Выделение митохондрий из скелетных мышц мыши для респирометрических анализов

Резюме

Здесь мы описываем подробный метод выделения митохондрий из скелетных мышц мыши и последующий анализ дыхания по скорости потребления кислорода (OCR) с использованием респирометрических анализов на основе микропластин. Этот конвейер может быть применен для изучения влияния многочисленных экологических или генетических вмешательств на митохондриальный метаболизм.

Аннотация

Большая часть энергии клетки получается за счет деградации глюкозы, жирных кислот и аминокислот различными путями, которые сходятся в системе митохондриального окислительного фосфорилирования (OXPHOS), которая регулируется в ответ на клеточные потребности. Липидная молекула коэнзима Q (CoQ) имеет важное значение в этом процессе путем переноса электронов в комплекс III в цепи переноса электронов (ETC) через постоянные циклы окисления / восстановления. Статус митохондрий и, в конечном счете, здоровье клеток можно оценить, измеряя потребление кислорода внеземными цивилизациями с использованием респирометрических анализов. Эти исследования обычно проводятся в установленных или первичных клеточных линиях, которые культивировались в течение нескольких дней. В обоих случаях полученные параметры дыхания могли отклоняться от нормальных физиологических условий в любом данном органе или ткани.

Кроме того, внутренние характеристики культивируемых одиночных волокон, выделенных из скелетных мышц, препятствуют этому типу анализа. В данной работе представлен обновленный и подробный протокол анализа дыхания в свежеизолированных митохондриях скелетных мышц мыши. Мы также предоставляем решения потенциальных проблем, которые могут возникнуть на любом этапе процесса. Метод, представленный здесь, может быть применен для сравнения показателей потребления кислорода в различных трансгенных моделях мышей и изучения митохондриального ответа на медикаментозное лечение или другие факторы, такие как старение или пол. Это возможный метод ответа на важнейшие вопросы о метаболизме и регуляции митохондриальной биоэнергетики.

Введение

Митохондрии являются первичными метаболическими органеллами в ^{клетке1}. Эти специализированные мембранно-закрытые органеллы используют молекулы питательных веществ для производства энергии в виде аденозинтрифосфата (АТФ) OXPHOS. Этот процесс основан на переносе электронов от донорских молекул в серии окислительно-восстановительных реакций в ^ETC2. CoQ является единственным окислительно-активным липидом, который эндогенно вырабатывается во всех клеточных мембранах и циркулирующих липопротеинах, которые проявляют антиоксидантную ^{функцию3}. Это важный компонент ETC, передающий электроны из NADH-зависимого комплекса I и _{FADH2-зависимого} комплекса II в комплекс III, хотя многие другие редуктазы могут стимулировать восстановление митохондриального CoQ до убихинола в качестве обязательного шага в нескольких клеточных метаболических путях4,5.

На протяжении всего процесса через внутреннюю мембрану митохондрий создается электрохимический протонный градиент, который преобразуется в биологически активную энергию комплексом АТФ-синтазы ^V2. Следовательно, митохондриальная дисфункция приводит к множеству патологических состояний, в основном затрагивающих ткани с высокими энергетическими потребностями - мозг, сердце и скелетные ^{мышцы6,7}. Поэтому крайне важно разработать методы точного анализа митохондриальной биоэнергетики для изучения ее роли в здоровье и болезнях, особенно в высокоэнергетических тканях, таких как скелетные мышцы.

Кислородный электрод типа Кларка был классически использован при изучении митохондриального ^{дыхания8}. Однако эта система постепенно вытесняется технологиями с более высоким разрешением, причем особенно популярны технологии потребления кислорода на основе микропластин, такие как анализаторы Agilent Seahorse ^XF9. В области скелетных мышц эти исследования обычно проводятся в культивируемых клетках, главным образом в увековеченной клеточной линии миобластов C2C12 или первичных культурах, полученных из клеток-сателлитов10,11. Тем не менее, эти исследования не полностью повторяют ситуацию in vivo, особенно при изучении митохондриальной биологии и функционирования на тканевом уровне при конкретных нарушениях, негенетических вмешательствах или генетических манипуляциях.

Кроме того, анализ дыхания в клетках является более сложным из-за дополнительных факторов, включая внемитохондриальную потребность в АТФ и субстратах анализа или сигнальные события, которые могут ввести в заблуждение интерпретацию результатов. В качестве альтернативы также возможно использование одиночных или пучков свежеизолированных миофиберов из мышц. Тем не менее, метод изоляции технически сложен и осуществим только для нескольких типов мышц. В этом случае в основном используются мышцы сгибателя digitorum brevis (FDB) и разгибателя digitorum longus (EDL^)10,12,13, хотя в нескольких отчетах также описывается использование других типов ^{мышц14,15}.

Также сообщалось о биоэнергетическом профилировании участков скелетных ^мышц16. Основным преимуществом этого метода является то, что интактные мышцы могут быть изучены (авторы показывают, что нарезка через волокна не нарушает результаты по сравнению с изолированными миофибрами). Однако митохондриальный доступ к субстратам и ингибиторам анализа ограничен, и, таким образом, можно измерить лишь несколько ^{параметров16}. Наконец, изолированные митохондрии также могут быть использованы9,17,18,19. В этом случае митохондрии теряют цитозольную среду, что может повлиять на их функцию. Напротив, этот метод гарантирует доступ к субстратам и ингибиторам, позволяет анализировать множество типов образцов и, как правило, требует меньше материала.

В данной работе описан метод выполнения биоэнергетического профилирования изолированных митохондрий из скелетных мышц мыши с использованием респирометрических анализов на основе микропластин (рисунок 1). В частности, подробно описаны три протокола: Анализ связи, CA для оценки степени связи между ETC и механизмом OXPHOS; Анализ потока электронов, EFA для измерения активности отдельных комплексов внеземных цивилизаций; и анализ BOX для определения митохондриальной β окислительной способности. Примечательно, что требуется только небольшое количество образцов по сравнению с обычными методами респирометрии. Используемый здесь протокол изоляции был изменен по сравнению с методом, опубликованным в другом ^месте18.

протокол

Сбор у мышей и тканей был выполнен с использованием протоколов, одобренных Комитетом по этике Universidad Pablo de Olavide (Севилья, Испания; протоколы 24/04/2018/056 и 12/03/2021/033) в соответствии с Испанским королевским указом 53/2013, Европейской директивой 2010/63/EU и другими соответствующими руководящими принципами.

1. Подготовка запасов, буферов и реагентов для дыхательных анализов

1. Подготовьте следующие складские растворы, которые можно хранить при указанной температуре месяцами. Используйте сверхчистый _H2O во всех случаях.
   1. Растворите таблетки фосфат-буферного физиологического раствора (PBS) в _H2O (1 таблетка на 200 мл _H2O) для приготовления 1x PBS. Автоклавируйте раствор и храните его при комнатной температуре (RT).
   2. Растворите 2 г гранул NaOH в 50 мл _H2O для получения 1 M NaOH.
   3. Подготовьте запасы 0,1 М, 1 М, 5 М и 10 М КОН для калибровки рН.
   4. Добавьте 14,612 г ЭДТА к 70 мл _H2O. Добавьте гранулы NaOH до тех пор, пока рН не достигнет 8,0, чтобы ЭДТА полностью растворилась. Добавьте квантовый сатис _H2O (QS) к 100 мл. Автоклавируйте полученный раствор 0,5 М ЭДТА (рН 8) и храните его в РТ.
   5. Добавьте 19 г EGTA к 70 мл _H2O. Добавьте гранулы NaOH до тех пор, пока рН не достигнет 8,0, чтобы позволить EGTA полностью раствориться. Добавьте _H2O QS к 100 мл. Автоклавируйте полученный раствор 0,5 М ЭГТА (рН 8) и храните его в РТ.
   6. Добавьте 2 мл 0,5 М ЭДТА к 98 мл PBS. Храните полученный раствор 10 мМ ЭДТА/ПБС на RT.
   7. Растворите 5,958 г HEPES в 40 мл _H2O. Отрегулируйте рН до 7,2 с KOH и QS до 50 мл с _H2O. Отфильтруйте полученный буфер HEPES 0,5 М через сетку 0,45 мкм и сохраните его в RT.
   8. Растворить 3,402 г _KH2PO4 в 50 мл _H2O. Отфильтровать полученный 0,5 М раствор _KH2PO4 через сетку 0,45 мкм и сохранить его в RT.
   9. Растворить 9,521 г безводного _MgCl2 в 100 мл _H2O. Автоклав получившийся 1 M _MgCl2 раствор и хранить его в RT.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Поскольку это экзотермическая реакция, действуйте с осторожностью и растворяйте _MgCl2 на льду.
2. Готовят субстрат и исходные растворы ингибиторов (см. табл. 1). Aliquot и хранить их при -20 °C. Избегайте циклов замораживания-оттаивания. В качестве исключения всегда готовьте пировиноградную кислоту непосредственно перед употреблением.
   1. Препарат в сверхчистом _H2O: 0,5 М сукцината, 0,5 М пировиноградной кислоты, 0,5 М яблочной кислоты, 100 мМ АДФ, 1 М аскорбиновой кислоты и 50 мМ N,N,N',N'-тетраметил-пара-фенилен-диамин (TMPD) (защитить от света).
   2. Готовят в 100% диметилсульфоксиде (ДМСО): 50 мМ пальмитоил-L-карнитина, 4 мМ ротенона, 20 мМ карбонилцианида-п-трифторметоксифенилгидразона (FCCP), 4 мМ олигомицина и 5 мМ антимицина А.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Не превышать 0,1% конечной концентрации ДМСО в микропластинчатых скважинах. Поэтому подготовьте высококонцентрированные стоковые растворы, чтобы оставаться ниже этого предела.
3. Подготовьте буферы для выделения митохондрий и количественной оценки белка в день эксперимента. Используйте сверхчистый _H2O во всех случаях и держите все буферы на льду, если не указано иное.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Для экономии времени все реагенты можно взвешивать и хранить в соответствующих контейнерах (например, в пробирках по 15 мл) при правильной температуре в предыдущий день.
   1. Чтобы приготовить 10% свободные жирные кислоты (FFA) BSA, тщательно растворите 150 мг FFA BSA в 1,5 мл _H2O путем инверсии / вращения колеса. Не вихрь, чтобы избежать вспенивания.
   2. Чтобы приготовить 1-кратный реагент Брэдфорда, разбавьте 5-кратный коммерческий раствор _H2O и держите его в темноте в RT.
   3. Для приготовления 8x Mitochondria Buffer (MB) растворите 4,112 г сахарозы и 763 мг HEPES в 15 мл _H2O. Отрегулируйте рН до 7,2, добавьте 1,6 мл 10% FFA BSA и QS до 20 мл с _H2O.
   4. Чтобы приготовить 20 мл изоляционного буфера 1 (IB1) (4 мл, используемых на образец), растворите 400 мкл 0,5 М ЭДТА, 784 мг D-маннитола и 2,5 мл 8 мб в 15 мл _H2O. Отрегулируйте рН до 7,2 и QS с _H2O.
   5. Чтобы приготовить 5 мл изоляционного буфера 2 (IB2) (500 мкл на образец), растворите 30 мкл 0,5 M EGTA, 196 мг D-маннитола и 625 мкл 8x MB в 4 мл _H2O. Отрегулируйте pH до 7,2 и QS с _H2O.
   6. Чтобы приготовить 5 мл резуспенсионного буфера (RB) (200 мкл используется на образец), растворите 120 мг сахарозы, 191,3 мг D-маннита, 50 мкл 0,5 М HEPES и 10 мкл 0,5 М EGTA в 4 мл _H2O. Отрегулируйте рН до 7,2 и QS с _H2O.
   7. Для приготовления 2x mitochondrial Assay Solution-1 (MAS-1) растворяют 1,199 г сахарозы, 2,8 г маннитола, 1 мл 0,5 М _KH2PO4, 250 мкл 1 M _MgCl2, 200 мкл 0,5 М HEPES и 100 мкл 0,5 М ЭГТА в 20 мл _H2O. Отрегулируйте рН до 7,2 и QS до 25 мл с _H2O. Держите во льду в течение коротких периодов. В течение более длительных периодов времени держите его при 4 ° C, чтобы избежать осадков.
   8. Чтобы подготовить 1-кратную среду для анализа связи (CAM), подготовьте два различных буфера на основе MAS-1: 1) CAM + BSA для собственно анализа CA и 2) CAM-BSA для подготовки ингибиторов анализа. Всегда держите соотношение пируват:малат на уровне 10:1.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Поскольку BSA может засорять порты для инъекций, разбавьте ингибиторы в CAM без BSA.
      1. Для получения CAM+BSA разбавьте 300 мкл 0,5 М пировиноградной кислоты, 30 мкл 0,5 М яблочной кислоты и 7,5 мл 2x MAS-1 в 6 мл _H2O. Отрегулируйте рН до 7,2. Добавьте 300 мкл 10% FFA BSA и QS к 15 мл с _H2O.
      2. Для получения CAM-BSA разбавьте 120 мкл 0,5 М пировиноградной кислоты, 12 мкл 0,5 М яблочной кислоты и 3 мл 2x MAS-1 в 2 мл _H2O. Отрегулируйте рН до 7,2 и QS до 6 мл с _H2O.
   9. Чтобы подготовить 1 среду для анализа потока электронов (EFAM), подготовьте буферы EFAM, содержащие BSA, и буферы EFAM без BSA.
      1. Для приготовления EFAM+BSA разбавьте 300 мкл 0,5 М пировиноградной кислоты, 60 мкл 0,5 М яблочной кислоты, 3 мкл 20 мМ FCCP и 7,5 мл 2x MAS-1 в 6 мл _H2O. Отрегулируйте рН до 7,2. Добавьте 300 мкл 10% FFA BSA и QS к 15 мл с _H2O.
      2. Для получения EFAM-BSA разводят 120 мкл 0,5 М пировиноградной кислоты, 24 мкл 0,5 М яблочной кислоты, 1,2 мкл 20 мМ FCCP и 3 мл 2x MAS-1 в 2 мл _H2O. Отрегулируйте рН до 7,2 и QS до 6 мл с _H2O.
   10. Для приготовления 1x β среды окисления (BOXM) готовят растворы BOXM, содержащие BSA и BSA.
       1. Для приготовления BOXM+BSA разбавьте 12 мкл 50 мМ пальмитоил-L-карнитина, 30 мкл 0,5 М яблочной кислоты и 7,5 мл 2x MAS-1 в 7 мл _H2O. Отрегулируйте рН до 7,2. Добавьте 300 мкл 10% FFA BSA и QS к 15 мл с _H2O.
       2. Для приготовления BOXM-BSA разводят 4,8 мкл 50 мМ пальмитоил-L-карнитина, 12 мкл 0,5 М яблочной кислоты и 3 мл 2x MAS-1 в 2 мл _H2O. Отрегулируйте рН до 7,2 и QS до 6 мл с _H2O.

2. Рассечение мышц, гомогенизация и изоляция митохондрий

1. Поместите все материалы и буферы на лед. Убедитесь, что все материалы холодные в течение всей процедуры, чтобы защитить митохондрии от повреждений.
2. Поместите на лед три стакана по 50 мл на образец и добавьте следующие растворы: 10 мл PBS в стакан 1, 10 мл 10 мМ EDTA/PBS в стакан 2 и 4 мл IB1 в стакан 3.
3. Усыпляют мышь при вывихе шейки матки. Избегайте эвтаназии _CO2 , так как скелетные мышцы могут стать гипоксическими, мешая анализу дыхания.
4. Распылите на правую заднюю налимку 70% этанола, чтобы предотвратить выпадение меха, и приклейте конечность к пробковой рассеченной доске. Заклейте и левую переднюю конечность.
5. Сделайте разрез стерильным одноразовым скальпелем через кожу с колена до ног.
6. Обхватите кожу зубчатыми щипцами на уровне лодыжки и разрежьте ее тонкими ножницами вокруг лодыжки.
7. Освободите кожу от подлежащей мускулатуры с помощью пинцета тонкого наконечника в одной руке, одновременно подтягивая ее зубчатыми щипцами в другой руке.
8. Рассекните все скелетные мышцы от лодыжки до колена (рисунок 2).
   1. Удалите всю соединительную ткань над передней (ТА) мышцей большеберцовой кости, чтобы облегчить извлечение мышц с помощью тонкого пинцета и ножниц.
   2. Найдите четыре дистальных сухожилия мышцы EDL и разделите их близко к их вставкам в пальцах ног. Найдите дистальное сухожилие ТА и обрежьте его близко к его вставке, всегда ниже лодыжки.
   3. Осторожно потяните сухожилия TA и EDL выше лодыжки, чтобы освободить свободные концы.
   4. Захватите свободные концы сухожилий и облегчите мышцы от остальной мускулатуры и костей, подтягивая их вверх. Используйте тонкий пинцет или ножницы, чтобы облегчить процесс. Действуйте осторожно, чтобы избежать сокращения миофибры.
   5. Отрежьте проксимальное сухожилие EDL и мышцу TA как можно ближе к коленной чашечке.
   6. Переверните мышь вверх дном, чтобы продолжить извлечение икроножной мышцы (ГА) и камбалы.
   7. Захват кармана, образовавшегося между бицепсом бедра и ГА зубчатыми щипцами. Используйте тонкие ножницы, чтобы отделить эти мышцы и визуализировать проксимальное сухожилие GA.
   8. Захватите ахиллово сухожилие тонкими щипцами и аккуратно разрежьте его мелкими ножницами. Освободите ГА и камбаловидные мышцы от подлежащей кости, подтянув их вверх через сухожилия. Отрежьте проксимальное сухожилие ГА, освободив его вместе с подстилающей камбалой.
   9. Тщательно рассекайте оставшиеся мышцы от сухожилия к сухожилию после той же процедуры, пока не останутся только кости.
   10. Повторно закрепите мышь в исходном положении, чтобы рассекнуть четырехглавую мышцу.
   11. Отбросьте жировую ткань поверх квадрицепсов на проксимальной стороне с помощью зубчатых щипцов и мелких ножниц.
   12. Вставьте тонкий пинцет между квадрицепсами и бедренной костью и переместите их в обоих направлениях вдоль оси бедренной кости, чтобы отделить мышцу от кости.
   13. Захватите дистальные четырехглавые мышечные сухожилия зубчатыми щипцами и разрежьте сухожилие тонкими ножницами как можно ближе к коленной чашечке.
   14. Потяните квадрицепсы вверх и освободите его при проксимальном введении тонкими ножницами.
9. Повторите шаги 4–8 из этого раздела с левой задней конечностью.
10. Сначала промойте все мышцы в Стакане 1, а затем в Стакане 2.
11. Переведите все мышцы на Стакан 3 и тонко измельчите все мышцы острыми ножницами на льду.
12. Переложите суспензию в трубку C (фиолетовую крышку), всегда держа ее во льду.
13. Плотно закройте трубку C и прикрепите ее вверх ногами к втулке гомогенизатора. Убедитесь, что образец материала находится в области ротатора/статора. Выберите 1-минутную программу под названием m_mito_tissue_01.
14. Разделите гомогенат на две предварительно охлажденные микроцентрифужные трубки по 2 мл и центрифугу по 700 × г в течение 10 мин при 4 °C в настольной центрифуге.
15. Переносите супернатанты в новые предварительно охлажденные трубки по 2 мл, тщательно избегая жира и негомогенизированных тканей. Храните гранулы при -80 °C для определения чистоты фрагментации (фракция N) (рисунок 3).
16. Центрифугировать супернатанты при 10 500 × г в течение 10 мин при 4 °C.
17. Перенесите супернатанты в новые предварительно охлажденные трубки объемом 2 мл и пометьте их как супернатант No 1 (SN1). Храните их при температуре -80 °C для определения чистоты фрагментации (рисунок 3).
18. Повторно суспендировать и соединить обе гранулы в общем объеме 500 мкл IB2 во льду.
19. Центрифуга при 10 500 × г в течение 10 мин при 4°C.
20. Перенесите супернатант в новую предварительно охлажденную трубку объемом 2 мл и пометьте его как Супернатант No 2 (SN2). Храните его при температуре -80 °C для определения чистоты фрагментации (рисунок 3).
21. Повторное суспендирование конечной митохондриальной гранулы в 200 мкл RB. Быстро отложите 10 мкл для количественной оценки белка и немедленно добавьте 10 мкл 10% FFA BSA к оставшейся митохондриальной суспензии, чтобы предотвратить повреждение.
22. Определите концентрацию белка с помощью анализа Брэдфорда.
    1. Для стандартной кривой готовят 30 мкл последовательных разведений известной концентрации белка в rb-буфере. Например, используйте 1 мг/мл, 0,5 мг/мл, 0,25 мг/мл, 0,125 мг/мл, 0,0625 мг/мл и 0 мг/мл BSA.
    2. Подготовьте последовательные разведения митохондриальных образцов 1:3 и 1:6 в буфере RB.
    3. В плите с плоским дном из 96 скважин первая загрузка 2,5 мкл образца/стандарт на скважину. Затем добавьте 10 мкл 1 M NaOH к каждому образцу и, наконец, 200 мкл 1x реагента Брэдфорда. Хорошо перемешать, избегая пузырьков воздуха. Визуально проверьте, что цвет образцов находится в пределах калибровочной линии. Всегда выполняйте анализ в трех экземплярах.
    4. Инкубируют пластины в течение 5 мин при RT в темноте и считывают поглощение при 595 нм в микропластинчатом спектрофотометре.
    5. Рассчитайте стандартную кривую, построив график значений поглощения (ось Y) по отношению к соответствующей концентрации белка в разведениях, полученных на этапе 22.1 в этом разделе (ось X).
    6. Рассчитайте общее количество белка в митохондриальных образцах путем экстраполяции со стандартной кривой.

3. Подготовка респирометрических анализов на основе микропластин

1. Гидратируют респирометрический датчик не менее чем за 12 ч до начала эксперимента с 1 мл калибровочного буфера на лунку. Инкубировать при 37 °C (без _CO2).
   ПРИМЕЧАНИЕ: Гидратированные датчики можно использовать до 72 ч. С картриджем следует обращаться осторожно на этом этапе: если что-то касается датчиков, это может повлиять на чувствительность измерения.
2. Предварительно оградите подготовительную центрифугу с качающимся ротором микропластины ковша и соответствующими микропластинчатыми адаптерами при 4 °C.
3. Включите компьютер, откройте программное обеспечение для анализа и выберите нужный протокол.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Щелчок слышен, когда программное обеспечение подключается к прибору для измерения потребления кислорода. Датчик нагрева должен быть зеленым и при 37 °C до начала эксперимента.
4. Готовят растворы ингибиторов из запасов, указанных в разделе 1, этап 2, в соответствии с анализом, который необходимо провести. Подготовьте достаточный объем для каждого раствора. Для справки см. таблицу 1 и таблицу 2 .
5. Добавьте соответствующий объем каждого ингибитора в каждый порт, вставьте картридж в прибор для измерения расхода кислорода и начните калибровку.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Добавление ингибитора в картридж и вставка картриджа в прибор занимает 15-20 мин. Убедитесь, что введены правильные компоненты картриджа. Крышка картриджа и гидроусилитель могут быть выброшены, в то время как картридж датчика и место утилиты необходимы.
6. Центрифугируют концентрированной митохондриальной суспензией секции 2, стадия 21 при 10 500 × г в течение 10 мин при 4°С.
7. Повторное суспендирование митохондриальной гранулы в 100 мкл 1x CAM+BSA, 1x EFAM+BSA или 1x BOXM+BSA, в зависимости от протокола, который будет выполнен.
8. Далее разбавляют концентрированный митохондриальный образец до конечной концентрации 0,2 мкг/мкл в соответствующей пробирной среде.
9. Посейте 50 мкл суспензии (всего 10 мкг белка) на лунку в предварительно охлажденную 24-луночную микропластину на льду. Не добавляйте митохондрии в фон коррекционных колодцев; только добавьте соответствующую среду анализа. Хранить оставшуюся митохондриальную суспензию при -80 °C для определения чистоты фрагментации (рисунок 3).
10. Раскрутите микропластинку в предварительно охлажденной препаративной центрифуге при 2000 × г в течение 20 мин при 4 °C. Противовес для баланса соответственно.
11. Нагрейте оставшуюся пробирную среду при 37 °C во время центрифугирования микропластин.
12. После центрифугирования оставьте микропластинку на скамейке на 5 минут, чтобы уравновесить. Добавьте 450 мкл теплой пробирной среды для конечного объема 500 мкл на скважину на РТ. Делайте это медленно и осторожно, добавляя среду к стенке колодца, чтобы избежать отсоединения митохондрий.
13. Поместите микропластинку немедленно в прибор для измерения расхода кислорода без крышки и запустите протокол (таблица 3). Убедитесь, что первым шагом является 10-минутная инкубация, чтобы позволить микропластине нагреться.
14. Как только эксперимент будет завершен, извлеките картридж и микропластинку, выключите прибор и начните анализ.

4. Анализ результатов

1. В случае анализов CA и BOX выполните следующие анализы:
   1. Регистрируют потребление немитохондриального _О2 , которое соответствует среднему значению, полученному после инъекции Антимицина А и ротенона.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Антимицин А и ротенон являются комплексными ингибиторами III и I соответственно.
   2. Рассчитать базальное дыхание путем вычитания немитохондриального потребления _O2 из базальных значений (точки измерения 1 и 2).
   3. Вычтите потребление немитохондриального _O2 из значений после инъекции комплекса V субстрата АДФ (инъекция А) для определения митохондриального состояния III.
   4. Вычтите потребление немитохондриального _O2 из значений дыхания после инъекции комплексного ингибитора V олигомицина (инъекция B) для получения митохондриального состояния IVo.
   5. Рассчитать митохондриальное состояние IIIu путем вычета немитохондриального потребления _O2 из дыхания после инъекции FCCP (инъекция C).
      ПРИМЕЧАНИЕ: FCCP является мощным митохондриальным окислительным разъединителем фосфорилирования. Синтез АТФ обходится в его присутствии, и внеземные цивилизации достигают максимальной активности.
   6. Вычтите значения базального дыхания из значений IIIu митохондриального состояния для получения митохондриальной резервной емкости, которая представляет собой способность генерировать дополнительный АТФ в случае повышенной потребности в энергии.
   7. Разделите митохондриальное состояние IIIu на значения состояния IVo для получения коэффициента управления дыханием (RCR).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Отрицательные или нулевые значения RCR указывают на то, что митохондриальная связь затронута.
2. В отношении EFA выполните следующие расчеты:
   1. Получение остаточной активности путем расчета среднего значения после введения ротенона и антимицина А (инъекции А и С).
   2. Рассчитать комплексную активность I-IV (CI-CIV) путем вычитания остаточной активности из базальных значений (точки измерения 1 и 2).
   3. Вычтите остаточную активность из значений после инъекции сукцината субстрата CII (инъекция B) для получения активности CII-CIII-CIV.
   4. Рассчитать активность CIV путем вычета остаточной активности из значений, полученных после инъекции цитохром-с-восстановителей, аскорбиновой кислоты и TMPD (инъекция D).
3. Представьте все результаты с помощью гистограмм, как показано на рисунке 4, для извлечения соответствующих выводов.

Результаты

Протокол, представленный здесь, позволяет анализировать in vivo митохондриальное дыхание путем выделения митохондрий из скелетных мышц мыши. Схема метода показана на рисунке 1. После рассечения скелетных мышц от задних конечностей (рисунок 2) ткани го?...

Обсуждение

Все методы, используемые для изучения митохондриального дыхания, имеют свои ограничения; следовательно, крайне важно выбрать метод, который наилучшим образом соответствует конкретному экспериментальному вопросу. Эта работа предоставляет обновленный и подробный протокол для изоляци...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
ADP	Sigma	A5285	Stock at -20 °C
AKT antibody	Cell Signaling Technology	C67E7	Rabbit (Host species)
anti-Goat HRP	Sigma	401504	Rabbit (Host species)
anti-Mouse HRP	Cell Signaling	#7076	Horse (Host species)
Antimycin A	Sigma	A8674	Stock at -20 °C
anti-Rabbit HRP	Cell Signaling	#7074	Goat (Host species)
Ascorbic acid	Sigma	A5960	Stock at RT
Bactin antibody	Sigma	MBS4-48085	Goat (Host species)
Bio-Rad Protein Assay Kit II	Bio-Rad	5000002	It includes 5x Bradford reagent and BSA of known concentration for the standard curve
BSA, fraction V, Fatty Acid-Free	Calbiochem	126575	Stock at 4 °C
C tube	Miltenyi Biotec	130-093-237	Purple lid
Calnexin antibody	ThermoFisher	MA3-027	Mouse (Host species)
D-mannitol	Sigma	M4125	Stock at RT
EDTA	BDH	280254D	Stock at 4 °C
EGTA	Sigma	E-4378	Stock at RT
FCCP	Sigma	C2920	Stock at -20 °C
gentleMACS Dissociator	Miltenyi Biotec	130-093-235	Homogenizer
HEPES	Sigma	H3375	Stock at RT
HSP70 antibody	Proteintech	10995-1-AP	Rabbit (Host species)
LDH-A antibody	Santa Cruz Biotechnology	SC27230	Goat (Host species)
Magnesium chloride	ChemCruz	sc-255260A	Stock at RT
Malic acid	Sigma	P1645	Stock at RT
Microplate spectrophotometer	BMG LABTECH GmbH	POLARstar OMEGA S/N 415-0292	Stock at RT
Milli-Q water	Millipore system	F7HA17757A	Ultrapure water
mtTFA antibody	Santa Cruz Biotechnology	SC23588	Goat (Host species)
Na+/K+-ATPase α1 antibody	Novus Biologicals	NB300-14755	Mouse (Host species)
Oligomycin	Sigma	O4876	Stock at -20 °C
Palmitoyl-L-carnitine	Sigma	P1645	Stock at -20 °C
PBS tablets	Sigma	P4417-100TAB	1x stock at RT
Potassium dihydrogen phosphate	ChemCruz	sc-203211	Stock at RT
Potassium hydroxide	Sigma	60377	Stock at RT
Pyruvic acid	Sigma	107360	Stock at 4 °C
Rotenone	Sigma	R8875	Stock at -20 °C
Seahorse XF24 mitochondrial flux analyzer	Agilent Technologies	420179	XFe24 model
Seahorse XFe24 FluxPak mini	Agilent Technologies	102342-100	The kit includes cartridges, microplates, and calibrant solution
Succinate	Sigma	S7626	Stock at RT
Sucrose	Sigma	S9378	Stock at RT
TIMM23 antibody	Abcam	ab230253	Rabbit (Host species)
TMPD	Sigma	T7394	Stock at -20 °C
TOMM20 antibody	Abcam	ab56783	Mouse (Host species)
VDAC antibody	Abcam	ab15895	Rabbit (Host species)