   3. 冲洗一次，用PBS清洗2-3次，每次轻轻摇晃10分钟。
   4. 将30μL封闭缓冲液（BB:0.1%Triton X-100，1%BSA，2%热灭活马血清PBS）轻轻移液到一块副膜上，形成无气泡的液滴。
   5. 轻轻地将盖玻片从孔转移到BB液滴上，细胞接种的一面朝下。将具有BB的细胞在潮湿的室中孵育1小时。
   6. 在BB中制备一抗混合物，如 材料表所示。要用一抗探针探细胞，重复步骤3.2.4和3.2.5，用一抗混合物代替BB。用一抗在室温下孵育细胞2小时。
   7. 使用镊子将盖玻片移回24孔板，细胞接种侧朝上。冲洗细胞一次，在PBS中洗涤3-4次，每次轻轻摇动10分钟。
   8. 在BB中制备二抗混合物，如 材料表所示。要用二抗孵育细胞，重复步骤3.2.4和3.2.5，用二抗混合物代替BB。在室温下在黑暗中孵育1小时。
   9. 重复步骤3.2.7进行二次抗体孵育洗涤。
   10. 使用安装介质将盖玻片安装在干净的微观载玻片上。
   11. 在黑暗中风干载玻片过夜，然后进行共聚焦成像¹³。

结果

使用Opti-MEM（见 材料表）作为通用试剂，这种提出的电穿孔方法可以实现〜80-90%的持续高电穿孔效率（图1）。在电穿孔后DIV 2处，通过定量所有配对的盒状蛋白-6（Pax6）表达GCP细胞中绿色荧光阳性细胞的百分比来确定Smo-EGFP载体的电穿孔效率。DMSO和SAG处理基团的电穿孔效率似乎相当（图1 和 表2）。

此外，...

讨论

通过电穿孔法转染原代GCP培养物中的转染基因通常与细胞活力低和转染效率差有关^9，10。本文介绍了一种具有成本效益且可重复的电穿孔方案，该协议已被证明具有高效率和可行性。此外，我们还展示了一种研究原代GCP细胞中原代纤毛依赖性Hh信号通路的简单方法。

其他常见的电穿孔方法通常需要昂贵的细胞类型特异性电穿孔试剂?...

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
GCP Culture
B27 supplement	Life Technologies LTD	17504044
Cell strainer, 70 µm	Corning	352350
DNase I from bovine pancreas	Roche	11284932001
Earle’s Balanced Salt Solution	Gibco, Life Technologies	14155063
FBS, qualified	Thermo Scientific	SH30028.02
GlutamMAXTM-I ,100x	Gibco, Life Technologies	35050061	L-glutamine substitute
L-cysteine	Sigma Aldrich	C7352
Matrigel	BD Biosciences	354277	Basement membrane matrix
Neurobasal	Gibco, Life Technologies	21103049
Papain,suspension	Worthington Biochemical Corporation	LS003126
Poly-D-lysine Hydrobromide	Sigma Aldrich	P6407
SAG	Cayman Chemical	11914-1	Smoothened agonist
IF staining
Bovine Serum Albumin	Sigma Aldrich	A7906
Paraformaldehyde	Sigma Aldrich	P6148
Triton X-100	Sigma Aldrich	X100
Primary antibody mix
Anti-GFP-goat ab	Rockland	600-101-215	Dilution Factor: 1 : 1000
Anti-Arl13b mouse monoclonal ab	NeuroMab	75-287	Dilution Factor: 1 : 1000
Anti-Pax6 rabbit polyclonal ab	Covance	PRB-278P	Dilution Factor: 1 : 1000
Secondary antibody mix
Alexa Fluor 488 donkey anti-goat IgG	Invitrogen	A-11055	Dilution Factor: 1 : 1000
Alexa Fluor 555 donkey anti-mouse IgG	Invitrogen	A-31570	Dilution Factor: 1 : 1000
Alexa Fluor 647 donkey anti-rabbit IgG	Invitrogen	A-31573	Dilution Factor: 1 : 1000
DAPI	Thermo Scientific	62247	Dilution Factor: 1 : 1000
Electroporation
CU 500 cuvette chamber	Nepagene	CU500
EPA Electroporation cuvette (2 mm gap)	Nepagene	EC-002
Opti-MEM	Life Technologies LTD	31985070	reduced-serum medium for transfection
pEGFP-mSmo	Addgene	25395
Super Electroporator NEPA21 TYPE II In Vitro and In Vivo Electroporation	Nepagene	NEPA21	electroporator