JoVE Logo
Yazarlar
Bize Ulaşın

Oturum Aç

Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliği gereklidir. Oturum açın veya ücretsiz deneme sürümünü başlatın.

Bu Makalede

  • Özet
  • Özet
  • Giriş
  • Protokol
  • Sonuçlar
  • Tartışmalar
  • Açıklamalar
  • Teşekkürler
  • Malzemeler
  • Referanslar
  • Yeniden Basımlar ve İzinler

Özet

Burada, primer serebellar granül hücre öncüllerinin (GCP' ler) genetik manipülasyonu için uygun maliyetli, verimli ve uygulanabilir bir tekrarlanabilir in vitro elektroporasyon protokolü sunuyoruz. Ayrıca, bu protokol ayrıca birincil GCP hücrelerindeki birincil ekyuma bağımlı Kirpi sinyal yollarının moleküler çalışması için basit bir yöntem göstermektedir.

Özet

Birincil sicim, hücre yüzeyinden sarkıt sinyali veren Kirpi (Hh) ileten hemen hemen her hücrede bulunan kritik bir sinyal organıdır. Granül hücre öncüsünde (GCP), birincil sicim, Hh sinyal yolunu modüle ederek öncü hücre çoğalmasını düzenleyen önemli bir sinyal merkezi görevi görür. Birincil sicime bağımlı Hh sinyal makinelerinin araştırılması, birincil sicime dinamik lokalizasyonlarını görselleştirmek için yol bileşenlerinin in vitro genetik manipülasyonu ile kolaylaştırılmıştır. Bununla birlikte, GCP'lerin birincil kültürlerinde transgenlerin şu anda bilinen elektroporasyon yöntemlerini kullanarak transeksiyonu genellikle maliyetlidir ve genellikle düşük hücre canlılığı ve istenmeyen transeksiyon verimliliği ile sonuçlanır. Bu makale, ~%80-90 arasında yüksek transfeksiyon verimliliği ve optimum hücre canlılığı gösteren verimli, uygun maliyetli ve basit bir elektroporasyon protokolü sürmektedir. Bu, birincil GCP kültürlerinde birincil ekyuma bağımlı Kirpi sinyal yolunun incelenmesi için geçerli olan basit, tekrarlanabilir ve verimli bir genetik modifikasyon yöntemidir.

Giriş

Serebellar GCP'ler, yüksek bollukları ve vivo1,2,3,4'teki Hh sinyal yoluna karşı yüksek hassasiyetleri nedeniyle nöronal progenitör hücre tiplerinde Hh sinyal yolunun makinelerini incelemek için yaygın olarak kullanılmaktadır. GCP'lerde, birincil eksiyum öncü hücrelerin çoğalmasını düzenleyen önemli bir Hh sinyal transdüksiyon merkezi5 görevi görür6,7,8. Birincil sicim üzerindeki Hh sinyal bileşenlerinin in vitro görselleştirmesi, düşük endojen bazal seviyeleri nedeniyle genellikle zordur. Bu nedenle, protein ekspresyon seviyelerinin transgene modifikasyonu ve ilgi geninin florofor etiketlemesi moleküler çözünürlükte yolu incelemek için yararlı yaklaşımlardır. Bununla birlikte, lipozom bazlı transfeksiyon yaklaşımları kullanılarak GCP birincil kültürlerinin genetik manipülasyonu genellikle düşük transeksiyon verimliliği ile sonuçlanır ve daha fazla moleküler araştırmayı engeller9. Elektroporasyon verimliliği artırır, ancak genellikle fahiş satıcıya özgü ve hücre tipi kısıtlı elektroporasyon reaktifleri gerektirir10.

Bu makale, GCP birincil kültürlerindeki Hh sinyal yolu bileşenlerini manipüle etmek için yüksek verimli ve uygun maliyetli bir elektroporasyon yöntemi sönmektedir. Bu modifiye elektroporasyon protokolü kullanılarak, yeşil floresan protein (GFP) etiketli Yumuşatılmış transgene (pEGFP-Smo) GCP'lere verimli bir şekilde teslim edildi ve yüksek hücre sağkalım ve transfeksiyon oranlarına (%80-90) ulaşıldı. Ayrıca, immünosimyasal lekelemenin kanıt ettiği gibi, transfected GCP'ler, EGFP-Smo'yu birincil cilia'ya aktararak Hh sinyal yolunun yumuşatılmış agonist kaynaklı aktivasyonuna karşı yüksek hassasiyet göstermiştir. Bu protokol, insan ve kemirgen birincil hücre kültürleri ve insan kaynaklı pluripotent kök hücreler gibi transfect edilmesi zor hücre türlerinin in vitro genetik modifikasyonu içeren deneyler için doğrudan uygulanabilir ve faydalı olacaktır.

Protokol

Hayvanlarla ilgili tüm prosedürler, hayvan taşıma yönergelerine ve Hong Kong Sağlık Bakanlığı tarafından onaylanan protokole uygun olarak gerçekleştirildi. Hayvan (Deneylerin Kontrolü) Yönetmeliğini (Cap. 340) takip eden hayvan deney lisansları Hong Kong Hükümeti Sağlık Bakanlığı'ndan alınmıştır. Hayvan çalışmaları HKBÜ Araştırma Ofisi ve Laboratuvar Güvenliği Komitesi tarafından onaylanan hayvan güvenliği etiğine uygun olarak gerçekleştirilmiştir. Bu protokolde kullanılan tüm malzemeler hakkında ayrıntılı bilgi için Malzeme Tablosu'na bakın.

1. Deneyim öncesi hazırlık

  1. Kültür medyası ve tamponların hazırlanması
    1. Serumsuz ortam (SFM)
      1. 50 mL SFM hazırlamak için 500 μL 100x L-glutamin ikamesi, 500 μL Penisilin-Streptomisin, 1 mM sodyum piruvat ve 1 M KCl (son 250 μM) ila 49 mL Nörobasal ortam ekleyin.
      2. SFM'yi 50 mL konik tüplerde 10 mL ve 40 mL'lik 2 aliquot'a bölün ve bir aya kadar 4 °C'de saklayın.
    2. Sindirim engelleme ortamı: SFM'de %10 FBS
      1. Sindirim engelleme ortamını hazırlamak için 10 mL'lik SFM aliquot'una 1,1 mL ısı inaktive FBS ekleyin.
    3. GCP kültür ortamı: B27 ile SFM
      1. GCP kültür ortamını hazırlamak için, 40 mL'lik bir SFM aliquot'una 800 μL serumsuz B-27 takviyesi ekleyin.
        NOT: B-27 takviyeli SFM, 4 °C'de bir aya kadar saklanabilir. Bununla birlikte, yeni hazırlanmış medya en uygun sonuçları üretir.
    4. Diseksiyon tamponu: Glikoz + HEPES ile EBSS
      1. 10 mM HEPES (4-(2-hidroksetil)-1-piperazineethanesulfonic asit) içeren kalsiyum ve magnezyum içermeyen Earle's Balanced Salt Solution'a (EBSS) 6 g/L glikoz ekleyin.
      2. Çözeltiyi 0,2 μm şırınd süzgecinden geçirerek sterilize edin ve uzun süreli depolama için 4 °C'de saklayın.
    5. Sindirim Arabelleği
      NOT: Kullanmadan önce yeni bir şekilde hazırlayın.
      1. 2-4 serebellar dokunun sindirimi için 2 mL, 4-10 doku için 4 mL sindirim tamponu hazırlayın. 4 mL sindirim tamponu hazırlamak için, 4 mL EBSS'de 1,5 mg L-sistein (son konsantrasyon 200-400 μg / mL) çözün. Toz tamamen çözünene kadar tüpü tekrar tekrar ters çevirin.
      2. Çözeltiyi 0,2 μm şırınna filtresi ve 5 mL şırınna kullanarak sterilize edin ve çözeltiyi steril 35 mm hücre kültürü çanağına aktarın.
      3. 4 μL papain (20 birim/mg stok konsantrasyonundan 1:1.000 seyreltme) ve 40 μL DNase I (0.1 mg/mL'lik son konsantrasyon için 10 mg/mL'lik bir stoktan 1:100 seyreltme) ekleyin.
      4. Çözeltiyi 37 °C'de bir CO2 inkübatörde en az 30 dakika veya kullanıma kadar kuluçkaya yatırın.
        NOT: Bu adım papaini etkinleştirmek için kritik öneme sahiptir. Optimum sonuçlar için, kullanmadan önce 37 °C'de 45 dakikayı aşmayın. Çözeltinin şeffaf hale döndüğünden ve kullanımdan önce beyaz çökeltmeden önce beyaz çökeltmeden emin olun.
  2. Kapak örtülerini önceden kaplama
    1. Kapakları hücre bağlanmasına hazırlamak için, 100 μg/mL poli-D-lizin (PDL, steril dH2O'da 1 mg/mL) ile 12 mm'lik otomatik kapatılmış cam kapakları 37 °C'de en az 1 saat kuluçkaya yaslanın. Kapakları kullanıma kadar aynı PDL çözeltisinde 4 °C'de tutun.
    2. Birincil hücre kültürü gününde, PDL'yi temiz bir konik tüpte toplayın ve artık PDL'yi çıkarmak için kapakları steril dH2O ile üç kez iyice durulayın.
      NOT: PDL yeniden kullanılmak üzere 4 °C'de saklanabilir.
    3. PDL kaplı cam kapak kapaklarını her kuyuya bir kapak kılıfı yerleştirerek 24 kuyulu bir tabağa aktarın.
    4. Fazla suyu çıkarın ve kapakları tamamen kapatmak için 200-300 μL Matrigel ekleyin (serumsuz DMEM-F12'deki ürün veri çizelgesindeki talimatlara göre yeniden inşa edilmiştir).
    5. Matrigel'deki kapakları CO2 inkübatöründe 37 °C'de 1 saat kuluçkaya yatırın.
      NOT: Hücre tohumlamadan önce Matrigel'i çıkarın. Bu Matrigel, birden fazla yeniden kullanım için 4 °C'de toplanabilir ve saklanabilir.
  3. Ön plaka kültür yemeğinin hazırlanması
    1. 60 mm hücre kültürü çanağına 2 mL 100 μg/mL PDL (steril dH2O'da 1 mg/mL PDL stok çözeltisini yeniden inşa edin) 1 saat boyunca 37 °C'de inkübasyon yaparak kaplayın.
    2. Hücre tohumlamadan hemen önce, kullanılmış PDL'yi temiz bir konik tüpte çıkarın ve toplayın ve birden fazla yeniden kullanım için 4 °C'de saklayın. PDL kaplı kabı steril dH2O ile üç kez durulayın ve yıkayın.
    3. En fazla 2 tam beyincik dokusundan elde edilen tohum hücreleri için bir adet 60 mm hücre kültürü çanağı kullanın.
    4. Ek beyincikler için ek kültür yemekleri hazırlayın.
      NOT: Ön plaka kültür yemeğinin kullanımı için 2.1.18 ve 2.1.19 adımlarına bakın.

2. Deneysel gün 0

  1. Fare birincil GCP'lerinin yalıtıcılığı ve kültasyonu
    NOT: GCP kültür yöntemi standart bir protokolden değiştirilmiştir ve kısa protokol önceki çalışmamızda kısaca açıklanmıştır.6,11,12. Optimum GCP verimi için, GCP izolasyonu için doğum sonrası (P) gün 6 veya P7 yavrularını kullanın. En iyi hücre canlılığı için aşağıdaki diseksiyon adımları 2.1.6-2.1.10'u mümkün olan en kısa sürede tamamlayın.
    1. Diseksiyon sırasında 37 °C'de prewarm SFM, sindirim engelleme ortamı, kültür ortamı ve Opti-MEM.
    2. Temiz bir bankta, dezenfeksiyon için tüm diseksiyon aparatlarını% 70 etanolde önsoak.
    3. 60 mm hücre kültürü çanağını 2-3 mL diseksiyon tamponu ile doldurun ve buz üzerinde soğutun.
    4. Bölüm 1.1.5'te açıklandığı gibi taze sindirim tamponu hazırlayın ve 37 °C'de sıcak tutun.
    5. Dezenfeksiyon için yavrunun başını silmek için% 70 etanol kullanın.
    6. Anestezi olmadan yavrunun kafasını koparın. Başı tutmak için önps kullanın ve yavrunun kafasını kesmek için kafatasının arkasından kesmek için sterilize edilmiş cerrahi makas kullanın. Beyneps kullanarak beyni ortaya çıkarmak için cildi ve kafatasını dikkatlice çıkarın.
    7. Beyinciği kıstırmak için ön ayak kullanın ve 2.1.3 adımında hazırlanan önceden soğutulmuş diseksiyon tamponunda hızla ıslatın.
    8. Diseksiyon tamponunda bir diseksiyon mikroskobu altında batırılmış beyincik ile menenjitleri çıkarın. Kan damarı ile zenginleştirilmiş menenjitler, diseksiyon mikroskobu altında pembemsi görünmelidir.
    9. Tüm menenjitleri teksir kullanarak çıkarın.
      NOT: Menenjitsiz bir beyincik beyazımsı bir görünüme sahip olmalıdır.
    10. Görünür orta beyin dokularını ve koroid pleksusunu beyincikten çıkarın.
    11. Serebellumu, 2.1.4 adımında hazırlanan ılık sindirim tamponu ile önceden doldurulmuş 35 mm'lik bir kültür kabına aktarın. Fazla diseksiyon arabelleği aktarmaktan kaçının. Beyincikleri mümkün olduğunca çabuk mikrospring makası kullanarak ince parçalara ayırın.
    12. Kıyılmış beyincikleri 37 °C'de bir CO2 inkübatöründe 15 dakika boyunca hemen kuluçkaya yatırın. 4'ten fazla beyincik işlenecekse kuluçka süresini 20 dakikaya uzatın.
      NOT: Kuluçkadan sonra doku bir araya gelecektir.
    13. Sindirilen dokuyu hemen sindirim engelleme ortamına sahip bir P1000 pipet ucu kullanarak yeni bir steril 15 mL santrifüj tüpünün dibine aktarın (sindirim tamponunun aktarılmasından kaçının).
    14. Sindirimi sonlandırmak için uygun miktarda sindirim engelleme ortamı (1 beyincik için 1 mL) ekleyin ve dokuyu tek hücreli bir süspansiyona daha fazla ayrıştırmak için bir P1000 mikropipette kullanarak 30 kez yavaşça yukarı ve aşağı pipet ekleyin. Hava kabarcığı oluşumundan kaçının.
    15. Hücre kümelerini çıkarmak için hücre süspansiyonunu 70 μm hücre süzgeçten yeni bir steril santrifüj tüpüne hafifçe geçirin.
    16. Hücre süzgecinden kalan hücreleri toplamak için hücre süzgecinden ilave 1 mL taze sindirim engelleme ortamı geçirin.
    17. Filtratı oda sıcaklığında (RT) 5 dakika boyunca 200 × g'da santrifüjlayın. Üstnatantı çıkarın ve peletin 1 mL SFM ile yeniden süzülür. Bu adımı iki kez yineleyin. Hava kabarcıkları oluşturmaktan kaçının.
    18. Peleti 2 mL GCP kültür ortamının son hacminde yeniden atın ve hücre süspansiyonunu 1.3 adımda hazırlanan PDL kaplı 60 mm ön plaka kültür çanağına aktarın. Co2 inkübatörde 37 °C'de 15 dakika kuluçkaya yatır.
      NOT: 20 dakikayı aşmayın.
    19. Kuluçkadan sonra, gevşek yapışan GCP hücrelerini yerinden çıkarmak için kültür kabına yandan dokunun. Bir P1000 pipet kullanarak hafif pipetleme yaparak, yapışan GCP hücrelerini kültür ortamında toplayın. Bu GCP süspansiyonu yeni bir 15 mL santrifüj tüpüne toplayın. 60 mm'lik tabağı atın.
      NOT: Güçlü yapışan astroglia ve fibroblast hücreleri 60 mm'lik çanak tabanına bağlı kalacak ve bu adımda ayrılacaktır. Bu adımın atılması GCP kültürünün saflığını tehlikeye atacaktır.
    20. Hücreleri sayın ve hemen elektroporasyona geçin.
  2. Gün in vitro (DIV) 0: Hh reseptör transgene overexpression için elektroporasyon: pEGFP-Smo
    1. 2 mm boşluklu cuvette kullanarak elektroporasyon için, elektroporasyonun her reaksiyonu için aşağıdaki plazmid hücreli elektroporasyon karışımını hazırlayın: 100 μL'de 1.2 × 106 hücre ve 10 μg pEGFP-mSmo (DNA stok konsantrasyonunu Tris-EDTA tamponunda veya steril dH2O'da ~2-5 μg/ μL'ye ayarlayın) Opti-MEM'in 100 μL'sinde.
      NOT: Hücreler yetersizse toplam hücre sayısını azaltın (ancak bu elektroporasyon verimliliğini azaltabilir). Ancak, cuvette başına kullanılan plazmid miktarını veya opti-MEM'in toplam hacmini ayarlamayın. Deney için gereken toplam hücre sayısı 1,5 × 106 hücreyi aşarsa, elektroporasyon karışımını buna göre ölçeklendirin ve birden fazla elektroporasyon reaksiyonunu ayrı ayrı gerçekleştirin. Cuvette 5 kata kadar yeniden kullanılabilir.
    2. Kaplamalı kapaklar içeren 24 kuyulu kültür plakasının her kuyusuna 0,5 mL kültür ortamı ekleyerek (adım 1,2'den itibaren) elektroporasyon sonrası hücre tohumlama plakasını hazırlayın ve bir CO2 inkübatörde 37 °C'de sıcak tutun.
    3. Adım 2.1.20'den itibaren, gerekli sayıda hücreyi steril 1,5 mL mikrosantrifüj tüpüne pipetle atın ve RT'de 5 dakika boyunca 200 × g'da döndürün. Tüpte artık kültür ortamı olmadığından emin olmak için bu adımı Opti-MEM ile iki kez tekrarlayın
      NOT: 24 kuyulu bir plakanın her kuyusu/kapağı için, kültürün ertesi gününde ~%70-75 hücre izdiahını elde etmek için elektroporat ve tohum 1.2-1.3 × 106 hücre/kuyu.
    4. Tablo 1'de gösterildiği gibi elektroporasyon parametrelerini ayarlayın.
    5. Elektroporasyon reaksiyonunu nazikçe karıştırarak iyice karıştırın ve karışımın 100 μL'lik tam hacmini 2 mm boşluk cuvette'e aktarmak için uzun bir P200 ucu kullanın. Kabarcıklar oluşturmaktan kaçının.
    6. Cuvette'i cuvette odasına yerleştirin.
    7. Elektroporatör Ω düğmesine basın ( Malzeme Tablosuna bakın) ve ~30-35 olması gereken empedans değerini not edin. Elektrik empedans değerinin Ω 30-35 aralığına düşmesini sağlamak için 100 μL'lik hassas bir hacme uyun.
    8. Nabzı başlatmak için başlat düğmesine basın.
    9. Okuma çerçevesinde gösterilen ölçülen akım ve joules değerlerini kaydedin.
    10. Cuvette'i cuvette odasından çıkarın.
    11. Hemen cuvette içine 100 μL önceden ısıtılmış kültür ortamı ekleyin ve 2-3 kez yukarı ve aşağı hafif pipetleme ile yeniden dürtmek. Hücre süspansiyonu derhal adım 2.2.2'de hazırlanan 24 kuyu plakasına aktarın.
      NOT: Hücre ölümünü en aza indirmek için, elektroporasyondan hemen sonra hücreleri tohumlayın.
    12. Hücreleri 37 °C'de bir CO2 inkübatöründe kuluçkaya yatırın. Hücre ayrılmasını önlemek için hücreleri 3 saat boyunca bozulmadan bırakın.
    13. 3 saat sonra tohumlama, hafifçe aspire ve yüzen ölü hücreleri ve enkaz kaldırmak ve aynı miktarda önceden ısıtılmış kültür ortamı ile değiştirmek için süpernatant ortamın yarısını atın.
    14. Hücreleri CO2 inkübatöründe 37 °C'de kuluçkaya yatırın ve her gün ortamın yarısını yeniler.
    15. Ertesi gün floresan mikroskobu altındaki hücreleri gözlemleyin, yani Smo aşırı ifadenin verimliliğini belirlemek için GFP sinyali için DIV1 (Şekil 1).
    16. Ortamın yarısını yeniledikten sonra DIV 1'deki Hh sinyal yolunun uyarılması için, kontrole eşit miktarda DMSO eklerken hücrelere 0,2 μM Yumuşatılmış agonist (SAG) ekleyin. Hücre fiksasyonu öncesinde 24 saat kuluçkaya yatırın.
      NOT: DMSO/SAG'nin ses düzeyini mümkün olduğunca düşük tutun. Burada kuyu başına 500 μL orta başına 0,5 μL DMSO veya 0,5 μL SAG eklendi, bu da 1:1.000 seyreltme oranıdır.

3. DIV 2: Birincil cilia'nın görselleştirilmesi ve Hh sinyal yolunun araştırılması

  1. Hücre fiksasyonu
    1. Tedavi sonrası 24 saat sonra, kültür ortamını çıkarın ve hücreleri yerinden çıkarmaktan kaçınırken tek kullanımlık bir Pasteur pipet kullanarak fosfat tamponlu salin (PBS) ile hücreleri 2-3 kez durulayın.
    2. %4 paraformaldehitin ~400 μL'sini ekleyerek hücreleri sabitle (PBS'de hazırlanır) ve RT'de 10 dakika kuluçkaya yaslanın.
    3. Tek kullanımlık pastör pipet kullanarak PBS ile 2-3 kez durulayın ve yıkayın.
    4. PBS'de 4 °C'de 2 aya kadar saklayın veya immün yetmeye devam edin.
  2. GCP'lerin ve primer sicim belirtecinin immünostokimyasal boyanma
    1. 24 kuyulu bir tabakta, pbs'de hücreleri her seferinde 5 dakika hafifçe sallayarak iki kez yıkayın.
    2. Hücreye 0,5 mL 100 mM amonyum klorür ekleyin ve fiksatifi söndürmek için RT'de 10 dakika kuluçkaya yatırın.
    3. Bir kez durulayın ve PBS ile her seferinde 10 dakika hafifçe sallanarak 2-3 kez yıkayın.
    4. Hafifçe pipet 30 μL blokaj tamponu (BB: %0,1 Triton X-100, %1 BSA, PBS'de %2 ısı inaktive at serumu) hava kabarcıkları olmadan bir damlacık oluşturmak için bir parafilm parçasına.
    5. Kapak kapağını kuyudan bb damlasına yavaşça aktarın ve hücre tohumlu taraf aşağı bakacak şekilde aktarın. Rt'de 1 saat boyunca nemli bir odada BB ile hücreleri kuluçkaya yatırın.
    6. Birincil antikor karışımını Malzeme Tablosunda gösterildiği gibi BB'de hazırlayın. Birincil antikor içeren hücreleri araştırmak için, BB'yi birincil antikor karışımıyla değiştirerek 3.2.4 ve 3.2.5 adımlarını tekrarlayın. RT'de 2 saat boyunca birincil antikor ile hücreleri kuluçkaya yatırın.
    7. Tokmakları kullanarak, kapakları hücre tohumlu tarafı yukarı bakacak şekilde 24 kuyu plakasına geri aktarın. Hücreleri bir kez durulayın ve PBS'de her seferinde 10 dakika hafif sallanarak 3-4 kez yıkayın.
    8. malzeme tablosunda gösterildiği gibi ikincil antikor karışımını BB'de hazırlayın. Hücreleri ikincil antikorla kuluçkaya yatırmak için, BB'yi ikincil antikor karışımıyla değiştirerek 3.2.4 ve 3.2.5 adımlarını tekrarlayın. RT'de 1 saat karanlıkta kuluçkaya yaslanın.
    9. İkincil antikor inkübasyon yıkama için 3.2.7 adımını tekrarlayın.
    10. Kapak kapağını montaj ortamını kullanarak temiz bir mikroskobik cam kaydırağa monte edin.
    11. Slaytı bir gecede karanlıkta havayla kurulayın ve konfokal görüntülemeye geçin13.

Sonuçlar

Opti-MEM'i ( Bkz. Malzeme Tablosu) evrensel reaktif olarak kullanarak, önerilen bu elektroporasyon metodolojisi ~%80-90 oranında sürekli olarak yüksek elektroporasyon verimliliği elde edebilir (Şekil 1). Smo-EGFP vektörün elektroporasyon verimliliği, tüm eşleştirilmiş kutu protein-6 (Pax6) ifade eden GCP hücrelerindeki yeşil floresan pozitif hücrelerin yüzdesinin ölçülmesiyle DIV 2 post electroporation'da belirlendi. DMSO ve SAG ile işlenmiş grupların ...

Tartışmalar

Birincil GCP kültüründeki transjenlerin elektroporasyon yöntemi ile transeksiyonu tipik olarak düşük hücre canlılığı ve zayıf transeksiyon verimliliği9,10 ile ilişkilidir. Bu makale, yüksek verimlilik ve canlılık gösteren uygun maliyetli ve tekrarlanabilir bir elektroporasyon protokolü salamıştır. Ek olarak, birincil GCP hücrelerinde birincil sicime bağımlı Hh sinyal yolunu incelemek için basit bir yöntem de gösteriyoruz.

Açıklamalar

Yazarların beyan edecekleri bir çıkar çatışması yoktur.

Teşekkürler

Bu çalışma HKBU Tohum Fonu ve Tier-2 Start-up Grant (RG-SGT2/18-19/SCI/009), Research Grant Council-Collaborative Research Fund (CRF-C2103-20GF) tarafından C.H.H. Hor'a desteklendi.

Malzemeler

NameCompanyCatalog NumberComments
GCP Culture
B27 supplementLife Technologies LTD17504044
Cell strainer, 70 µmCorning352350
DNase I from bovine pancreasRoche11284932001
Earle’s Balanced Salt SolutionGibco, Life Technologies14155063
FBS, qualifiedThermo ScientificSH30028.02
GlutamMAXTM-I ,100xGibco, Life Technologies35050061L-glutamine substitute
L-cysteineSigma AldrichC7352
MatrigelBD Biosciences354277Basement membrane matrix
NeurobasalGibco, Life Technologies21103049
Papain,suspensionWorthington Biochemical CorporationLS003126
Poly-D-lysine HydrobromideSigma AldrichP6407
SAGCayman Chemical11914-1Smoothened agonist
IF staining
Bovine Serum AlbuminSigma AldrichA7906
ParaformaldehydeSigma AldrichP6148
Triton X-100Sigma AldrichX100
Primary antibody mix
Anti-GFP-goat abRockland600-101-215Dilution Factor: 1 : 1000
Anti-Arl13b mouse monoclonal abNeuroMab75-287Dilution Factor: 1 : 1000
Anti-Pax6 rabbit polyclonal abCovancePRB-278PDilution Factor: 1 : 1000
Secondary antibody mix
Alexa Fluor 488 donkey anti-goat IgGInvitrogenA-11055Dilution Factor: 1 : 1000
Alexa Fluor 555 donkey anti-mouse IgGInvitrogenA-31570Dilution Factor: 1 : 1000
Alexa Fluor 647 donkey anti-rabbit IgGInvitrogenA-31573Dilution Factor: 1 : 1000
DAPIThermo Scientific62247Dilution Factor: 1 : 1000
Electroporation
CU 500 cuvette chamberNepageneCU500
EPA Electroporation cuvette (2 mm gap)NepageneEC-002
Opti-MEMLife Technologies LTD31985070reduced-serum medium for transfection
pEGFP-mSmoAddgene25395
Super Electroporator NEPA21 TYPE II In Vitro and In Vivo ElectroporationNepageneNEPA21electroporator

Referanslar

  1. Chang, C. H., et al. Atoh1 controls primary cilia formation to allow for SHH-triggered granule neuron progenitor proliferation. Developmental Cell. 48 (2), 184-199 (2019).
  2. Dahmane, N., Ruizi Altaba, A. Sonic Hedgehog regulates the growth and patterning of the cerebellum. Development. 126 (14), 3089-3100 (1999).
  3. Lewis, P. M., Gritti-Linde, A., Smeyne, R., Kottmann, A., Mcmahon, A. P. Sonic Hedgehog signaling is required for expansion of granule neuron precursors and patterning of the mouse cerebellum. Developmental Biology. 270 (2), 393-410 (2004).
  4. Wechsler-Reya, R. J., Scott, M. P. Control of neuronal precursor proliferation in the cerebellum by Sonic Hedgehog. Neuron. 22 (1), 103-114 (1999).
  5. Bangs, F., Anderson, K. V. Primary cilia and mammalian Hedgehog signaling. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 9 (5), 028175 (2017).
  6. Hor, C. H. H., Lo, J. C. W., Cham, A. L. S., Leung, W. Y., Goh, E. L. K. Multifaceted functions of Rab23 on primary cilium- and Hedgehog signaling-mediated cerebellar granule cell proliferation. Journal of Neuroscience. 41 (32), 6850-6863 (2021).
  7. Han, Y. G., et al. Dual and opposing roles of primary cilia in medulloblastoma development. Nature Medicine. 15 (9), 1062-1065 (2009).
  8. Spassky, N., et al. Primary cilia are required for cerebellar development and Shh-dependent expansion of progenitor pool. Developmental Biology. 317 (1), 246-259 (2008).
  9. Wang, T., Larcher, L., Ma, L., Veedu, R. N. Systematic screening of commonly used commercial transfection reagents towards efficient transfection of single-stranded oligonucleotides. Molecules. 23 (10), 2564 (2018).
  10. Chicaybam, L., et al. An efficient electroporation protocol for the genetic modification of mammalian cells. Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 4, 99 (2017).
  11. Lee, H. Y., Greene, L. A., Mason, C. A., Chiara Manzini, M. Isolation and culture of post-natal mouse cerebellar granule neuron progenitor cells and neurons. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (23), e990 (2009).
  12. Mizoguchi, T., et al. Impaired cerebellar development in mice overexpressing VGF. Neurochemical Research. 44 (2), 374-387 (2019).
  13. Zhou, Y. Confocal imaging of nerve cells. Current Laboratory Methods in Neuroscience Research. , 235-247 (2014).
  14. Corbit, K. C., et al. Vertebrate Smoothened functions at the primary cilium. Nature. 437 (7061), 1018-1021 (2005).

Yeniden Basımlar ve İzinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya resimlerini yeniden kullanma izni talebi

Izin talebi

Daha Fazla Makale Keşfet

N robilimSay 177Primer ciliaserebellar gran l nc lin vitro elektroporasyonKirpi sinyal yolubirincil GCP k lt rYumu at lm

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Gizlilik

Kullanım Şartları

İlkeler

Bize Ulaşın

KÜTÜPHANEYE TAVSİYE ET

JoVE HABER BÜLTENLERİ

Araştırma

Eğitim

Yazarlar

Kütüphaneciler

JoVE Hakkında

Telif Hakkı © 2020 MyJove Corporation. Tüm hakları saklıdır