Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • النتائج
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

هنا ، نصف طريقة مفصلة لعزل الميتوكوندريا عن العضلات الهيكلية للفأر والتحليل اللاحق للتنفس بواسطة معدل استهلاك الأكسجين (OCR) باستخدام المقايسات التنفسية القائمة على الصفائح الدقيقة. يمكن تطبيق خط الأنابيب هذا لدراسة آثار التدخلات البيئية أو الجينية المتعددة على استقلاب الميتوكوندريا.

Abstract

يتم الحصول على معظم طاقة الخلية من خلال تحلل الجلوكوز والأحماض الدهنية والأحماض الأمينية من خلال مسارات مختلفة تتلاقى على نظام الفسفرة التأكسدية للميتوكوندريا (OXPHOS) ، والذي يتم تنظيمه استجابة للطلبات الخلوية. جزيء الدهون الإنزيم المساعد Q (CoQ) ضروري في هذه العملية عن طريق نقل الإلكترونات إلى المركب الثالث في سلسلة نقل الإلكترون (ETC) من خلال دورات أكسدة / اختزال ثابتة. يمكن تقييم حالة الميتوكوندريا ، وفي النهاية ، الصحة الخلوية عن طريق قياس استهلاك الأكسجين ETC باستخدام المقايسات التنفسية. عادة ما يتم إجراء هذه الدراسات في خطوط الخلايا الثابتة أو الأولية التي تم زراعتها لعدة أيام. في كلتا الحالتين ، قد تكون معلمات التنفس التي تم الحصول عليها قد انحرفت عن الظروف الفسيولوجية الطبيعية في أي عضو أو نسيج معين.

بالإضافة إلى ذلك ، فإن الخصائص الجوهرية للألياف المفردة المستزرعة المعزولة من العضلات الهيكلية تعيق هذا النوع من التحليل. تقدم هذه الورقة بروتوكولا محدثا ومفصلا لتحليل التنفس في الميتوكوندريا المعزولة حديثا من العضلات الهيكلية للفأر. كما نقدم حلولا للمشاكل المحتملة التي يمكن أن تنشأ في أي خطوة من خطوات العملية. يمكن تطبيق الطريقة المعروضة هنا لمقارنة معدلات استهلاك الأكسجين في نماذج الفئران المعدلة وراثيا المتنوعة ودراسة استجابة الميتوكوندريا للعلاجات الدوائية أو عوامل أخرى مثل الشيخوخة أو الجنس. هذه طريقة مجدية للرد على الأسئلة الحاسمة حول استقلاب وتنظيم الطاقة الحيوية للميتوكوندريا.

Introduction

الميتوكوندريا هي العضيات الأيضية الأساسية في الخلية1. تستخدم هذه العضيات المتخصصة المغلقة بالأغشية جزيئات مغذية لإنتاج الطاقة في شكل أدينوسين ثلاثي الفوسفات (ATP) بواسطة OXPHOS. تعتمد هذه العملية على نقل الإلكترونات من الجزيئات المانحة في سلسلة من تفاعلات الأكسدة والاختزال في ETC2. CoQ هو الدهون الوحيدة النشطة في الأكسدة والاختزال التي يتم إنتاجها داخليا في جميع الأغشية الخلوية والبروتينات الدهنية المتداولة التي تظهر وظيفة مضادات الأكسدة 3. وهو مكون أساسي في ETC ، حيث ينقل الإلكترونات من المجمع I المعتمد على NADH والمجمع الثاني المعتمد على FADH2 إلى المركب الثالث ، على الرغم من أن العديد من المختزلات الأخرى يمكن أن تدفع إلى تقليل CoQ الميتوكوندريا إلى يوبيكوينول كخطوة إلزامية في مسارات التمثيل الغذائي الخلوية المتعددة4,5.

طوال العملية ، يتم إنشاء تدرج بروتون كهروكيميائي عبر الغشاء الداخلي للميتوكوندريا ، والذي يتم تحويله إلى طاقة نشطة بيولوجيا بواسطة مركب ATP synthase V2. وبالتالي ، يؤدي خلل الميتوكوندريا إلى عدد لا يحصى من الحالات المرضية التي تؤثر بشكل رئيسي على الأنسجة ذات المتطلبات العالية للطاقة - الدماغ والقلب والعضلات الهيكلية6,7. لذلك ، من الضروري تطوير طرق لتحليل الطاقة الحيوية للميتوكوندريا بدقة للتحقيق في دورها في الصحة والمرض ، خاصة في الأنسجة عالية الطاقة مثل العضلات الهيكلية.

تم استخدام قطب الأكسجين من نوع كلارك بشكل كلاسيكي في دراسة تنفس الميتوكوندريا8. ومع ذلك، فقد تم استبدال هذا النظام تدريجيا بتقنيات عالية الدقة، مع تقنيات استهلاك الأكسجين القائمة على الصفائح الدقيقة مثل أجهزة تحليل Agilent Seahorse XF التي تحظى بشعبية خاصة9. في مجال العضلات الهيكلية ، يتم إجراء هذه الدراسات عادة في الخلايا المستزرعة ، وخاصة في خط الخلايا العضلية المخلدة للفئران C2C12 أو الثقافات الأولية المشتقة من خلايا الأقمار الصناعية 10,11. ومع ذلك ، فإن هذه الدراسات لا تلخص بشكل كامل الوضع في الجسم الحي ، خاصة عند التحقيق في بيولوجيا الميتوكوندريا ووظيفتها على مستوى الأنسجة عند إهانات محددة أو تدخلات غير جينية أو تلاعبات جينية.

علاوة على ذلك ، فإن اختبارات التنفس في الخلايا أكثر تعقيدا بسبب عوامل إضافية ، بما في ذلك الطلب خارج الميتوكوندريا على ATP وركائز الفحص أو أحداث الإشارة ، والتي يمكن أن تضلل تفسير النتائج. بدلا من ذلك ، من الممكن أيضا استخدام مفردة أو حزم من الألياف العضلية المعزولة حديثا من العضلات. ومع ذلك ، فإن طريقة العزل صعبة تقنيا وممكنة فقط لعدد قليل من أنواع العضلات. في هذه الحالة ، يتم استخدام العضلات المثنية الرقمية (FDB) والعضلات الباسطة الرقمية الطويلة (EDL) بشكل رئيسي10،12،13 ، على الرغم من أن بعض التقارير تصف استخدام أنواع العضلات الأخرى أيضا14،15.

كما تم الإبلاغ عن تنميط الطاقة الحيوية لأقسام العضلات الهيكلية 16. الميزة الرئيسية لهذه الطريقة هي أنه يمكن دراسة العضلات السليمة (يوضح المؤلفون أن التقطيع عبر الألياف لا يزعج النتائج عند مقارنتها بالألياف العضلية المعزولة). ومع ذلك ، فإن وصول الميتوكوندريا إلى الركائز ومثبطات الفحص محدود ، وبالتالي ، لا يمكن قياس سوى عدد قليل من المعلمات16. وأخيرا، يمكن أيضا استخدام الميتوكوندريا المعزولة9،17،18،19. في هذه الحالة ، تفقد الميتوكوندريا بيئتها الخلوية ، مما قد يؤثر على وظيفتها. في المقابل ، تضمن هذه الطريقة الوصول إلى الركائز والمثبطات ، وتمكن من تحليل عدد كبير من أنواع العينات ، وعادة ما تتطلب مواد أقل.

تصف هذه الورقة طريقة لإجراء التنميط الحيوي للميتوكوندريا المعزولة من العضلات الهيكلية للفأر باستخدام المقايسات التنفسية القائمة على الألواح الدقيقة (الشكل 1). وعلى وجه الخصوص، هناك ثلاثة بروتوكولات مفصلة: فحص الاقتران، كاليفورنيا لتقييم درجة الاقتران بين ETC وآلية OXPHOS؛ واختبار الاقتران، CA لتقييم درجة الاقتران بين ETC وآلية OXPHOS؛ واختبار الاقتران، CA لتقييم درجة الاقتران بين ETC وآلية OXPHOS؛ واختبار الاقتران، CA لتقييم درجة الاقتران بين ETC وآلية OXPHOS؛ واختبار الاقتران، CA لتقييم درجة الاقتران بين ETC فحص تدفق الإلكترون ، EFA لقياس نشاط مجمعات ETC الفردية ؛ وفحص BOX لتحديد قدرة الميتوكوندريا على أكسدة β. والجدير بالذكر أن هناك حاجة إلى كميات صغيرة فقط من العينات مقارنة بطرق قياس التنفس التقليدية. تم تعديل بروتوكول العزل المستخدم هنا من الطريقة المنشورة في مكان آخر18.

Protocol

تم إجراء مبيت الفئران وجمع الأنسجة باستخدام بروتوكولات معتمدة من قبل لجنة أخلاقيات جامعة بابلو دي أولافيد (إشبيلية ، إسبانيا ؛ البروتوكولان 24/04/2018/056 و 12/03/2021/033) وفقا للمرسوم الملكي الإسباني 53/2013 ، والتوجيه الأوروبي 2010/63/EU ، والمبادئ التوجيهية الأخرى ذات الصلة.

1. إعداد المخزونات والمخازن المؤقتة والكواشف لمقايسات التنفس

  1. قم بإعداد حلول المخزون التالية ، والتي يمكن تخزينها في درجة الحرارة المحددة لعدة أشهر. استخدم H2O فائق النقاء في جميع الحالات.
    1. قم بإذابة الأقراص المالحة العازلة بالفوسفات (PBS) في H2O (قرص واحد لكل 200 مل من H2O) لإعداد 1x PBS. قم بتعقيم المحلول وتخزينه في درجة حرارة الغرفة (RT).
    2. قم بإذابة 2 جم من كريات NaOH في 50 مل من H2O لإعداد 1 M NaOH.
    3. قم بإعداد مخزون 0.1 M و 1 M و 5 M و 10 M KOH لمعايرة الأس الهيدروجيني.
    4. أضف 14.612 جم من EDTA إلى 70 مل من H2O. أضف كريات NaOH حتى يصل الرقم الهيدروجيني إلى 8.0 بحيث يذوب EDTA بالكامل. أضف الساتس الكمومي H2O (QS) إلى 100 مل. قم بتعقيم محلول 0.5 M EDTA (الرقم الهيدروجيني 8) الناتج وقم بتخزينه في RT.
    5. أضف 19 جم EGTA إلى 70 مل من H2O. أضف كريات NaOH حتى يصل الرقم الهيدروجيني إلى 8.0 للسماح ل EGTA بالذوبان بالكامل. أضف H2O QS إلى 100 مل. قم بتعقيم محلول 0.5 M EGTA (الرقم الهيدروجيني 8) الناتج وتخزينه في RT.
    6. أضف 2 مل من 0.5 M EDTA إلى 98 مل من PBS. قم بتخزين حل 10 mM EDTA/PBS الناتج في RT.
    7. قم بإذابة 5.958 جم من HEPES في 40 مل H2O. اضبط الرقم الهيدروجيني إلى 7.2 مع KOH و QS إلى 50 مل مع H2O. قم بتصفية المخزن المؤقت الناتج 0.5 M HEPES من خلال شبكة 0.45 ميكرومتر وقم بتخزينه في RT.
    8. قم بإذابة 3.402 جم من KH2PO4 في ما يصل إلى 50 مل من H2O. قم بتصفية محلول 0.5 M KH2PO4 الناتج من خلال شبكة 0.45 ميكرومتر وقم بتخزينه في RT.
    9. قم بإذابة 9.521 جم من MgCl2 اللامائي في ما يصل إلى 100 مل من H2O. قم بأتمتة محلول 1 M MgCl2 الناتج وقم بتخزينه في RT.
      ملاحظة: بما أن هذا تفاعل طارد للحرارة ، تابع بحذر وقم بإذابة MgCl2 على الجليد.
  2. إعداد حلول مخزون الركيزة والمثبطات (انظر الجدول 1). Aliquot وتخزينها في -20 درجة مئوية. تجنب دورات التجميد والذوبان. كاستثناء ، قم دائما بإعداد حمض البيروفيك مباشرة قبل الاستخدام.
    1. تحضير في H2O فائقة النقاء: 0.5 M سكسينات ، 0.5 M حمض البيروفيك ، 0.5 M حمض الماليك ، 100 mM ADP ، 1 M حمض الأسكوربيك ، و 50 mM N ، N ، N ′ ، N ′ ، N′-رباعي ميثيل بارا فينيلين ديامين (TMPD) (حماية من الضوء).
    2. تحضير في 100٪ ثنائي ميثيل سلفوكسيد (DMSO): 50 mM بالميتويل-L-كارنيتين، 4 mM روتينون، 20 mM سيانيد الكربونيل p-trifluoromethoxyphenylhydrazone (FCCP)، 4 mM oligomycin، و 5 mM Antimycin A.
      ملاحظة: لا تتجاوز 0.1٪ من تركيز DMSO النهائي في آبار الصفائح الدقيقة. لذلك ، قم بإعداد حلول مخزون عالية التركيز للبقاء دون هذا الحد.
  3. قم بإعداد المخازن المؤقتة لعزل الميتوكوندريا وتحديد كمية البروتين طازجة في يوم التجربة. استخدم H2O فائق النقاء في جميع الحالات واحتفظ بجميع المخازن المؤقتة على الجليد ما لم ينص على خلاف ذلك.
    ملاحظة: لتوفير الوقت، يمكن وزن جميع الكواشف والاحتفاظ بها في الحاويات المناسبة (على سبيل المثال، أنابيب 15 مل) في درجة الحرارة المناسبة في اليوم السابق.
    1. لإعداد 10٪ من الأحماض الدهنية الحرة (FFA) BSA ، قم بإذابة 150 ملغ من FFA BSA تماما في 1.5 مل من H2O بواسطة عجلة مقلوبة / دوارة. لا دوامة لتجنب الرغوة.
    2. لإعداد كاشف 1x Bradford ، قم بتخفيف حل المخزون التجاري 5x باستخدام H2O وإبقائه في الظلام في RT.
    3. لتحضير 8x Mitochondria Buffer (MB) ، قم بإذابة 4.112 جم من السكروز و 763 مجم من HEPES في 15 مل من H2O. اضبط الرقم الهيدروجيني على 7.2 ، وأضف 1.6 مل من 10٪ FFA BSA و QS إلى 20 مل مع H2O.
    4. لإعداد 20 مل من العزل المؤقت 1 (IB1) (4 مل المستخدمة لكل عينة) ، قم بإذابة 400 ميكرولتر من 0.5 M EDTA ، و 784 ملغ من D-mannitol ، و 2.5 مل من 8x MB في 15 مل من H2O. اضبط الرقم الهيدروجيني إلى 7.2 و QS مع H2O.
    5. لإعداد 5 مل من العزل العازل 2 (IB2) (500 ميكرولتر المستخدمة لكل عينة) ، قم بإذابة 30 ميكرولتر من 0.5 M EGTA ، و 196 ملغ من D-mannitol ، و 625 ميكرولتر من 8x MB في 4 مل من H2O. اضبط الرقم الهيدروجيني إلى 7.2 و QS مع H2O.
    6. لإعداد 5 مل من المخزن المؤقت لإعادة التعليق (RB) (200 ميكرولتر المستخدمة لكل عينة) ، قم بإذابة 120 ملغ من السكروز ، و 191.3 ملغ من D-mannitol ، و 50 ميكرولتر من 0.5 M HEPES ، و 10 ميكرولتر من 0.5 M EGTA في 4 مل من H2O. اضبط الرقم الهيدروجيني إلى 7.2 و QS مع H2O.
    7. لإعداد 2x Mitochondrial Assay Solution-1 (MAS-1) ، قم بإذابة 1.199 جم من السكروز ، و 2.8 جم من مانيتول ، و 1 مل من 0.5 M KH2PO4 ، و 250 ميكرولتر من 1 M MgCl2 ، و 200 ميكرولتر من 0.5 M HEPES ، و 100 ميكرولتر من 0.5 M EGTA في 20 مل من H2O. اضبط الرقم الهيدروجيني إلى 7.2 و QS إلى 25 مل مع H2O. احتفظ به في الجليد لفترات قصيرة. لفترات أطول ، احتفظ بها عند 4 درجات مئوية لتجنب هطول الأمطار.
    8. لإعداد وسيط فحص اقتران 1x (CAM) ، قم بإعداد مخزنين مؤقتين مختلفين قائمين على MAS-1: 1) CAM + BSA لفحص CA المناسب ، و 2) CAM-BSA لإعداد مثبطات الفحص. حافظ دائما على نسبة البيروفات: مالات عند 10: 1.
      ملاحظة: نظرا لأن BSA يمكن أن يسد منافذ الحقن ، قم بتخفيف المثبطات في كاميرا CAM الخالية من BSA.
      1. لتحضير CAM + BSA ، قم بتخفيف 300 ميكرولتر من 0.5 M من حمض البيروفيك ، و 30 ميكرولتر من 0.5 M من حمض الماليك ، و 7.5 مل من 2x MAS-1 في 6 مل من H2O. اضبط الرقم الهيدروجيني على 7.2. أضف 300 ميكرولتر من 10٪ FFA BSA و QS إلى 15 مل مع H2O.
      2. لإعداد CAM-BSA ، قم بتخفيف 120 ميكرولتر من 0.5 مليون حمض بيروفيك ، و 12 ميكرولتر من 0.5 مليون حمض الماليك ، و 3 مل من 2x MAS-1 في 2 مل من H2O. اضبط الرقم الهيدروجيني إلى 7.2 و QS إلى 6 مل مع H2O.
    9. لإعداد 1x وسيط فحص تدفق الإلكترون (EFAM) ، قم بإعداد كل من المخازن المؤقتة EFAM المحتوية على BSA والخالية من BSA.
      1. لتحضير EFAM + BSA ، قم بتخفيف 300 ميكرولتر من 0.5 مليون حمض بيروفيك ، و 60 ميكرولتر من 0.5 مليون حمض الماليك ، و 3 ميكرولتر من 20 مللي متر FCCP ، و 7.5 مل من 2x MAS-1 في 6 مل من H2O. اضبط الرقم الهيدروجيني إلى 7.2. أضف 300 ميكرولتر من 10٪ FFA BSA و QS إلى 15 مل مع H2O.
      2. لإعداد EFAM-BSA ، قم بتخفيف 120 ميكرولتر من 0.5 مليون حمض البيروفيك ، و 24 ميكرولتر من 0.5 مليون حمض الماليك ، و 1.2 ميكرولتر من 20 مللي متر FCCP ، و 3 مل من 2x MAS-1 في 2 مل من H2O. اضبط الرقم الهيدروجيني إلى 7.2 و QS إلى 6 مل مع H2O.
    10. لإعداد 1x β وسط أكسدة (BOXM) ، قم بإعداد حلول BOXM المحتوية على BSA والخالية من BSA.
      1. لتحضير BOXM + BSA ، قم بتخفيف 12 ميكرولتر من 50 mM palmitoyl-L-carnitine ، و 30 ميكرولتر من 0.5 m حمض الماليك ، و 7.5 مل من 2x MAS-1 في 7 مل من H2O. اضبط الرقم الهيدروجيني إلى 7.2. أضف 300 ميكرولتر من 10٪ FFA BSA و QS إلى 15 مل مع H2O.
      2. لتحضير BOXM-BSA ، قم بتخفيف 4.8 ميكرولتر من 50 mM palmitoyl-L-carnitine ، و 12 ميكرولتر من 0.5 m من حمض الماليك ، و 3 مل من 2x MAS-1 في 2 مل من H2O. اضبط الرقم الهيدروجيني إلى 7.2 و QS إلى 6 مل مع H2O.

2. تشريح العضلات ، والتجانس ، وعزل الميتوكوندريا

  1. ضع جميع المواد والمخازن المؤقتة على الجليد. تأكد من أن جميع المواد باردة أثناء الإجراء بأكمله لحماية الميتوكوندريا من التلف.
  2. ضع ثلاثة أكواب سعة 50 مل لكل عينة على الجليد ، وأضف الحلول التالية: 10 مل من PBS في الكأس 1 ، و 10 مل من 10 مللي متر من EDTA / PBS في الكأس 2 ، و 4 مل من IB1 في الكأس 3.
  3. القتل الرحيم للفأر عن طريق خلع عنق الرحم. تجنب القتل الرحيم CO2 لأن عضلات الهيكل العظمي يمكن أن تصبح ناقصة الأكسجين ، مما يتداخل مع تحليلات التنفس.
  4. رش الطرف الخلفي الأيمن بنسبة 70٪ من الإيثانول لمنع الفراء من التساقط ، وقم بربط الطرف بلوحة تشريح الفلين. قم بتسجيل الطرف الأمامي الأيسر أيضا.
  5. قم بعمل شق باستخدام مشرط معقم يمكن التخلص منه عبر الجلد من الركبة إلى أخمص القدمين.
  6. أمسك الجلد بملقط مسنن على مستوى الكاحل وقطعه بمقص ناعم حول الكاحل.
  7. قم بتخفيف الجلد بعيدا عن العضلات الأساسية باستخدام ملاقط دقيقة في يد واحدة أثناء سحبها باستخدام ملقط مسنن في اليد الأخرى.
  8. تشريح جميع عضلات الهيكل العظمي من الكاحل إلى الركبة (الشكل 2).
    1. قم بإزالة جميع الأنسجة الضامة فوق العضلة الأمامية الظنبوبية (TA) لتسهيل استخراج العضلات باستخدام ملاقط ومقص دقيق.
    2. ابحث عن الأوتار الأربعة البعيدة لعضلة EDL وقسمها بالقرب من إدخالها في أصابع القدم. حدد موقع وتر TA البعيد وقطعه بالقرب من إدخاله ، دائما أسفل الكاحل.
    3. اسحب أوتار TA و EDL بعناية فوق الكاحل لتحرير الأطراف الفضفاضة.
    4. أمسك بالأطراف الرخوة للأوتار وقم بتخفيف العضلات بعيدا عن بقية العضلات والعظام عن طريق سحبها لأعلى. استخدم ملاقط أو مقصات دقيقة لتسهيل العملية. المضي قدما بحذر لتجنب تقلص الألياف العضلية.
    5. قطع الوتر القريب من EDL وعضلة TA أقرب ما يمكن إلى الرضفة.
    6. اقلب الماوس رأسا على عقب للمضي قدما في gastrocnemius (GA) واستخراج العضلات الوحيدة.
    7. أمسك الجيب المتشكل بين عظمة الفخذ ذات الرأسين و GA باستخدام ملقط مسنن. استخدم مقص دقيق لفصل هذه العضلات وتصور وتر GA القريب.
    8. امسك وتر أخيل بملقط ناعم وقطعه بعناية بمقص ناعم. حرر GA والعضلات الوحيدة من العظم الأساسي عن طريق سحبها من خلال الأوتار. قطع وتر GA القريب لتحريره مع النعل الأساسي.
    9. تشريح العضلات المتبقية بعناية من الوتر إلى الوتر باتباع نفس الإجراء حتى تبقى العظام فقط.
    10. أعد تثبيت الماوس في الموضع الأولي لتشريح عضلة الفخذ الرباعية.
    11. تخلص من الأنسجة الدهنية فوق العضلة رباعية الرؤوس في الجانب القريب باستخدام ملقط مسنن ومقص دقيق.
    12. أدخل ملاقط دقيقة بين الفخذ الرباعي وعظم الفخذ وحركها في كلا الاتجاهين على طول محور عظم الفخذ لفصل العضلات عن العظام.
    13. أمسك أوتار العضلات رباعية الرؤوس البعيدة بملقط مسنن واقطع الوتر بمقص دقيق أقرب ما يمكن إلى الرضفة.
    14. اسحب العضلة رباعية الرؤوس لأعلى وحررها عند الإدخال القريب باستخدام مقص دقيق.
  9. كرر الخطوات من 4 إلى 8 من هذا القسم مع الطرف الخلفي الأيسر.
  10. شطف جميع العضلات في الكأس 1 أولا ثم في الكأس 2.
  11. انقل جميع العضلات إلى Beaker 3 وقم بفرم جميع العضلات بدقة باستخدام مقص حاد على الجليد.
  12. انقل التعليق إلى أنبوب C (غطاء أرجواني) ، مع الاحتفاظ به دائما في الجليد.
  13. أغلق الأنبوب C بإحكام وقم بإرفاقه رأسا على عقب على كم المجانس. تأكد من أن مادة العينة موجودة في منطقة الدوار / الجزء الثابت. حدد برنامج 1 دقيقة يسمى m_mito_tissue_01.
  14. قسم المتجانس إلى أنبوبين لأجهزة الطرد المركزي الدقيقة المبردة مسبقا سعة 2 مل وأجهزة الطرد المركزي عند 700 × جم لمدة 10 دقائق عند 4 درجات مئوية في جهاز طرد مركزي على الطاولة.
  15. انقل المواد الفائقة إلى أنابيب جديدة مبردة مسبقا بسعة 2 مل ، مع تجنب الدهون والأنسجة غير المتجانسة بعناية. تخزين الكريات عند -80 درجة مئوية لتحديد نقاء التجزئة (الكسر N) (الشكل 3).
  16. أجهزة الطرد المركزي الفائقة عند 10500 × غرام لمدة 10 دقائق عند 4 درجات مئوية.
  17. انقل المواد الفائقة إلى أنابيب مبردة مسبقا جديدة سعة 2 مل وقم بتسميتها على أنها Supernatant Number 1 (SN1). تخزينها في -80 درجة مئوية لتحديد نقاء التجزئة (الشكل 3).
  18. أعد تعليق ودمج كلا الكريات في حجم إجمالي قدره 500 ميكرولتر من IB2 في الجليد.
  19. جهاز طرد مركزي عند 10500 × غرام لمدة 10 دقائق عند 4 درجات مئوية.
  20. انقل السوبرناتانت إلى أنبوب جديد مبرد مسبقا بسعة 2 مل وقم بتسميته باسم Supernatant Number 2 (SN2). قم بتخزينه عند -80 درجة مئوية لتحديد نقاء التجزئة (الشكل 3).
  21. أعد تعليق حبيبات الميتوكوندريا النهائية في 200 ميكرولتر من RB. ضع جانبا بسرعة 10 ميكرولتر لتحديد كمية البروتين وأضف على الفور 10 ميكرولتر من 10٪ FFA BSA إلى تعليق الميتوكوندريا المتبقي لمنع التلف.
  22. تحديد تركيز البروتين باستخدام فحص برادفورد.
    1. بالنسبة للمنحنى القياسي ، قم بإعداد 30 ميكرولتر من التخفيفات التسلسلية للتركيز المعروف للبروتين في المخزن المؤقت RB. على سبيل المثال، استخدم 1 ملغم/مل، 0.5 ملغم/مل، 0.25 ملغم/مل، 0.125 ملغم/مل، 0.0625 ملغم/مل، و0 ملغم/مل من BSA.
    2. قم بإعداد التخفيفات التسلسلية 1:3 و 1:6 لعينات الميتوكوندريا في المخزن المؤقت RB.
    3. في لوحة ذات قاع مسطح من 96 بئرا ، قم أولا بتحميل 2.5 ميكرولتر من العينة / المعيار لكل بئر. بعد ذلك ، أضف 10 ميكرولتر من 1 M NaOH إلى كل عينة ، وأخيرا ، 200 ميكرولتر من كاشف برادفورد 1x. تخلط جيدا ، وتجنب فقاعات الهواء. تحقق بصريا من أن لون العينات يقع ضمن خط المعايرة. قم دائما بإجراء التحليل في ثلاثة أضعاف.
    4. احتضن الصفائح لمدة 5 دقائق في RT في الظلام ، واقرأ الامتصاص عند 595 نانومتر في مقياس الطيف الضوئي للصفائح الدقيقة.
    5. احسب المنحنى القياسي عن طريق رسم قيم الامتصاص (المحور y) مقابل تركيز البروتين المقابل للتخفيفات المحضرة في الخطوة 22.1 في هذا القسم (المحور x).
    6. احسب الكمية الإجمالية للبروتين في عينات الميتوكوندريا عن طريق الاستقراء باستخدام المنحنى القياسي.

3. إعداد المقايسات التنفسية القائمة على الصفائح الدقيقة

  1. قم بترطيب مستشعر المقايسة التنفسية قبل 12 ساعة على الأقل من التجربة باستخدام 1 مل من المخزن المؤقت للمعايرة لكل بئر. احتضان في 37 درجة مئوية (لا CO2).
    ملاحظة: يمكن استخدام المستشعرات المائية لمدة تصل إلى 72 ساعة. يجب التعامل مع الخرطوشة بعناية أثناء هذه الخطوة: إذا لمس أي شيء أجهزة الاستشعار ، فقد تتأثر حساسية القياس.
  2. قم بتبريد جهاز الطرد المركزي التحضيري مسبقا باستخدام دوار الجرافة المتأرجحة ومحولات الألواح الدقيقة المقابلة عند 4 درجات مئوية.
  3. قم بتشغيل الكمبيوتر وافتح برنامج التحليل وحدد البروتوكول المطلوب.
    ملاحظة: يتم سماع نقرة واحدة عند اتصال البرنامج بأداة قياس استهلاك الأكسجين. يجب أن يكون مستشعر التسخين أخضر وعند 37 درجة مئوية قبل بدء التجربة.
  4. قم بإعداد المحاليل المثبطة من المخزونات المشار إليها في القسم 1 ، الخطوة 2 وفقا للفحص الذي سيتم إجراؤه. قم بإعداد حجم كاف لكل حل. انظر الجدول 1 والجدول 2 للرجوع إليهما.
  5. أضف الحجم المناسب لكل مثبط في كل منفذ، وأدخل الخرطوشة في أداة قياس استهلاك الأكسجين، وابدأ المعايرة.
    ملاحظة: تستغرق إضافة مثبط إلى الخرطوشة وإدخال الخرطوشة في الجهاز من 15 إلى 20 دقيقة. تأكد من إدخال مكونات الخرطوشة الصحيحة. يمكن التخلص من غطاء الخرطوشة والداعم المائي أثناء الحاجة إلى خرطوشة المستشعر ومكان المرافق.
  6. جهاز الطرد المركزي تعليق الميتوكوندريا المركز للقسم 2 ، الخطوة 21 عند 10500 × جم لمدة 10 دقائق عند 4 درجات مئوية.
  7. أعد تعليق حبيبات الميتوكوندريا في 100 ميكرولتر من 1x CAM + BSA أو 1x EFAM + BSA أو 1x BOXM + BSA ، اعتمادا على البروتوكول الذي سيتم تنفيذه.
  8. قم بمزيد من التخفيف من عينة الميتوكوندريا المركزة إلى تركيز نهائي قدره 0.2 ميكروغرام / ميكرولتر في وسط الفحص المقابل.
  9. بذور 50 ميكرولتر من التعليق (إجمالي 10 ميكروغرام من البروتين) لكل بئر في صفيحة صغيرة مبردة مسبقا من 24 بئرا على الجليد. لا تضيف الميتوكوندريا في آبار تصحيح الخلفية ؛ أضف فقط وسيط الفحص المقابل. قم بتخزين تعليق الميتوكوندريا المتبقي عند -80 درجة مئوية لتحديد نقاء التجزئة (الشكل 3).
  10. قم بتدوير الصفيحة الدقيقة في جهاز الطرد المركزي التحضيري المبرد مسبقا عند 2000 × جم لمدة 20 دقيقة عند 4 درجات مئوية. ثقل الموازنة لتحقيق التوازن وفقا لذلك.
  11. قم بتسخين وسط الفحص المتبقي عند 37 درجة مئوية أثناء الطرد المركزي للصفائح الدقيقة.
  12. بعد الطرد المركزي ، اترك الصفيحة الدقيقة على المقعد لمدة 5 دقائق لتحقيق التوازن. أضف 450 ميكرولتر من وسط الفحص الدافئ للحصول على حجم نهائي قدره 500 ميكرولتر لكل بئر في RT. قم بذلك ببطء وبعناية ، مع إضافة الوسط إلى جدار الآبار لتجنب فصل الميتوكوندريا.
  13. ضع الصفيحة الدقيقة على الفور في أداة قياس استهلاك الأكسجين بدون غطاء ، وابدأ تشغيل البروتوكول (الجدول 3). تأكد من أن الخطوة الأولى هي حضانة لمدة 10 دقائق للسماح للصفيحة الدقيقة بالتدفئة.
  14. بمجرد الانتهاء من التجربة ، قم بإزالة الخرطوشة واللوحة الدقيقة ، وقم بإيقاف تشغيل الجهاز ، وابدأ التحليل.

4. تحليل النتائج

  1. في حالة فحوصات CA و BOX، قم بإجراء التحليلات التالية:
    1. سجل استهلاك O2 غير الميتوكوندريا ، والذي يتوافق مع متوسط القيم التي تم الحصول عليها بعد حقن Antimycin A و rotenone.
      ملاحظة: أنتيمايسين A وروتينون مثبطات معقدة III و I ، على التوالي.
    2. احسب التنفس القاعدي عن طريق طرح استهلاك O2 غير الميتوكوندريا من القيم القاعدية (نقطتا القياس 1 و 2).
    3. اطرح استهلاك O2 غير الميتوكوندريا من القيم بعد حقن الركيزة المعقدة V ADP (الحقن A) لتحديد حالة الميتوكوندريا III.
    4. اطرح استهلاك O2 غير الميتوكوندريا من قيم التنفس بعد حقن مثبط V المعقد oligomycin (الحقن B) للحصول على حالة الميتوكوندريا IVo.
    5. احسب حالة الميتوكوندريا IIIu عن طريق خصم استهلاك O2 غير الميتوكوندريا من التنفس بعد حقن FCCP (الحقن C).
      ملاحظة: FCCP هو مفسفرة مؤكسدة قوية للميتوكوندريا. يتم تجاوز توليف ATP في وجوده ، ويحقق ETC أقصى قدر من النشاط.
    6. اطرح قيم التنفس القاعدية من قيم حالة الميتوكوندريا IIIu للحصول على سعة احتياطية للميتوكوندريا ، وهي القدرة على توليد ATP إضافي في حالة زيادة الطلب على الطاقة.
    7. قسم حالة الميتوكوندريا IIIu على قيم الحالة IVo للحصول على نسبة التحكم في الجهاز التنفسي (RCR).
      ملاحظة: تشير قيم RCR السالبة أو الخالية إلى تأثر اقتران الميتوكوندريا.
  2. بالإشارة إلى EFA ، قم بإجراء الحسابات التالية:
    1. الحصول على النشاط المتبقي عن طريق حساب متوسط القيمة بعد حقن الروتينون و Antimycin A (الحقن A و C).
    2. احسب النشاط المعقد من الأول إلى الرابع (CI-CIIV) عن طريق طرح النشاط المتبقي من القيم القاعدية (نقطتا القياس 1 و2).
    3. اطرح النشاط المتبقي من القيم بعد حقن سكسينات الركيزة CII (الحقن B) للحصول على نشاط CII-CIII-CIV.
    4. احسب نشاط CIV عن طريق خصم النشاط المتبقي من القيم التي تم الحصول عليها بعد حقن عوامل تقليل السيتوكروم c وحمض الأسكوربيك و TMPD (الحقن D).
  3. تمثيل جميع النتائج باستخدام مخططات الشريط، كما في الشكل 4، لاستخراج الاستنتاجات المناسبة.

النتائج

يسمح البروتوكول المقدم هنا بالتحليل الحي للتنفس الميتوكوندريا من خلال عزل الميتوكوندريا عن العضلات الهيكلية للفأر. ويرد في الشكل 1 مخطط تفصيلي لهذه الطريقة. بعد تشريح العضلات الهيكلية من الأطراف الخلفية (الشكل 2) ، يتم تجانس الأنسجة وتنقية الميتوكوند?...

Discussion

جميع الطرق المستخدمة لدراسة التنفس الميتوكوندريا لها حدودها. وبالتالي ، من الأهمية بمكان اختيار الطريقة التي تناسب سؤالا تجريبيا محددا. يوفر هذا العمل بروتوكولا محدثا ومفصلا لعزل الميتوكوندريا عن العضلات الهيكلية للفأر لإجراء فحوصات تنفسية مختلفة للتحقيق في وظيفة الميتوكوندريا. والوا?...

Disclosures

ويعلن صاحبا البلاغ أنه ليس لديهما تضارب في المصالح للإفصاح عنه.

Acknowledgements

ونود أن نشكر خوان ج. تينا على استخدام المجانس ومرافق البروتينات وتربية الحيوانات التابعة ل CABD للحصول على الدعم التقني. تم دعم هذا العمل من قبل وزارة التعليم والثقافة والرياضة الإسبانية من خلال زمالة FPU16/03264 إلى J.D.H.C. ، والرابطة الفرنسية لمكافحة اعتلال العضلات (AFM) من خلال منحة الزمالة رقم 22450 إلى C.V.-G. ، ومنحة مؤسسية MDM-2016-0687 (وحدة Maria de Maeztu Excellence ، قسم تنظيم الجينات وتكوين المورفوجينيا في CABD) و BFU2017-83150-P إلى J.J.C. منحة المجلس العسكري في الأندلس P18-RT-4572 ، وبرنامج تمويل FEDER من الاتحاد الأوروبي ، ووزارة العلوم والابتكار والجامعات الإسبانية تمنح RED2018-102576-T إلى P.N.

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
ADPSigmaA5285Stock at -20 °C
AKT antibodyCell Signaling TechnologyC67E7Rabbit (Host species)
anti-Goat HRPSigma401504Rabbit (Host species)
anti-Mouse HRPCell Signaling#7076Horse (Host species)
Antimycin ASigmaA8674Stock at -20 °C
anti-Rabbit HRPCell Signaling#7074Goat (Host species)
Ascorbic acidSigmaA5960Stock at RT
Bactin antibodySigmaMBS4-48085Goat (Host species)
Bio-Rad Protein Assay Kit IIBio-Rad5000002It includes 5x Bradford reagent and BSA of known concentration for the standard curve
BSA, fraction V, Fatty Acid-FreeCalbiochem126575Stock at 4 °C
C tubeMiltenyi Biotec130-093-237Purple lid
Calnexin antibodyThermoFisherMA3-027Mouse (Host species)
D-mannitolSigmaM4125Stock at RT
EDTABDH280254DStock at 4 °C
EGTASigmaE-4378Stock at RT
FCCPSigmaC2920Stock at -20 °C
gentleMACS DissociatorMiltenyi Biotec130-093-235Homogenizer
HEPESSigmaH3375Stock at RT
HSP70 antibodyProteintech10995-1-APRabbit (Host species)
LDH-A antibodySanta Cruz BiotechnologySC27230Goat (Host species)
Magnesium chlorideChemCruzsc-255260AStock at RT
Malic acidSigmaP1645Stock at RT
Microplate spectrophotometerBMG LABTECH GmbHPOLARstar OMEGA S/N 415-0292Stock at RT
Milli-Q waterMillipore systemF7HA17757AUltrapure water
mtTFA antibodySanta Cruz BiotechnologySC23588Goat (Host species)
Na+/K+-ATPase α1 antibodyNovus BiologicalsNB300-14755Mouse (Host species)
OligomycinSigmaO4876Stock at -20 °C
Palmitoyl-L-carnitineSigmaP1645Stock at -20 °C
PBS tabletsSigmaP4417-100TAB1x stock at RT
Potassium dihydrogen phosphateChemCruzsc-203211Stock at RT
Potassium hydroxideSigma60377Stock at RT
Pyruvic acidSigma107360Stock at 4 °C
RotenoneSigmaR8875Stock at -20 °C
Seahorse XF24 mitochondrial flux analyzerAgilent Technologies420179XFe24 model
Seahorse XFe24 FluxPak miniAgilent Technologies102342-100The kit includes cartridges, microplates, and calibrant solution
SuccinateSigmaS7626Stock at RT
SucroseSigmaS9378Stock at RT
TIMM23 antibodyAbcamab230253Rabbit (Host species)
TMPDSigmaT7394Stock at -20 °C
TOMM20 antibodyAbcamab56783Mouse (Host species)
VDAC antibodyAbcamab15895Rabbit (Host species)

References

  1. Spinelli, J. B., Haigis, M. C. The multifaceted contributions of mitochondria to cellular metabolism. Nature Cell Biology. 20 (7), 745-754 (2018).
  2. Alberts, B., et al. The mitochondrion. Molecular Biology of the Cell, 4th edition. , (2002).
  3. Turunen, M., Olsson, J., Dallner, G. Metabolism and function of coenzyme Q. Biochimica et Biophysica Acta. 1660 (1-2), 171-199 (2004).
  4. Alcázar-Fabra, M., Trevisson, E., Brea-Calvo, G. Clinical syndromes associated with coenzyme Q10 deficiency. Essays in Biochemistry. 62 (3), 377-398 (2018).
  5. Banerjee, R., Purhonen, J., Kallijärvi, J. The mitochondrial coenzyme Q junction and complex III: biochemistry and pathophysiology. The FEBS Journal. , (2021).
  6. Gorman, G. S., et al. Mitochondrial diseases. Nature Reviews. Disease Primers. 2, 16080 (2016).
  7. Villalba, J. M., Navas, P. Regulation of coenzyme Q biosynthesis pathway in eukaryotes. Free Radical Biology & Medicine. 165, 312-323 (2021).
  8. Li, Z., Graham, B. H. Measurement of mitochondrial oxygen consumption using a Clark electrode. Methods in Molecular Biology. 837, 63-72 (2012).
  9. Rogers, G. W., et al. High throughput microplate respiratory measurements using minimal quantities of isolated mitochondria. PloS One. 6 (7), 21746 (2011).
  10. Pala, F., et al. Distinct metabolic states govern skeletal muscle stem cell fates during prenatal and postnatal myogenesis. Journal of Cell Science. 131 (14), 212977 (2018).
  11. Shintaku, J., et al. MyoD regulates skeletal muscle oxidative metabolism cooperatively with alternative NF-ĸB. Cell Reports. 17 (2), 514-526 (2016).
  12. Li, R., et al. Development of a high-throughput method for real-time assessment of cellular metabolism in intact long skeletal muscle fibre bundles. The Journal of Physiology. 594 (24), 7197-7213 (2016).
  13. Schuh, R. A., Jackson, K. C., Khairallah, R. J., Ward, C. W., Spangenburg, E. E. Measuring mitochondrial respiration in intact single muscle fibers. American Journal of Physiology. Regulatory, Integrative and Comparative Physiology. 302 (6), 712-719 (2012).
  14. Rosenblatt, J. D., Lunt, A. I., Parry, D. J., Partridge, T. A. Culturing satellite cells from living single muscle fiber explants. In Vitro Cellular & Developmental Biology. Animal. 31 (10), 773-779 (1995).
  15. Keire, P., Shearer, A., Shefer, G., Yablonka-Reuveni, Z. Isolation and culture of skeletal muscle myofibers as a means to analyze satellite cells. Methods in Molecular Biology. 946, 431-468 (2013).
  16. Shintaku, J., Guttridge, D. C. Analysis of aerobic respiration in intact skeletal muscle tissue by microplate-based respirometry. Methods in Molecular Biology. 1460, 337-343 (2016).
  17. Bharadwaj, M. S., et al. Preparation and respirometric assessment of mitochondria isolated from skeletal muscle tissue obtained by percutaneous needle biopsy. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (96), e52350 (2015).
  18. Garcia-Cazarin, M. L., Snider, N. N., Andrade, F. H. Mitochondrial isolation from skeletal muscle. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (49), e2452 (2011).
  19. Iuso, A., Repp, B., Biagosch, C., Terrile, C., Prokisch, H. Assessing mitochondrial bioenergetics in isolated mitochondria from various mouse tissues using Seahorse XF96 analyzer. Methods in Molecular Biology. 1567, 217-230 (2017).
  20. Divakaruni, A. S., Rogers, G. W., Murphy, A. N. Measuring mitochondrial function in permeabilized cells using the Seahorse XF analyzer or a Clark-type oxygen electrode. Current Protocols in Toxicology. 60, 1-16 (2014).
  21. Das, K. C., Muniyappa, H. Age-dependent mitochondrial energy dynamics in the mice heart: role of superoxide dismutase-2. Experimental Gerontology. 48 (9), 947-959 (2013).
  22. Aw, W. C., Bajracharya, R., Towarnicki, S. G., Ballard, J. W. O. Assessing bioenergetic functions from isolated mitochondria in Drosophila melanogaster. Journal of Biological Methods. 3 (2), 42 (2016).
  23. Sakamuri, S. S. V. P., et al. Measurement of respiratory function in isolated cardiac mitochondria using Seahorse XFe24 analyzer: applications for aging research. Gerontology. 40 (3), 347-356 (2018).
  24. Boutagy, N. E., Pyne, E., Rogers, G. W., Ali, M., Hulver, M. W., Frisard, M. I. Isolation of mitochondria from minimal quantities of mouse skeletal muscle for high throughput microplate respiratory measurements. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (105), e53217 (2015).
  25. Sperling, J. A., et al. Measuring respiration in isolated murine brain mitochondria: implications for mechanistic stroke studies. Neuromolecular Medicine. 21 (4), 493-504 (2019).
  26. Boutagy, N. E., Rogers, G. W., Pyne, E. S., Ali, M. M., Hulver, M. W., Frisard, M. I. Using isolated mitochondria from minimal quantities of mouse skeletal muscle for high throughput microplate respiratory measurements. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (105), e53216 (2015).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

180

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved