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In diesem Artikel

  • Zusammenfassung
  • Zusammenfassung
  • Einleitung
  • Protokoll
  • Ergebnisse
  • Diskussion
  • Offenlegungen
  • Danksagungen
  • Materialien
  • Referenzen
  • Nachdrucke und Genehmigungen

Zusammenfassung

Hier beschreiben wir eine detaillierte Methode zur Isolierung der Mitochondrien aus der Skelettmuskulatur der Maus und die anschließende Analyse der Atmung mittels Oxygen Consumption Rate (OCR) unter Verwendung von mikroplattenbasierten respirometrischen Assays. Diese Pipeline kann angewendet werden, um die Auswirkungen mehrerer umweltbedingter oder genetischer Eingriffe auf den mitochondrialen Stoffwechsel zu untersuchen.

Zusammenfassung

Der größte Teil der Energie der Zelle wird durch den Abbau von Glukose, Fettsäuren und Aminosäuren über verschiedene Wege gewonnen, die auf dem mitochondrialen oxidativen Phosphorylierungssystem (OXPHOS) zusammenlaufen, das als Reaktion auf zelluläre Anforderungen reguliert wird. Das Lipidmolekül Coenzym Q (CoQ) ist in diesem Prozess essentiell, indem es Elektronen durch konstante Oxidations- / Reduktionszyklen in den Komplex III in der Elektronentransportkette (ETC) überträgt. Der Zustand der Mitochondrien und letztendlich die Zellgesundheit können durch Messung des ETC-Sauerstoffverbrauchs mithilfe von respirometrischen Assays beurteilt werden. Diese Studien werden typischerweise in etablierten oder primären Zelllinien durchgeführt, die mehrere Tage lang kultiviert wurden. In beiden Fällen können die erhaltenen Atmungsparameter von den normalen physiologischen Bedingungen in einem bestimmten Organ oder Gewebe abgewichen sein.

Darüber hinaus behindern die intrinsischen Eigenschaften von kultivierten Einzelfasern, die aus der Skelettmuskulatur isoliert wurden, diese Art der Analyse. Dieses Papier stellt ein aktualisiertes und detailliertes Protokoll für die Analyse der Atmung in frisch isolierten Mitochondrien aus der Skelettmuskulatur der Maus vor. Wir bieten auch Lösungen für potenzielle Probleme, die in jedem Schritt des Prozesses auftreten können. Die hier vorgestellte Methode könnte angewendet werden, um Sauerstoffverbrauchsraten in verschiedenen transgenen Mausmodellen zu vergleichen und die mitochondriale Reaktion auf medikamentöse Behandlungen oder andere Faktoren wie Altern oder Geschlecht zu untersuchen. Dies ist eine praktikable Methode, um auf entscheidende Fragen zum mitochondrialen bioenergetischen Stoffwechsel und zur Regulation zu antworten.

Einleitung

Mitochondrien sind die primären Stoffwechselorganellen in der Zelle1. Diese spezialisierten membranumschlossenen Organellen verwenden Nährstoffmoleküle, um Energie in Form von Adenosintriphosphat (ATP) von OXPHOS zu erzeugen. Dieser Prozess beruht auf dem Transfer von Elektronen aus Donormolekülen in einer Reihe von Redoxreaktionen im ETC2. CoQ ist das einzige redoxaktive Lipid, das endogen in allen Zellmembranen und zirkulierenden Lipoproteinen produziert wird und eine antioxidative Funktion zeigt3. Es ist ein wesentlicher Bestandteil des ETC und überträgt Elektronen vom NADH-abhängigen Komplex I und FADH2-abhängigen Komplex II auf den Komplex III, obwohl viele andere Reduktasen die Reduktion von mitochondrialem CoQ zu Ubiquinol als obligatorischen Schritt in mehreren zellulären Stoffwechselwegen vorantreiben können4,5.

Während des gesamten Prozesses wird ein elektrochemischer Protonengradient über die mitochondriale innere Membran erzeugt, der durch den ATP-Synthasekomplex V2 in biologisch aktive Energie umgewandelt wird. Folglich führt die mitochondriale Dysfunktion zu einer Vielzahl von pathologischen Zuständen, die hauptsächlich Gewebe mit hohem Energiebedarf betreffen - Gehirn, Herz und Skelettmuskulatur6,7. Daher ist es von grundlegender Bedeutung, Methoden zur genauen Analyse der mitochondrialen Bioenergetik zu entwickeln, um ihre Rolle bei Gesundheit und Krankheit zu untersuchen, insbesondere in hochenergetischen Geweben wie der Skelettmuskulatur.

Die Clark-Sauerstoffelektrode wurde klassischerweise bei der Untersuchung der mitochondrialen Atmung8 verwendet. Dieses System wurde jedoch zunehmend durch Technologien mit höherer Auflösung ersetzt, wobei mikroplattenbasierte Sauerstoffverbrauchstechnologien wie Agilent Seahorse XF-Analysatoren besonders beliebt sind9. Im Bereich der Skelettmuskulatur werden diese Studien typischerweise in kultivierten Zellen durchgeführt, hauptsächlich in der C2C12-immortalisierten Maus-Myoblasten-Zelllinie oder Primärkulturen, die von Satellitenzellen abgeleitet wurden10,11. Diese Studien rekapitulieren die Situation jedoch nicht vollständig in vivo, insbesondere bei der Untersuchung der mitochondrialen Biologie und der Funktion auf Gewebeebene bei spezifischen Beleidigungen, nichtgenetischen Eingriffen oder genetischen Manipulationen.

Darüber hinaus sind die Atmungstests in Zellen aufgrund zusätzlicher Faktoren komplexer, einschließlich des extramitochondrialen Bedarfs an ATP- und Assay-Substraten oder Signalereignissen, die die Interpretation der Ergebnisse in die Irre führen könnten. Alternativ ist es auch möglich, einzelne oder Bündel von frisch isolierten Myofasern aus Muskeln zu verwenden. Die Isolationsmethode ist jedoch technisch anspruchsvoll und nur für wenige Muskeltypen machbar. In diesem Fall werden hauptsächlich die Muskeln Flexor digitorum brevis (FDB) und Extensor digitorum longus (EDL) verwendet10,12,13, obwohl einige Berichte auch die Verwendung anderer Muskeltypen beschreiben14,15.

Eine bioenergetische Profilierung von Skelettmuskelabschnitten wurde ebenfalls berichtet16. Der Hauptvorteil dieser Methode besteht darin, dass intakte Muskeln untersucht werden können (die Autoren zeigen, dass das Durchschneiden von Fasern die Ergebnisse im Vergleich zu isolierten Myofasern nicht stört). Der mitochondriale Zugang zu Substraten und Assay-Inhibitoren ist jedoch begrenzt, so dass nur wenige Parameter gemessen werden können16. Schließlich können auch isolierte Mitochondrien eingesetzt werden9,17,18,19. In diesem Fall verlieren Mitochondrien ihre zytosolische Umgebung, was ihre Funktion beeinträchtigen könnte. Im Gegensatz dazu garantiert diese Methode den Zugang zu Substraten und Inhibitoren, ermöglicht die Analyse einer Vielzahl von Probentypen und benötigt typischerweise weniger Material.

Dieses Papier beschreibt eine Methode zur Durchführung der bioenergetischen Profilierung von isolierten Mitochondrien aus der Skelettmuskulatur der Maus unter Verwendung von mikroplattenbasierten respirometrischen Assays (Abbildung 1). Insbesondere werden drei Protokolle detailliert beschrieben: der Coupling Assay, CA zur Beurteilung des Grades der Kopplung zwischen der ETC- und der OXPHOS-Maschine; der Elektronenfluss-Assay, EFA zur Messung der Aktivität der einzelnen ETC-Komplexe; und der BOX-Assay zur Bestimmung der mitochondrialen β-Oxidationskapazität. Bemerkenswert ist, dass im Vergleich zu herkömmlichen Methoden der Respirometrie nur geringe Mengen an Proben benötigt werden. Das hier verwendete Isolationsprotokoll wurde gegenüber der an anderer Stelle veröffentlichten Methode geändert18.

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Protokoll

Mausgehäuse und Gewebeentnahme wurden unter Verwendung von Protokollen durchgeführt, die von der Ethikkommission der Universidad Pablo de Olavide (Sevilla, Spanien; Protokolle 24/04/2018/056 und 12/03/2021/033) in Übereinstimmung mit dem spanischen Königlichen Dekret 53/2013, der europäischen Richtlinie 2010/63/EU und anderen relevanten Richtlinien genehmigt wurden.

1. Vorbereitung von Beständen, Puffern und Reagenzien für die Atmungstests

  1. Bereiten Sie die folgenden Lagerlösungen vor, die monatelang bei der angegebenen Temperatur gelagert werden können. Verwenden Sie in allen Fällen hochreines H2O.
    1. Lösen Sie phosphatgepufferte Kochsalzlösung (PBS) Tabletten in H2O (1 Tablette pro 200 ml H2O) auf, um 1x PBS herzustellen. Autoklavieren Sie die Lösung und lagern Sie sie bei Raumtemperatur (RT).
    2. Lösen Sie 2 g NaOH-Pellets in 50 ml H2O auf, um 1 M NaOH herzustellen.
    3. Bereiten Sie 0,1 M, 1 M, 5 M und 10 M KOH-Bestände für die pH-Kalibrierung vor.
    4. 14,612 g EDTA zu 70 ml H2O hinzufügen. NaOH-Pellets hinzufügen, bis der pH-Wert 8,0 erreicht, so dass sich EDTA vollständig auflöst. H2O quantum satis (QS) zu 100 ml hinzufügen. Autoklavieren Sie die resultierende 0,5 M EDTA (pH 8) Lösung und lagern Sie sie bei RT.
    5. Fügen Sie 19 g EGTA zu 70 ml H2O hinzu. Fügen Sie NaOH-Pellets hinzu, bis der pH-Wert 8,0 erreicht, damit sich die EGTA vollständig auflösen kann. H2O QS zu 100 ml hinzufügen. Autoklavieren Sie die resultierende 0,5 M EGTA (pH 8) Lösung und lagern Sie sie bei RT.
    6. Fügen Sie 2 ml 0,5 m EDTA zu 98 ml PBS hinzu. Speichern Sie die resultierende 10 mM EDTA/PBS-Lösung bei RT.
    7. 5,958 g HEPES in 40 mL H2O auflösen. Stellen Sie den pH-Wert auf 7,2 mit KOH und QS auf 50 ml mit H2O ein. Filtern Sie den resultierenden 0,5 M HEPES-Puffer durch ein 0,45-μm-Netz und lagern Sie ihn bei RT.
    8. 3,402 g KH2PO4 in bis zu 50 ml H2O lösen. Filtern Sie die resultierende 0,5 M KH2PO4-Lösung durch ein 0,45 μm-Netz und lagern Sie sie bei RT.
    9. 9.521 g wasserfreies MgCl2 in bis zu 100 mL H2O auflösen. Autoklavieren Sie die resultierende 1 M MgCl2-Lösung und lagern Sie sie bei RT.
      HINWEIS: Da es sich um eine exotherme Reaktion handelt, gehen Sie vorsichtig vor und lösen Sie das MgCl2 auf Eis auf.
  2. Herstellung von Substrat- und Inhibitor-Stammlösungen (siehe Tabelle 1). Aliquot und lagern Sie sie bei -20 °C. Vermeiden Sie Frost-Tau-Zyklen. Bereiten Sie ausnahmsweise Brenztraubensäure immer unmittelbar vor der Anwendung vor.
    1. Herstellen in ultrareinem H2O: 0,5 M Succinat, 0,5 M Brenztraubensäure, 0,5 M Apfelsäure, 100 mM ADP, 1 M Ascorbinsäure und 50 mM N,N,N′,N′-Tetramethyl-para-phenylen-diamin (TMPD) (vor Licht schützen).
    2. Herstellen in 100% Dimethylsulfoxid (DMSO): 50 mM Palmitoyl-L-Carnitin, 4 mM Rotenon, 20 mM Carbonylcyanid-p-trifluormethoxyphenylhydrazon (FCCP), 4 mM Oligomycin und 5 mM Antimycin A.
      HINWEIS: Überschreiten Sie nicht 0,1% End-DMSO-Konzentration in den Mikrotiterplattenvertiefungen. Bereiten Sie daher hochkonzentrierte Lagerlösungen vor, um unter diesem Grenzwert zu bleiben.
  3. Bereiten Sie die Puffer für die Isolierung der Mitochondrien und die Proteinquantifizierung am Tag des Experiments frisch vor. Verwenden Sie in allen Fällen hochreines H2O und bewahren Sie alle Puffer auf Eis auf, sofern nicht anders angegeben.
    HINWEIS: Um Zeit zu sparen, können alle Reagenzien gewogen und in den entsprechenden Behältern (z. B. 15-ml-Röhrchen) bei der richtigen Temperatur am Vortag aufbewahrt werden.
    1. Um 10% freie Fettsäuren (FFA) BSA herzustellen, lösen Sie 150 mg FFA BSA gründlich in 1,5 ml H2O durch Inversion / Drehrad auf. Wirbeln Sie nicht, um Schaumbildung zu vermeiden.
    2. Um 1x Bradford-Reagenz herzustellen, verdünnen Sie die 5x kommerzielle Lagerlösung mit H2O und halten Sie sie bei RT im Dunkeln.
    3. Um 8x Mitochondria Buffer (MB) herzustellen, lösen Sie 4,112 g Saccharose und 763 mg HEPES in 15 ml H2O auf. Stellen Sie den pH-Wert auf 7,2 ein, fügen Sie 1,6 ml 10% FFA BSA und QS zu 20 ml mit H2O hinzu.
    4. Zur Herstellung von 20 ml Isolationspuffer 1 (IB1) (4 ml pro Probe) werden 400 μL 0,5 m EDTA, 784 mg D-Mannit und 2,5 ml 8x MB in 15 ml H2O gelöst. Stellen Sie den pH-Wert auf 7,2 und QS mit H2O ein.
    5. Zur Herstellung von 5 ml Isolationspuffer 2 (IB2) (500 μL pro Probe) werden 30 μL 0,5 M EGTA, 196 mg D-Mannit und 625 μL 8x MB in 4 mL H2O gelöst. Stellen Sie den pH-Wert auf 7,2 und QS mit H2O ein.
    6. Zur Herstellung von 5 ml Resuspension Buffer (RB) (200 μL pro Probe) werden 120 mg Saccharose, 191,3 mg D-Mannitol, 50 μL 0,5 M HEPES und 10 μL 0,5 M EGTA in 4 mL H2O gelöst. Stellen Sie den pH-Wert auf 7,2 und QS mit H2O ein.
    7. Zur Herstellung von 2x Mitochondrial Assay Solution-1 (MAS-1) werden 1,199 g Saccharose, 2,8 g Mannitol, 1 ml 0,5 M KH2PO4, 250 μL 1 M MgCl2, 200 μL 0,5 M HEPES und 100 μL 0,5 M EGTA in 20 mL H2O gelöst. Stellen Sie den pH-Wert auf 7,2 und QS auf 25 ml mit H2O ein. Halten Sie es für längere Zeit bei 4 ° C, um Niederschläge zu vermeiden.
    8. Um 1x Coupling Assay Medium (CAM) vorzubereiten, bereiten Sie zwei verschiedene MAS-1-basierte Puffer vor: 1) CAM+BSA für den eigentlichen CA-Assay und 2) CAM-BSA für die Vorbereitung der Assay-Inhibitoren. Halten Sie das Pyruvat:Malat-Verhältnis immer bei 10:1.
      HINWEIS: Da BSA die Injektionsanschlüsse verstopfen kann, verdünnen Sie die Inhibitoren in BSA-freiem CAM.
      1. Zur Herstellung von CAM+BSA werden 300 μL 0,5 M Brenztraubensäure, 30 μL 0,5 M Apfelsäure und 7,5 ml 2x MAS-1 in 6 mL H2O verdünnt. Stellen Sie den pH-Wert auf 7,2 ein. Fügen Sie 300 μL von 10% FFA BSA und QS zu 15 ml mit H2O hinzu.
      2. Zur Herstellung von CAM-BSA werden 120 μL 0,5 M Brenztraubensäure, 12 μL 0,5 M Apfelsäure und 3 ml 2x MAS-1 in 2 mL H2O verdünnt. Stellen Sie den pH-Wert mit H2O auf 7,2 und QS auf 6 ml ein.
    9. Um 1x Electron Flow Assay Medium (EFAM) herzustellen, bereiten Sie sowohl BSA-haltige als auch BSA-freie EFAM-Puffer vor.
      1. Zur Herstellung von EFAM+BSA werden 300 μL 0,5 M Brenztraubensäure, 60 μL 0,5 M Apfelsäure, 3 μL 20 mM FCCP und 7,5 ml 2x MAS-1 in 6 mL H2O verdünnt. Stellen Sie den pH-Wert auf 7,2 ein. Fügen Sie 300 μL von 10% FFA BSA und QS zu 15 ml mit H2O hinzu.
      2. Zur Herstellung von EFAM-BSA werden 120 μL 0,5 M Brenztraubensäure, 24 μL 0,5 M Apfelsäure, 1,2 μL 20 mM FCCP und 3 ml 2x MAS-1 in 2 mL H2O verdünnt. Stellen Sie den pH-Wert mit H2O auf 7,2 und QS auf 6 ml ein.
    10. Zur Herstellung von 1x β-Oxidationsmedium (BOXM) stellen Sie BSA-haltige und BSA-freie BOXM-Lösungen her.
      1. Zur Herstellung von BOXM+BSA werden 12 μL 50 mM Palmitoyl-L-Carnitin, 30 μL 0,5 M Apfelsäure und 7,5 ml 2x MAS-1 in 7 mL H2O verdünnt. Stellen Sie den pH-Wert auf 7,2 ein. Fügen Sie 300 μL von 10% FFA BSA und QS zu 15 ml mit H2O hinzu.
      2. Zur Herstellung von BOXM-BSA werden 4,8 μL 50 mM Palmitoyl-L-Carnitin, 12 μL 0,5 M Apfelsäure und 3 ml 2x MAS-1 in 2 mL H2O verdünnt. Stellen Sie den pH-Wert auf 7,2 und QS auf 6 ml mit H2O ein.

2. Muskeldissektion, Homogenisierung und mitochondriale Isolierung

  1. Alle Materialien und Puffer auf Eis legen. Stellen Sie sicher, dass alle Materialien während des gesamten Verfahrens eiskalt sind, um die Mitochondrien vor Schäden zu schützen.
  2. Legen Sie drei 50-ml-Bechergläser pro Probe auf Eis und fügen Sie die folgenden Lösungen hinzu: 10 ml PBS in Becherglas 1, 10 ml 10 mM EDTA/PBS in Becherglas 2 und 4 ml IB1 in Becherglas 3.
  3. Euthanasieren Sie die Maus durch Zervixdislokation. Vermeiden Sie CO2-Euthanasie, da die Skelettmuskulatur hypoxisch werden und die Atmungsanalysen beeinträchtigen könnte.
  4. Besprühen Sie das rechte Hinterbein mit 70% Ethanol, um zu verhindern, dass Fell abfällt, und kleben Sie das Glied auf die Kork-Dissektionsplatte. Kleben Sie auch das linke Vorderbein ab.
  5. Machen Sie einen Schnitt mit einem sterilen Einwegskalpell durch die Haut vom Knie bis zu den Zehen.
  6. Greifen Sie die Haut mit einer gezähnten Pinzette auf Knöchelhöhe und schneiden Sie sie mit einer feinen Schere um den Knöchel.
  7. Erleichtern Sie die Haut von der darunter liegenden Muskulatur mit einer Pinzette mit feiner Spitze in der einen Hand, während Sie sie mit einer gezähnten Pinzette in der anderen Hand hochziehen.
  8. Sezieren Sie alle Skelettmuskeln vom Knöchel bis zum Knie (Abbildung 2).
    1. Entfernen Sie das gesamte Bindegewebe über dem Musculus tibialis anterior (TA), um die Muskelextraktion mit einer feinen Pinzette und einer Schere zu erleichtern.
    2. Finden Sie die vier distalen Sehnen des EDL-Muskels und schneiden Sie sie in der Nähe ihrer Insertionen in die Zehen. Suchen Sie die distale TA-Sehne und schneiden Sie sie in der Nähe ihres Einsetzens, immer unterhalb des Knöchels.
    3. Ziehen Sie vorsichtig die TA- und EDL-Sehnen über den Knöchel, um die losen Enden zu befreien.
    4. Greifen Sie die losen Enden der Sehnen und entspannen Sie die Muskeln vom Rest der Muskulatur und der Knochen, indem Sie sie hochziehen. Verwenden Sie eine feine Pinzette oder eine Schere, um den Prozess zu erleichtern. Gehen Sie vorsichtig vor, um eine Myofaserkontraktion zu vermeiden.
    5. Schneiden Sie die proximale Sehne der EDL und den TA-Muskel so nah wie möglich an der Kniescheibe ab.
    6. Drehen Sie die Maus auf den Kopf, um mit der Extraktion von Gastrocnemius (GA) und Soleusmuskeln fortzufahren.
    7. Greifen Sie die zwischen dem Bizeps femoris und der GA gebildete Tasche mit einer Zahnzange. Verwenden Sie eine feine Schere, um diese Muskeln zu trennen und die proximale GA-Sehne zu visualisieren.
    8. Greifen Sie die Achillessehne mit einer feinen Pinzette und schneiden Sie sie vorsichtig mit einer feinen Schere. Lösen Sie die GA- und Soleusmuskeln aus dem darunter liegenden Knochen, indem Sie sie durch ihre Sehnen nach oben ziehen. Schneiden Sie die proximale GA-Sehne ab und befreien Sie sie zusammen mit dem darunter liegenden Soleus.
    9. Sezieren Sie vorsichtig die verbleibenden Muskeln von Sehne zu Sehne nach dem gleichen Verfahren, bis nur noch Knochen übrig sind.
    10. Heften Sie die Maus in der Ausgangsposition erneut an, um den Quadrizepsmuskel zu sezieren.
    11. Entsorgen Sie das Fettgewebe über dem Quadrizeps an der proximalen Seite mit einer gezähnten Pinzette und einer feinen Schere.
    12. Führen Sie eine feine Pinzette zwischen den Quadrizeps und den Femur ein und bewegen Sie sie in beide Richtungen entlang der Femurachse, um den Muskel vom Knochen zu trennen.
    13. Greifen Sie die distalen Quadrizeps-Muskelsehnen mit einer gezähnten Pinzette und schneiden Sie die Sehne mit einer feinen Schere so nah wie möglich an der Kniescheibe ab.
    14. Ziehen Sie den Quadrizeps nach oben und befreien Sie ihn am proximalen Einsetzen mit einer feinen Schere.
  9. Wiederholen Sie die Schritte 4 bis 8 aus diesem Abschnitt mit dem linken Hinterbein.
  10. Spülen Sie alle Muskeln zuerst in Becherglas 1 und dann in Becherglas 2.
  11. Übertragen Sie alle Muskeln auf Becher 3 und hacken Sie alle Muskeln mit einer scharfen Schere auf dem Eis fein ab.
  12. Übertragen Sie die Aufhängung auf ein C-Rohr (violetter Deckel) und halten Sie es immer in Eis.
  13. Schließen Sie das C-Rohr fest und befestigen Sie es kopfüber an der Hülse des Homogenisators. Stellen Sie sicher, dass sich das Probenmaterial im Bereich des Rotators/Stators befindet. Wählen Sie das 1-minütige Programm m_mito_tissue_01 aus.
  14. Teilen Sie das Homogenat in zwei 2 ml vorgekühlte Mikrozentrifugenröhrchen und zentrifugieren Sie bei 700 × g für 10 min bei 4 °C in einer Tischzentrifuge.
  15. Übertragen Sie die Überstände auf neue vorgekühlte 2-ml-Schläuche und vermeiden Sie vorsichtig Fett und nicht homogenisiertes Gewebe. Lagern Sie die Pellets bei -80 °C zur Bestimmung der Reinheit der Fragmentierung (Fraktion N) (Abbildung 3).
  16. Die Überstände bei 10.500 × g zentrifugieren für 10 min bei 4 °C.
  17. Übertragen Sie die Überstände auf neue 2 ml vorgekühlte Röhrchen und kennzeichnen Sie sie als Überstand Nummer 1 (SN1). Lagern Sie sie bei -80 °C, um die Reinheit der Fragmentierung zu bestimmen (Abbildung 3).
  18. Resuspendieren und kombinieren Sie beide Pellets in einem Gesamtvolumen von 500 μL IB2 in Eis.
  19. Zentrifuge bei 10.500 × g für 10 min bei 4°C.
  20. Überführen Sie den Überstand in ein neues 2 ml vorgekühltes Röhrchen und kennzeichnen Sie es als Überstand Nummer 2 (SN2). Lagern Sie es bei -80 °C, um die Reinheit der Fragmentierung zu bestimmen (Abbildung 3).
  21. Resuspendiert das letzte mitochondriale Pellet in 200 μL RB. Stellen Sie schnell 10 μL für die Proteinquantifizierung beiseite und fügen Sie sofort 10 μL 10% FFA BSA zu der verbleibenden mitochondrialen Suspension hinzu, um Schäden zu vermeiden.
  22. Bestimmen Sie die Proteinkonzentration mit dem Bradford-Assay.
    1. Für die Standardkurve bereiten Sie 30 μL serielle Verdünnungen der bekannten Konzentration eines Proteins im RB-Puffer vor. Verwenden Sie beispielsweise 1 mg / ml, 0,5 mg / ml, 0,25 mg / ml, 0,125 mg / ml, 0,0625 mg / ml und 0 mg / ml BSA.
    2. Bereiten Sie serielle 1:3- und 1:6-Verdünnungen der mitochondrialen Proben im RB-Puffer vor.
    3. In einer 96-Well-Flat-Bottom-Platte laden Sie zuerst 2,5 μL Probe/Standard pro Well. Als nächstes fügen Sie jeder Probe 10 μL 1 M NaOH und schließlich 200 μL 1x Bradford-Reagenz hinzu. Gut mischen und Luftblasen vermeiden. Überprüfen Sie visuell, ob sich die Farbe der Proben innerhalb der Kalibrierungslinie befindet. Führen Sie die Analyse immer dreifach durch.
    4. Inkubieren Sie die Platten für 5 min bei RT im Dunkeln und lesen Sie die Absorption bei 595 nm in einem Mikroplatten-Spektralphotometer ab.
    5. Berechnen Sie die Standardkurve, indem Sie die Absorptionswerte (y-Achse) gegenüber der entsprechenden Proteinkonzentration der in Schritt 22.1 in diesem Abschnitt (x-Achse) hergestellten Verdünnungen aufzeichnen.
    6. Berechnen Sie die Gesamtmenge an Protein in den mitochondrialen Proben durch Extrapolation mit der Standardkurve.

3. Erstellung der mikrotiterplattenbasierten respirometrischen Assays

  1. Hydratisieren Sie den respirometrischen Assay-Sensor mindestens 12 Stunden vor dem Experiment mit 1 ml Kalibrierpuffer pro Bohrloch. Bei 37 °C (kein CO2) inkubieren.
    HINWEIS: Hydratisierte Sensoren können bis zu 72 h lang verwendet werden. Die Kartusche sollte in diesem Schritt vorsichtig gehandhabt werden: Wenn etwas die Sensoren berührt, könnte die Messempfindlichkeit beeinträchtigt werden.
  2. Die präparative Zentrifuge mit dem Schwenklöffel-Mikroplattenrotor und den entsprechenden Mikrotiterplattenadaptern bei 4 °C vorkühlen.
  3. Schalten Sie den Computer ein, öffnen Sie die Analysesoftware und wählen Sie das gewünschte Protokoll aus.
    HINWEIS: Ein Klicken ist zu hören, wenn die Software eine Verbindung zum Sauerstoffverbrauchsmessgerät herstellt. Der Heizsensor sollte grün und bei 37 °C sein, bevor das Experiment beginnt.
  4. Bereiten Sie die Inhibitorlösungen aus den in Abschnitt 1, Schritt 2 angegebenen Beständen gemäß dem durchzuführenden Assay vor. Bereiten Sie genügend Volumen für jede Lösung vor. Siehe Tabelle 1 und Tabelle 2 als Referenz.
  5. Fügen Sie das entsprechende Volumen jedes Inhibitors in jeden Anschluss hinzu, setzen Sie die Kartusche in das Sauerstoffverbrauchsmessgerät ein und beginnen Sie mit der Kalibrierung.
    HINWEIS: Das Hinzufügen von Inhibitor zur Kartusche und das Einsetzen der Patrone in das Instrument dauert 15-20 Minuten. Stellen Sie sicher, dass die richtigen Kartuschenkomponenten eingeführt werden. Der Patronendeckel und der Hydro-Booster könnten entsorgt werden, während die Sensorpatrone und der Platz des Dienstprogramms benötigt werden.
  6. Zentrifugieren Sie die konzentrierte mitochondriale Suspension von Abschnitt 2, Schritt 21 bei 10.500 × g für 10 min bei 4 °C.
  7. Resuspendiert das mitochondriale Pellet in 100 μL 1x CAM+BSA, 1x EFAM+BSA oder 1x BOXM+BSA, je nach durchzuführendem Protokoll.
  8. Die konzentrierte mitochondriale Probe wird im entsprechenden Assay-Medium weiter auf eine endgültige Konzentration von 0,2 μg/μL verdünnt.
  9. Samen Sie 50 μL der Suspension (insgesamt 10 μg Protein) pro Vertiefung in einer vorgekühlten 24-Well-Mikroplatte auf Eis. Fügen Sie keine Mitochondrien in den Hintergrundkorrekturbrunnen hinzu; Fügen Sie nur das entsprechende Assay-Medium hinzu. Lagern Sie die verbleibende mitochondriale Suspension bei -80 °C, um die Reinheit der Fragmentierung zu bestimmen (Abbildung 3).
  10. Drehen Sie die Mikrotiterplatte in der vorgekühlten präparativen Zentrifuge bei 2.000 × g für 20 min bei 4 °C. Gegengewicht, um entsprechend auszugleichen.
  11. Das verbleibende Assay-Medium wird während der Mikrotiterplattenzentrifugation bei 37 °C erwärmt.
  12. Lassen Sie die Mikrotiterplatte nach der Zentrifugation 5 Minuten auf der Bank, um sich auszugleichen. 450 μL warmes Assay-Medium für ein Endvolumen von 500 μL pro Bohrloch bei RT hinzufügen. Tun Sie dies langsam und vorsichtig, indem Sie das Medium an die Wand der Brunnen geben, um eine Ablösung der Mitochondrien zu vermeiden.
  13. Legen Sie die Mikroplatte sofort in das Sauerstoffverbrauchsmessgerät ohne Deckel und starten Sie das Protokoll (Tabelle 3). Stellen Sie sicher, dass der erste Schritt eine 10-minütige Inkubation ist, damit sich die Mikrotiterplatte erwärmen kann.
  14. Wenn das Experiment beendet ist, entfernen Sie die Kartusche und die Mikrotiterplatte, schalten Sie das Gerät aus und starten Sie die Analyse.

4. Analyse der Ergebnisse

  1. Führen Sie im Falle der CA- und BOX-Assays die folgenden Analysen durch:
    1. Erfassen Sie den nichtmitochondrialen O2-Verbrauch , der dem Mittelwert der Werte entspricht, die nach der Injektion von Antimycin A und Rotenon erhalten wurden.
      HINWEIS: Antimycin A und Rotenon sind komplexe III- bzw. I-Hemmer.
    2. Berechnen Sie die Basalatmung, indem Sie den nichtmitochondrialen O2-Verbrauch von den Basalwerten (Messpunkte 1 und 2) abziehen.
    3. Subtrahieren Sie den nichtmitochondrialen O2-Verbrauch von den Werten nach der Injektion des komplexen V-Substrats ADP (Injektion A), um den mitochondrialen Zustand III zu bestimmen.
    4. Subtrahieren Sie den nichtmitochondrialen O2-Verbrauch von den Atmungswerten nach der Injektion des komplexen V-Inhibitors Oligomycin (Injektion B), um den mitochondrialen Zustand IVo zu erhalten.
    5. Berechnen Sie den mitochondrialen Zustand IIIu, indem Sie den nichtmitochondrialen O2-Verbrauch von der Atmung nach der FCCP-Injektion (Injektion C) abziehen.
      HINWEIS: FCCP ist ein potenter mitochondrialer oxidativer Phosphorylierungsentkoppler. Die ATP-Synthese wird in ihrer Gegenwart umgangen, und das ETC erreicht maximale Aktivität.
    6. Subtrahieren Sie die basalen Atmungswerte von den IIIu-Werten des mitochondrialen Zustands, um die mitochondriale Reservekapazität zu erhalten, die die Fähigkeit zur Erzeugung von zusätzlichem ATP im Falle eines erhöhten Energiebedarfs darstellt.
    7. Teilen Sie den mitochondrialen Zustand IIIu durch die Werte des Zustands IVo, um das Atemkontrollverhältnis (RCR) zu erhalten.
      HINWEIS: Negative oder Null-RCR-Werte weisen darauf hin, dass die mitochondriale Kopplung betroffen ist.
  2. Führen Sie in Bezug auf die EFA die folgenden Berechnungen durch:
    1. Erhalten Sie die Restaktivität, indem Sie den Mittelwert nach der Rotenon- und Antimycin-A-Injektion (Injektionen A und C) berechnen.
    2. Berechnen Sie die Aktivität des Komplexes I bis IV (ci-civ), indem Sie die Restaktivität von den Basalwerten (Messpunkte 1 und 2) subtrahieren.
    3. Subtrahieren Sie die Restaktivität von den Werten nach der Injektion des CII-Substratsuccinats (Injektion B), um eine CII-CIII-CIV-Aktivität zu erhalten.
    4. Berechnen Sie die CIV-Aktivität, indem Sie die Restaktivität von den Werten abziehen, die nach der Injektion der Cytochrom-c-Reduktionsmittel, Ascorbinsäure und TMPD (Injektion D) erhalten werden.
  3. Stellen Sie alle Ergebnisse mithilfe von Balkendiagrammen dar, wie in Abbildung 4 dargestellt, um geeignete Schlussfolgerungen zu extrahieren.

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Ergebnisse

Das hier vorgestellte Protokoll ermöglicht die In-vivo-Analyse der mitochondrialen Atmung durch die Isolierung von Mitochondrien aus der Skelettmuskulatur der Maus. Ein Überblick über die Methode ist in Abbildung 1 dargestellt. Nach der Sezierung der Skelettmuskulatur von den Hinterbeinen (Abbildung 2) werden die Gewebe homogenisiert und die Mitochondrien unter isotonischen Bedingungen durch serielle Zentrifugationen gereinigt. Die Reinheit der versc...

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Diskussion

Alle Methoden, die zur Untersuchung der mitochondrialen Atmung verwendet werden, haben ihre Grenzen; Daher ist es entscheidend, die Methode auszuwählen, die am besten zu einer bestimmten experimentellen Fragestellung passt. Diese Arbeit bietet ein aktualisiertes und detailliertes Protokoll zur Isolierung von Mitochondrien aus der Skelettmuskulatur der Maus, um verschiedene Atemassays zur Untersuchung der mitochondrialen Funktion durchzuführen. Tatsächlich ist die Untersuchung der mitochondrialen Bioenergetik in isolie...

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Offenlegungen

Die Autoren erklären, dass sie keine Interessenkonflikte offenlegen müssen.

Danksagungen

Wir danken Juan J. Tena für den Einsatz des Homogenisators und der CABD Proteomics and Animal Husbandry Einrichtungen für die technische Unterstützung. Diese Arbeit wurde vom spanischen Ministerium für Bildung, Kultur und Sport durch ein Stipendium FPU16/03264 an J.D.H.C., die Association Française contre les Myopathies (AFM) durch Fellowship Grant #22450 an C.V.-G., ein Institutional Grant MDM-2016-0687 (Maria de Maeztu Excellence Unit, Department of Gene Regulation and Morphogenesis at CABD) und BFU2017-83150-P an J.J.C unterstützt. Der Junta de Andalucía-Zuschuss P18-RT-4572, das RENDER-Förderprogramm der Europäischen Union und das spanische Ministerium für Wissenschaft, Innovation und Universitäten gewähren RED2018-102576-T an P.N.

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Materialien

NameCompanyCatalog NumberComments
ADPSigmaA5285Stock at -20 °C
AKT antibodyCell Signaling TechnologyC67E7Rabbit (Host species)
anti-Goat HRPSigma401504Rabbit (Host species)
anti-Mouse HRPCell Signaling#7076Horse (Host species)
Antimycin ASigmaA8674Stock at -20 °C
anti-Rabbit HRPCell Signaling#7074Goat (Host species)
Ascorbic acidSigmaA5960Stock at RT
Bactin antibodySigmaMBS4-48085Goat (Host species)
Bio-Rad Protein Assay Kit IIBio-Rad5000002It includes 5x Bradford reagent and BSA of known concentration for the standard curve
BSA, fraction V, Fatty Acid-FreeCalbiochem126575Stock at 4 °C
C tubeMiltenyi Biotec130-093-237Purple lid
Calnexin antibodyThermoFisherMA3-027Mouse (Host species)
D-mannitolSigmaM4125Stock at RT
EDTABDH280254DStock at 4 °C
EGTASigmaE-4378Stock at RT
FCCPSigmaC2920Stock at -20 °C
gentleMACS DissociatorMiltenyi Biotec130-093-235Homogenizer
HEPESSigmaH3375Stock at RT
HSP70 antibodyProteintech10995-1-APRabbit (Host species)
LDH-A antibodySanta Cruz BiotechnologySC27230Goat (Host species)
Magnesium chlorideChemCruzsc-255260AStock at RT
Malic acidSigmaP1645Stock at RT
Microplate spectrophotometerBMG LABTECH GmbHPOLARstar OMEGA S/N 415-0292Stock at RT
Milli-Q waterMillipore systemF7HA17757AUltrapure water
mtTFA antibodySanta Cruz BiotechnologySC23588Goat (Host species)
Na+/K+-ATPase α1 antibodyNovus BiologicalsNB300-14755Mouse (Host species)
OligomycinSigmaO4876Stock at -20 °C
Palmitoyl-L-carnitineSigmaP1645Stock at -20 °C
PBS tabletsSigmaP4417-100TAB1x stock at RT
Potassium dihydrogen phosphateChemCruzsc-203211Stock at RT
Potassium hydroxideSigma60377Stock at RT
Pyruvic acidSigma107360Stock at 4 °C
RotenoneSigmaR8875Stock at -20 °C
Seahorse XF24 mitochondrial flux analyzerAgilent Technologies420179XFe24 model
Seahorse XFe24 FluxPak miniAgilent Technologies102342-100The kit includes cartridges, microplates, and calibrant solution
SuccinateSigmaS7626Stock at RT
SucroseSigmaS9378Stock at RT
TIMM23 antibodyAbcamab230253Rabbit (Host species)
TMPDSigmaT7394Stock at -20 °C
TOMM20 antibodyAbcamab56783Mouse (Host species)
VDAC antibodyAbcamab15895Rabbit (Host species)

Referenzen

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