Эффективный и экономичный метод электропорации для изучения первичных реснично-зависимых сигнальных путей в предшественнике гранулярной клетки

Резюме

Здесь мы представляем воспроизводимый протокол электропорации in vitro для генетических манипуляций с первичными предшественниками клеток гранул мозжечка (GCP), который является экономически эффективным, эффективным и жизнеспособным. Кроме того, этот протокол также демонстрирует простой метод молекулярного исследования первичных реснечно-зависимых сигнальных путей Hedgehog в первичных клетках GCP.

Аннотация

Первичная ресничка является критической сигнальной органеллой, обнаруженной почти на каждой клетке, которая преобразует сигнальные стимулы Hedgehog (Hh) с поверхности клетки. В предшественнике гранулярной клетки (GCP) первичная ресничка действует как ключевой сигнальный центр, который организует пролиферацию клеток-предшественников, модулируя сигнальный путь Hh. Исследование первичного ресничково-зависимого сигнального механизма Hh облегчается генетическими манипуляциями in vitro с компонентами пути для визуализации их динамической локализации в первичной ресничке. Однако трансфекция трансгенов в первичных культурах ГКП с использованием известных в настоящее время методов электропорации, как правило, является дорогостоящей и часто приводит к низкой жизнеспособности клеток и нежелательной эффективности трансфекции. В этой статье представлен эффективный, экономичный и простой протокол электропорации, который демонстрирует высокую эффективность трансфекции ~ 80-90% и оптимальную жизнеспособность ячейки. Это простой, воспроизводимый и эффективный метод генетической модификации, который применим к изучению первичного ресничковозависимого сигнального пути ежа в первичных культурах GCP.

Введение

Мозжечковые GCP широко используются для изучения механизма сигнального пути Hh в нейронных типах клеток-предшественников из-за их высокой распространенности и высокой чувствительности к сигнальному пути Hh in vivo1,2,3,4. В GCP первичная ресничка действует как ключевой сигнальный узел трансдукции ^Hh5, который управляет пролиферацией клеток-предшественников6,7,8. Визуализация in vitro сигнальных компонентов Hh на первичной ресничке часто является сложной задачей из-за их низких эндогенных базальных уровней. Следовательно, трансгенная модификация уровней экспрессии белка и флуорофорная маркировка интересующего гена являются полезными подходами к изучению пути с молекулярным разрешением. Однако генетическое манипулирование первичными культурами GCP с использованием подходов к трансфекции на основе липосом часто приводит к низкой эффективности трансфекции, препятствуя дальнейшим молекулярным ^{исследованиям9}. Электропорация повышает эффективность, но обычно требует непомерных электропорационных реагентов, специфичных для конкретного производителя и ограниченных по типу ^{ячейки10}.

В данной работе представлен высокоэффективный и экономически эффективный метод электропорации для манипулирования компонентами сигнального пути Hh в первичных культурах GCP. Используя этот модифицированный протокол электропорации, зеленый флуоресцентный белок (GFP), помеченный сглаженным трансгеном (pEGFP-Smo), был эффективно доставлен в GCP и достиг высокой выживаемости клеток и скорости трансфекции (80-90%). Кроме того, как свидетельствует иммуноцитохимическое окрашивание, трансфектированные GCP показали высокую чувствительность к сглаженной агонист-индуцированной активации сигнального пути Hh путем транспортировки EGFP-Smo в первичные реснички. Этот протокол должен быть непосредственно применим и полезен для экспериментов, которые включают генетическую модификацию in vitro типов клеток, которые трудно трансфектировать, таких как культуры первичных клеток человека и грызунов, а также индуцированные человеком плюрипотентные стволовые клетки.

протокол

Все процедуры, связанные с животными, были выполнены в соответствии с руководящими принципами обращения с животными и протоколом, утвержденным Департаментом здравоохранения Гонконга. Лицензии на эксперименты на животных в соответствии с Постановлением о контроле за экспериментами на животных (глава 340) были получены от Министерства здравоохранения правительства Гонконга. Работа с животными проводилась в соответствии с этикой безопасности животных, утвержденной Исследовательским офисом HKBU и Комитетом по безопасности лабораторий. Обратитесь к Таблице материалов для получения подробной информации обо всех материалах, используемых в этом протоколе.

1. Предэкспериментная подготовка

1. Подготовка питательных сред и буферов
   1. Среда без сыворотки (SFM)
      1. Для получения 50 мл SFM добавляют 500 мкл 100x L-заменителя глутамина, 500 мкл пенициллина-стрептомицина, 1 мМ пирувата натрия и 12,5 мкл 1 M KCl (конечные 250 мкМ) до 49 мл нейробазальной среды.
      2. Разделите SFM на 2 аликвоты по 10 мл и 40 мл в конических трубках по 50 мл и храните их при 4 °C в течение одного месяца.
   2. Среда, блокирующая пищеварение: 10% FBS в SFM
      1. Добавьте 1,1 мл термоинактивированного FBS к 10 мл аликвоты SFM для приготовления среды, блокирующей пищеварение.
   3. Культуральная среда GCP: SFM с B27
      1. Чтобы приготовить культуральную среду GCP, добавьте 800 мкл добавки B-27 без сыворотки к 40 мл аликвоты SFM.
         ПРИМЕЧАНИЕ: SFM, дополненный B-27, можно хранить при температуре 4 °C в течение одного месяца. Однако свежеприготовленные носители дают оптимальные результаты.
   4. Буфер рассечения: EBSS с глюкозой + HEPES
      1. Добавьте 6 г / л глюкозы в сбалансированный солевой раствор Эрла (EBSS), содержащий 10 мМ HEPES (4-(2-гидроксиэтил)-1-пиперазинетансульфоновая кислота).
      2. Стерилизуют раствор, проходя через шприцевой фильтр 0,2 мкм, и хранят при 4 °C для длительного хранения.
   5. Буфер пищеварения
      ПРИМЕЧАНИЕ: Готовьте заново перед использованием.
      1. Приготовьте 2 мл буфера пищеварения для переваривания 2-4 мозжечковых тканей и 4 мл на 4-10 тканей. Для приготовления 4 мл буфера пищеварения растворяют 1,5 мг L-цистеина (конечная концентрация 200-400 мкг/мл) в 4 мл ЭБСС. Переверните трубку несколько раз, пока порошок полностью не растворится.
      2. Стерилизуют раствор с помощью шприцевого фильтра 0,2 мкм и шприца 5 мл и переложат раствор в стерильную чашку для культивирования клеток 35 мм.
      3. Добавьте 4 мкл папаина (разбавление 1:1000 из исходной концентрации 20 единиц/мг) и 40 мкл ДНКазы I (разведение 1:100 из запаса 10 мг/мл для конечной концентрации 0,1 мг/мл).
      4. Инкубируют раствор при 37°С в _{CO2-инкубаторе} в течение не менее 30 мин или до использования.
         ПРИМЕЧАНИЕ: Этот шаг имеет решающее значение для активации папаина. Для достижения оптимальных результатов не превышайте 45 мин при 37 °C перед использованием. Убедитесь, что раствор становится прозрачным и перед использованием нет белых осадков.
2. Обшивки предварительного покрытия
   1. Чтобы подготовить крышки для прикрепления клеток, инкубируют автоклавные стеклянные крышки 12 мм со 100 мкг/мл поли-D-лизина (PDL, 1 мг/мл в стерильном _dH2O) в течение не менее 1 ч при 37 °C. Храните крышки в том же растворе PDL при температуре 4 °C до использования.
   2. В день первичной культуры клеток соберите PDL в чистую коническую трубку и трижды промойте крышки стерильным _dH2O, чтобы удалить остаточный PDL.
      ПРИМЕЧАНИЕ: PDL можно хранить при температуре 4 °C для повторного использования.
   3. Переложите стеклянные крышки с покрытием PDL на пластину с 24 лунками, поместив по одному крышке в каждую скважину.
   4. Удалите лишнюю воду и добавьте 200-300 мкл Матригеля (восстановленного в соответствии с инструкциями в техническом описании продукта в бессывороточном DMEM-F12), чтобы полностью покрыть крышки.
   5. Инкубируйте крышки в Matrigel в течение 1 ч при 37 °C в _{CO2-инкубаторе} .
      ПРИМЕЧАНИЕ: Удалите Матригель перед посевом клеток. Этот Matrigel можно собирать и хранить при температуре 4 °C для многократного повторного использования.
3. Приготовление блюда для предварительной обработки культуры
   1. Покройте чашку для культивирования клеток 60 мм 2 мл 100 мкг/мл PDL (восстановите 1 мг/мл раствора PDL в стерильном _dH2O) путем инкубации при 37 °C в течение 1 ч.
   2. Непосредственно перед посевом клеток удалите и соберите использованный PDL в чистую коническую трубку и храните его при 4 °C для многократного повторного использования. Промыть и вымыть посуду, покрытую PDL, три раза стерильным _dH2O. Перед посевом клеток высушите на воздухе.
   3. Используйте одну чашку для культивирования клеток толщиной 60 мм, чтобы посеять клетки, собранные максимум из 2 тканей цельного мозжечка.
   4. Приготовьте дополнительные культуральные блюда для дополнительных мозжечков.
      ПРИМЕЧАНИЕ: См. этапы 2.1.18 и 2.1.19 для использования формы для предварительной обработки культуры.

2. Экспериментальный день 0

1. Выделение и культивирование первичных GCP мышей
   ПРИМЕЧАНИЕ: Метод языка и региональных параметров GCP был модифицирован по сравнению со стандартным протоколом, а краткий протокол был кратко описан в нашей предыдущей работе.^6,11,12. Для оптимального выхода GCP используйте послеродовых (P) щенков 6-го или P7-го дня для выделения GCP. Выполните следующие этапы рассечения 2.1.6-2.1.10 как можно быстрее для оптимальной жизнеспособности клеток.
   1. Предваренный SFM, среда, блокирующая пищеварение, культуральная среда и Opti-MEM при 37 °C во время рассечения.
   2. На чистом стенде предварительно замочите весь рассеченный аппарат в 70% этаноле для дезинфекции.
   3. Наполните тарелку для культивирования клеток 60 мм 2-3 мл буфера для рассечения и охладите ее на льду.
   4. Подготовьте свежий буфер для пищеварения, как описано в разделе 1.1.5, и держите его в тепле при 37 °C.
   5. Используйте 70% этанол, чтобы протереть голову щенка для дезинфекции.
   6. Обезглавить щенка без анестезии. Используйте щипцы, чтобы держать голову и стерилизованные хирургические ножницы, чтобы вырезать из задней части черепа, чтобы обезглавить щенка. Осторожно удалите кожу и череп, чтобы раскрыть мозг с помощью щипцов.
   7. Используйте щипцы, чтобы отщипнуть мозжечок и быстро замочить его в предварительно охлажденном буфере рассечения, подготовленном на этапе 2.1.3.
   8. Удалите мозговые оболочки мозжечком, погруженным в буфер рассечения под рассекающим микроскопом. Обогащенные кровеносными сосудами мозговые оболочки должны казаться розоватыми под рассекающим микроскопом.
   9. Удалите все мозговые оболочки с помощью щипцов.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Мозжечок без мозговых оболочек должен иметь беловатый вид.
   10. Удалите все видимые ткани среднего мозга и сосудистое сплетение из мозжечка.
   11. Переложите мозжечок в 35 мм культуральную чашку, предварительно заполненную теплым буфером пищеварения, приготовленным на этапе 2.1.4. Избегайте переноса избыточного буфера рассечения. Разрежьте мозжечок на мелкие кусочки с помощью ножниц с микропрыжкой как можно быстрее.
   12. Немедленно высиживать измельченный мозжечок при 37 °C в течение 15 мин в _{CO2-инкубаторе} . Продлите время инкубации до 20 мин, если необходимо обработать более 4 мозжечков.
       ПРИМЕЧАНИЕ: После инкубации ткань будет слипаться вместе.
   13. Немедленно перенесите переваренную ткань на дно новой стерильной центрифужной трубки объемом 15 мл с помощью наконечника пипетки P1000 с блокирующей средой для пищеварения (избегайте переноса буфера пищеварения).
   14. Добавьте соответствующий объем блокирующей среды пищеварения (1 мл на 1 мозжечок), чтобы прекратить пищеварение и пипетку вверх и вниз осторожно 30 раз, используя микропипетку P1000 для дальнейшего диссоциации ткани на одноклеточную суспензию. Избегайте образования пузырьков воздуха.
   15. Осторожно пропустите клеточную суспензию через клеточный сетчатый фильтр 70 мкм в новую стерильную центрифужную трубку, чтобы удалить клеточные сгустки.
   16. Пропустите дополнительно 1 мл свежей блокирующей среды пищеварения через клеточный ситечко для сбора остаточных клеток из клеточного ситечка.
   17. Центрифугируют фильтрат при 200 × г в течение 5 мин при комнатной температуре (РТ). Удалите супернатант и повторно суспендируйте гранулу с 1 мл SFM. Повторите этот шаг дважды. Избегайте образования пузырьков воздуха.
   18. Повторно суспендируют гранулу в конечном объеме 2 мл питательной среды GCP и переложат клеточную суспензию в покрытую PDL 60 мм форму для предварительного покрытия, приготовленную на стадии 1.3. Инкубировать в течение 15 мин при 37 °C в _{CO2-инкубаторе} .
       ПРИМЕЧАНИЕ: Не превышайте 20 мин.
   19. После инкубации постучите по чашке для культивирования сбоку, чтобы выбить слабо прилипшие клетки GCP. Соберите адгезивные клетки GCP в культуральную среду путем щадящей пипетки с использованием пипетки P1000. Соберите эту суспензию GCP в новую центрифужную трубку объемом 15 мл. Отбросьте тарелку толщиной 60 мм.
       ПРИМЕЧАНИЕ: Сильно адгезионные клетки астроглии и фибробластов останутся прикрепленными на дне тарелки толщиной 60 мм и будут разделены на этом этапе. Пропуск этого шага поставит под угрозу чистоту культуры GCP.
   20. Подсчитайте ячейки и немедленно приступайте к электропорации.
2. День in vitro (DIV) 0: Электропорация для гиперэкспрессии трансгена Hh рецептора: pEGFP-Smo
   1. Для электропорации с использованием кюветы с зазором 2 мм готовят следующую плазмидно-клеточную электропорационную смесь для каждой реакции электропорации: 1,2 × ¹⁰⁶ клеток и 10 мкг pEGFP-mSmo (отрегулируйте концентрацию запаса ДНК до ~2-5 мкг/мкл в буфере Tris-EDTA или стерильном _dH2O) в 100 мкл Opti-MEM.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Уменьшите общее количество ячеек, если ячеек недостаточно (хотя это может снизить эффективность электропорации). Однако не корректируйте количество плазмиды или общий объем Opti-MEM, используемого на кювету. Если общее количество ячеек, необходимое для эксперимента, превышает 1,5 × ¹⁰⁶ ячеек, соответственно увеличьте электропорационную смесь и выполните несколько реакций электропорации отдельно. Кювету можно повторно использовать до 5 раз.
   2. Подготовьте пластину для посева клеток после электропорации, добавив 0,5 мл питательной среды в каждую лунку 24-луночной культуральной пластины, содержащей покрытые крышками (со стадии 1.2), и держите ее в тепле при 37 °C в инкубаторе _CO2 .
   3. Начиная со стадии 2.1.20, пипетка необходимого количества клеток в стерильную микроцентрифужную трубку 1,5 мл и вращение при 200 × г в течение 5 мин при РТ. Выбросьте надосадочный и повторно суспендируйте ячейку гранулы в 200 мкл Opti-MEM. Повторите этот шаг дважды с Opti-MEM, чтобы убедиться, что в пробирке нет остаточной питательной среды.
      ПРИМЕЧАНИЕ: На каждую лунку/крышку 24-луночной пластины, электропората и семенного 1,2-1,3 × ¹⁰⁶ клеток/лунок для получения ~70-75% клеточной стючки на следующий день посева.
   4. Задайте параметры электропорации, как показано в таблице 1.
   5. Пипетку электропорационной реакции осторожно перемешать хорошо и использовать длинный наконечник Р200 для переноса точного объема 100 мкл смеси в 2 мм зазор кюветы. Избегайте образования пузырьков.
   6. Поместите кювету в камеру кюветы.
   7. Нажмите кнопку Ω электропоратора (см. Таблицу материалов) и запишите значение импеданса, которое должно быть ~30-35. Чтобы убедиться, что значение электрического импеданса Ω находится в пределах 30-35, придерживайтесь точного объема 100 мкл.
   8. Нажмите кнопку запуска , чтобы запустить импульс.
   9. Запишите значения измеренного тока и джоулей, отображаемые на кадре считывания.
   10. Извлеките кювету из камеры кюветы.
   11. Немедленно добавьте в кювету 100 мкл предварительной питательной среды и повторно суспендируйте ее путем мягкой пипетки вверх и вниз 2-3 раза. Немедленно перенесите клеточную суспензию на 24-луночную пластину, подготовленную на этапе 2.2.2.
       ПРИМЕЧАНИЕ: Чтобы свести к минимуму гибель клеток, засейте клетки сразу после электропорации.
   12. Инкубируйте клетки при 37 °C в _{CO2-инкубаторе} . Оставьте клетки нетронутыми в течение 3 ч, чтобы избежать отслоения клеток.
   13. Через 3 часа после посева аккуратно аспирировать и выбросить половину надосадочной среды, чтобы удалить плавающие мертвые клетки и мусор и заменить таким же количеством предварительно расплавленной питательной среды.
   14. Инкубируйте клетки при 37 °C в _{CO2-инкубаторе} и пополняйте половину среды через день.
   15. Наблюдайте за клетками под флуоресцентным микроскопом на следующий день, т.е. DIV1 (рисунок 1) для сигнала GFP для определения эффективности сверхэкспрессии Smo.
   16. Для стимуляции сигнального пути Hh на DIV 1 после пополнения половины среды добавьте 0,2 мкМ сглаженного агониста (SAG) к клеткам, добавив равный объем DMSO в контроль. Инкубировать в течение 24 ч до фиксации клеток.
       ПРИМЕЧАНИЕ: Держите добавленный объем DMSO/SAG как можно ниже. Здесь на 500 мкл среды на скважину добавляли 0,5 мКЛ ДМСО или 0,5 мкл 0,2 мМ SAG, что представляет собой коэффициент разрежения 1:1000.

3. DIV 2: Визуализация первичных ресничек и исследование сигнального пути Hh

1. Фиксация клеток
   1. Через 24 ч после обработки удалите культуральную среду и промывайте клетки 2-3 раза фосфатно-буферным физиологическим раствором (PBS) с использованием одноразовой пипетки Пастера, избегая смещения клеток.
   2. Зафиксируйте клетки, добавив ~400 мкл 4% параформальдегида (приготовленного в PBS) и инкубируйте на RT в течение 10 мин.
   3. Промыть и вымыть 2-3 раза ПБС с помощью одноразовой пипетки Пастера.
   4. Хранить в PBS при температуре 4 °C до 2 месяцев или перейти к иммуноокрашиванию.
2. Иммуноцитохимическое окрашивание GCP и первичного маркера реснички
   1. В 24-луночной пластине дважды промывайте клетки в PBS с легким встряхиванием в течение 5 минут каждый раз.
   2. Добавьте в клетку 0,5 мл хлорида аммония 100 мМ и инкубируйте на RT в течение 10 мин для гашения фиксатора.
   3. Промыть один раз и промыть 2-3 раза ПБС с нежным встряхиванием в течение 10 мин каждый раз.
   4. Аккуратно пипетку 30 мкл блокирующего буфера (BB: 0,1% Triton X-100, 1% BSA, 2% термоинактивированной конской сыворотки в PBS) на кусок парапленки с образованием капли без пузырьков воздуха.
   5. Аккуратно перенесите крышку из колодца на капельку BB с клеточной стороной, обращенной вниз. Инкубируют клетки с ВВ во влажной камере в течение 1 ч при РТ.
   6. Готовят первичную смесь антител в ВВ, как показано в Таблице материалов. Чтобы исследовать клетки с первичным антителом, повторите шаги 3.2.4 и 3.2.5, заменив BB первичной смесью антител. Инкубируют клетки с первичным антителом в течение 2 ч при РТ.
   7. Используя щипцы, перенесите крышки обратно на 24-луночную пластину с засеянной клетками стороной, обращенной вверх. Промыть клетки один раз и промыть 3-4 раза в PBS с легким встряхиванием в течение 10 мин каждый раз.
   8. Готовят смесь вторичных антител в ВВ, как показано в Таблице материалов. Чтобы инкубировать клетки с вторичным антителом, повторите шаги 3.2.4 и 3.2.5, заменив BB смесью вторичных антител. Инкубировать в темноте в течение 1 ч при РТ.
   9. Повторите этап 3.2.7 для послевториальной инкубационной промывки антител.
   10. Установите крышку на чистую микроскопическую стеклянную горку с помощью монтажного носителя.
   11. Высушите горку в темноте на ночь и приступайте к конфокальной ^{визуализации13}.

Результаты

Используя Opti-MEM (см. Таблицу материалов) в качестве универсального реагента, эта предлагаемая методология электропорации может достичь стабильно высокой эффективности электропорации при ~80-90% (рисунок 1). Эффективность электропорации вектора Smo-EGFP определяли пр...

Обсуждение

Трансфекция трансгенов в первичной культуре GCP методом электропорации обычно связана с низкой жизнеспособностью клеток и плохой эффективностью трансфекции9,10. В настоящем документе представлен экономически эффективный и воспроизводимый протокол элек...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
GCP Culture
B27 supplement	Life Technologies LTD	17504044
Cell strainer, 70 µm	Corning	352350
DNase I from bovine pancreas	Roche	11284932001
Earle’s Balanced Salt Solution	Gibco, Life Technologies	14155063
FBS, qualified	Thermo Scientific	SH30028.02
GlutamMAXTM-I ,100x	Gibco, Life Technologies	35050061	L-glutamine substitute
L-cysteine	Sigma Aldrich	C7352
Matrigel	BD Biosciences	354277	Basement membrane matrix
Neurobasal	Gibco, Life Technologies	21103049
Papain,suspension	Worthington Biochemical Corporation	LS003126
Poly-D-lysine Hydrobromide	Sigma Aldrich	P6407
SAG	Cayman Chemical	11914-1	Smoothened agonist
IF staining
Bovine Serum Albumin	Sigma Aldrich	A7906
Paraformaldehyde	Sigma Aldrich	P6148
Triton X-100	Sigma Aldrich	X100
Primary antibody mix
Anti-GFP-goat ab	Rockland	600-101-215	Dilution Factor: 1 : 1000
Anti-Arl13b mouse monoclonal ab	NeuroMab	75-287	Dilution Factor: 1 : 1000
Anti-Pax6 rabbit polyclonal ab	Covance	PRB-278P	Dilution Factor: 1 : 1000
Secondary antibody mix
Alexa Fluor 488 donkey anti-goat IgG	Invitrogen	A-11055	Dilution Factor: 1 : 1000
Alexa Fluor 555 donkey anti-mouse IgG	Invitrogen	A-31570	Dilution Factor: 1 : 1000
Alexa Fluor 647 donkey anti-rabbit IgG	Invitrogen	A-31573	Dilution Factor: 1 : 1000
DAPI	Thermo Scientific	62247	Dilution Factor: 1 : 1000
Electroporation
CU 500 cuvette chamber	Nepagene	CU500
EPA Electroporation cuvette (2 mm gap)	Nepagene	EC-002
Opti-MEM	Life Technologies LTD	31985070	reduced-serum medium for transfection
pEGFP-mSmo	Addgene	25395
Super Electroporator NEPA21 TYPE II In Vitro and In Vivo Electroporation	Nepagene	NEPA21	electroporator