Isolamento das Mitocôndrias do Músculo Esquelético do Rato para Ensaios Respirométricos

Resumo

Aqui, descrevemos um método detalhado para o isolamento das mitocôndrias do músculo esquelético do camundongo e a análise subsequente da respiração pela Taxa de Consumo de Oxigênio (OCR) usando assins respirométricos à base de microplacas. Este gasoduto pode ser aplicado para estudar os efeitos de múltiplas intervenções ambientais ou genéticas no metabolismo mitocondrial.

Resumo

A maior parte da energia da célula é obtida através da degradação da glicose, ácidos graxos e aminoácidos por diferentes vias que convergem para o sistema de fosforilação oxidativa mitocondrial (OXPHOS), que é regulado em resposta às demandas celulares. A molécula lipídica Coenzyme Q (CoQ) é essencial nesse processo, transferindo elétrons para o complexo III na cadeia de transporte de elétrons (ETC) através de ciclos constantes de oxidação/redução. O estado mitocôndria e, em última análise, a saúde celular podem ser avaliadas medindo o consumo de oxigênio etc usando assistos respirométricos. Esses estudos são tipicamente realizados em linhas celulares estabelecidas ou primárias que foram cultivadas por vários dias. Em ambos os casos, os parâmetros de respiração obtidos podem ter se desviado de condições fisiológicas normais em qualquer determinado órgão ou tecido.

Além disso, as características intrínsecas das fibras únicas cultivadas isoladas do músculo esquelético impedem esse tipo de análise. Este artigo apresenta um protocolo atualizado e detalhado para a análise da respiração em mitocôndrias recém-isoladas do músculo esquelético do camundongo. Também fornecemos soluções para possíveis problemas que possam surgir em qualquer etapa do processo. O método aqui apresentado poderia ser aplicado para comparar as taxas de consumo de oxigênio em diversos modelos de camundongos transgênicos e estudar a resposta mitocondrial a tratamentos medicamentosos ou outros fatores como envelhecimento ou sexo. Este é um método viável para responder a perguntas cruciais sobre metabolismo e regulação bioenergetics mitocondrial.

Introdução

Mitocôndrias são as organelas metabólicas primárias na ^célula1. Essas organelas especializadas em membrana usam moléculas de nutrientes para produzir energia na forma de triphosfato de adenosina (ATP) por OXPHOS. Este processo se baseia na transferência de elétrons de moléculas de doadores em uma série de reações redox no ^ETC2. CoQ é o único lipídio ativo de redox que é endogenosamente produzido em todas as membranas celulares e lipoproteínas circulantes que mostra função ^{antioxidante3}. É um componente essencial do ETC, transferindo elétrons do complexo I e _fadh2 dependentes de NADH II para o complexo III, embora muitas outras reductases possam conduzir a redução do CoQ mitocondrial para o ubiquinol como um passo obrigatório em múltiplas vias metabólicas ^celulares4,5.

Ao longo do processo, um gradiente de prótons eletroquímicos é criado através da membrana interna mitocondrial, que é transformada em energia biologicamente ativa pelo complexo de sintetizador ATP ^V2. Consequentemente, a disfunção mitocondrial leva a uma miríade de condições patológicas que afetam principalmente tecidos com necessidades de alta energia - o cérebro, o coração e o músculo ^{esquelético6,7}. Por isso, é fundamental desenvolver métodos para analisar com precisão os bioenergésicos mitocondriais para investigar seu papel na saúde e na doença, particularmente em tecidos altamente energéticos, como os músculos esqueléticos.

O eletrodo de oxigênio do tipo Clark tem sido usado clássicamente no estudo da respiração mitocondrial8. No entanto, este sistema tem sido progressivamente deslocado por tecnologias de maior resolução, com tecnologias de consumo de oxigênio baseadas em microplaca, como os analisadores XF Agilent Seahorse sendo especialmente ^populares9. No campo muscular esquelético, esses estudos são tipicamente conduzidos em células cultivadas, principalmente na linha de células mioblast do camundongo imortalizada C2C12 ou culturas primárias derivadas de células ^{satélite10,11}. No entanto, esses estudos não recapitulam totalmente a situação in vivo, especialmente quando se investigam a biologia mitocondrial e funcionam no nível tecidual sobre insultos específicos, intervenções nãogenéticas ou manipulações genéticas.

Além disso, os ensaios de respiração nas células são mais complexos devido a fatores adicionais, incluindo a demanda extra-mitocondrial de ATP e ensaios substratos ou eventos de sinalização, o que poderia enganar a interpretação dos resultados. Alternativamente, também é possível usar pacotes únicos ou de miofibers recém-isolados dos músculos. No entanto, o método de isolamento é tecnicamente desafiador e só é viável para alguns tipos musculares. Neste caso, os músculos flexor digitorum brevis (FDB) e extensor digitorum longus (EDL) são usados ^{principalmente10,12,13}, embora alguns relatórios descrevam o uso de outros tipos musculares ^também14,15.

O perfil bioenergésico das seções musculares esqueléticas também foi ^relatado16. A maior vantagem deste método é que músculos intactos podem ser estudados (os autores mostram que o corte através de fibras não perturba os resultados quando comparado com miofibers isolados). No entanto, o acesso mitocondrial a substratos e inibidores de ensaios é limitado e, portanto, apenas alguns parâmetros podem ser ^medidos16. Por fim, mitocôndrias isoladas também podem ser empregadas9,17,18,19. Neste caso, mitocôndrias perdem seu ambiente citosolico, o que pode afetar sua função. Em contraste, este método garante o acesso a substratos e inibidores, permite a análise de uma infinidade de tipos de amostragem e normalmente requer menos material.

Este artigo descreve um método para realizar o perfil bioenergéstico de mitocôndrias isoladas do músculo esquelético do rato usando assins respirométricos à base de microplacas (Figura 1). Em particular, três protocolos são detalhados: o Ensaio de Acoplamento, CA para avaliar o grau de acoplamento entre o ETC e o maquinário OXPHOS; o Ensaio de Fluxo de Elétrons, EFA para medir a atividade dos complexos etc individuais; e o ensaio BOX para determinar a capacidade mitocondrial de β-oxidação. Notavelmente, apenas pequenas quantidades de amostras são necessárias em comparação com métodos convencionais de respirometria. O protocolo de isolamento utilizado aqui foi modificado a partir do método publicado em outros ^lugares18.

Protocolo

A coleta de camundongos e a coleta de tecidos foram realizadas por meio de protocolos aprovados pelo Comitê de Ética da Universidad Pablo de Olavide (Sevilla, Espanha; protocolos 24/04/2018/056 e 03/12/2021/033) de acordo com o Decreto Real Espanhol 53/2013, Diretiva Europeia 2010/63/UE, e outras diretrizes relevantes.

1. Preparação de estoques, buffers e reagentes para os ensaios de respiração

1. Prepare as seguintes soluções de estoque, que podem ser armazenadas na temperatura indicada por meses. Use _H2O ultrauso em todos os casos.
   1. Dissolver comprimidos de soro fisiológico tamponado de fosfato (PBS) em _H2O (1 comprimido por 200 mL de _H2O) para preparar 1x PBS. Autoclave a solução e armazene-a à temperatura ambiente (RT).
   2. Dissolva 2 g de pelotas NaOH em 50 mL de _H2O para preparar 1 M NaOH.
   3. Prepare 0,1 M, 1 M, 5 M e 10 M KOH para calibração de pH.
   4. Adicione 14,612 g de EDTA a 70 mL de _H2O. Adicione pelotas NaOH até que o pH atinja 8,0 para que o EDTA se dissolva completamente. Adicione satis quântico _H2O (QS) a 100 mL. Autoclave a solução resultante de 0,5 M EDTA (pH 8) e armazene-a na RT.
   5. Adicione 19 g de EGTA a 70 mL de _H2O. Adicione pelotas NaOH até que o pH atinja 8,0 para permitir que o EGTA se dissolva totalmente. Adicione _H2O QS a 100 mL. Autoclave a solução resultante de 0,5 M EGTA (pH 8) e armazene-a na RT.
   6. Adicione 2 mL de 0,5 M EDTA a 98 mL de PBS. Armazene a solução EDTA/PBS resultante de 10 mM na RT.
   7. Dissolva 5.958 g de HEPES em _H2O de 40 mL. Ajuste o pH para 7,2 com KOH e QS a 50 mL com _H2O. Filtre o buffer HEPES resultante de 0,5 M através de uma malha de 0,45 μm e armazene-o na RT.
   8. Dissolver 3.402 g de _KH2PO4 em até 50 mL de _H2O. Filtrar a solução _KH2PO4 resultante de 0,5 M através de uma malha de 0,45 μm e armazená-la na RT.
   9. Dissolver 9.521 g de _MgCl2 anidro em até 100 mL de _H2O. Autoclave a solução resultante de 1 M _MgCl2 e armazene-a na RT.
      NOTA: Como se trata de uma reação exotérmica, proceda com cautela e dissolva o _MgCl2 no gelo.
2. Prepare soluções de estoque de substrato e inibidor (ver Tabela 1). Aliquot e armazene-os a -20 °C. Evite ciclos de congelamento. Como exceção, prepare sempre o ácido piruvico imediatamente antes do uso.
   1. Prepare-se em _H2O ultrapure: 0,5 M de succinato, 0,5 M de ácido piruvico, 0,5 M de ácido mánico, 100 mM ADP, 1 M de ácido ascórbico e 50 mM N,N,N',N'-tetramethyl-para-fenileno-diamina (TMPD) (proteger da luz).
   2. Prepare-se em sulfóxido de 100% dimetil (DMSO): 50 mM palmitoyl-L-carnitina, 4 mM rotenona, 20 mM de cianeto carbonil -p-trifluorometoyilhydrazone (FCCP), 4 mM de oligomicina e 5 mM antimicina A.
      NOTA: Não exceda a concentração final de DMSO de 0,1% nos poços de microplacas. Portanto, prepare soluções de estoque altamente concentradas para ficar abaixo desse limite.
3. Prepare os buffers para isolamento de mitocôndrias e quantificação de proteínas recentemente no dia do experimento. Use _H2O ultrauso em todos os casos e mantenha todos os buffers no gelo, a menos que seja indicado de outra forma.
   NOTA: Para economizar tempo, todos os reagentes podem ser pesados e mantidos nos recipientes apropriados (por exemplo, tubos de 15 mL) na temperatura certa no dia anterior.
   1. Para preparar 10% de ácidos graxos livres (FFA) BSA, dissolva completamente 150 mg de FFA BSA em 1,5 mL de _H2O por inversão/roda rotativa. Não vórtice para evitar espuma.
   2. Para preparar 1x reagente Bradford, diluir a solução de estoque comercial de 5x com _H2O e mantê-lo no escuro na RT.
   3. Para preparar 8x Tampão mitocôndria (MB), dissolva 4,112 g de sacarose e 763 mgs de HEPES em 15 mL de _H2O. Ajuste o pH para 7,2, adicione 1,6 mL de 10% FFA BSA e QS a 20 mL com _H2O.
   4. Para preparar 20 mL de Tampão de Isolamento 1 (IB1) (4 mL usado por amostra), dissolva 400 μL de 0,5 M EDTA, 784 mg de D-mannitol e 2,5 mL de 8x MB em 15 mL de _H2O. Ajuste o pH para 7,2 e QS com _H2O.
   5. Para preparar 5 mL de Tampão de Isolamento 2 (IB2) (500 μL usado por amostra), dissolva 30 μL de 0,5 M EGTA, 196 mg de D-mannitol e 625 μL de 8x MB em 4 mL de _H2O. Ajuste o pH para 7,2 e QS com _H2O.
   6. Para preparar 5 mL de Tampão de Ressuspensão (RB) (200 μL usado por amostra), dissolva 120 mg de sacarose, 191,3 mg de D-mannitol, 50 μL de 0,5 M HEPES e 10 μL de 0,5 M EGTA em 4 mL de _H2O. Ajuste o pH para 7,2 e QS com _H2O.
   7. Para preparar 2x Mitocondrial Assay Solution-1 (MAS-1), dissolver 1.199 g de sacarose, 2,8 g de mannitol, 1 mL de 0,5 M _KH2PO4, 250 μL de 1 M _MgCl2, 200 μL de 0,5 M HEPES e 100 μL de 0,5 M EGTA em 20 mL de _H2O. Ajuste o pH para 7,2 e QS para 25 mL com _H2O. Mantenha no gelo por períodos curtos. Por períodos mais longos, mantenha-o a 4 °C para evitar precipitação.
   8. Para preparar 1x Acoplamento médio de ensaio (CAM), prepare dois buffers diferentes baseados em MAS-1: 1) CAM+BSA para o ensaio CA adequado, e 2) CAM-BSA para preparar os inibidores do ensaio. Mantenha sempre a relação piruvato:malate em 10:1.
      NOTA: Como a BSA pode entupir as portas de injeção, diluir os inibidores na CAM livre de BSA.
      1. Para preparar CAM+BSA, diluir 300 μL de ácido piruvico de 0,5 M, 30 μL de ácido malic de 0,5 M e 7,5 mL de 2x MAS-1 em 6 mL de _H2O. Ajuste o pH para 7,2. Adicione 300 μL de 10% FFA BSA e QS a 15 mL com _H2O.
      2. Para preparar o CAM-BSA, diluir 120 μL de ácido piruvico de 0,5 M, 12 μL de ácido malic de 0,5 M e 3 mL de 2x MAS-1 em 2 mL de _H2O. Ajuste o pH para 7,2 e QS a 6 mL com _H2O.
   9. Para preparar o 1x Electron Flow Assay medium (EFAM), prepare tanto os buffers EFAM contendo BSA quanto os EFAM livres de BSA.
      1. Para preparar o EFAM+BSA, diluir 300 μL de ácido piruvico de 0,5 M, 60 μL de ácido 0,5 M de mánico, 3 μL de 20 mM FCCP e 7,5 mL de 2x MAS-1 em 6 mL de _H2O. Ajuste o pH para 7,2. Adicione 300 μL de 10% FFA BSA e QS a 15 mL com _H2O.
      2. Para preparar o EFAM-BSA, diluir 120 μL de ácido piruvico de 0,5 M, 24 μL de ácido málico de 0,5 M, 1,2 μL de 20 mM FCCP e 3 mL de 2x MAS-1 em 2 mL de _H2O. Ajuste o pH para 7,2 e QS a 6 mL com _H2O.
   10. Para preparar 1x β-oxidação (BOXM), prepare soluções BOXM contendo BSA e sem BSA.
       1. Para preparar o BOXM+BSA, diluir 12 μL de palmitoyl-L-carnitina de 50 mM, 30 μL de ácido malic de 0,5 M e 7,5 mL de 2x MAS-1 em 7 mL de _H2O. Ajuste o pH para 7,2. Adicione 300 μL de 10% FFA BSA e QS a 15 mL com _H2O.
       2. Para preparar BOXM-BSA, diluir 4,8 μL de palmitoyl-L-carnitina de 50 mM, 12 μL de ácido málico de 0,5 M e 3 mL de 2x MAS-1 em 2 mL de _H2O. Ajuste o pH para 7,2 e QS a 6 mL com _H2O.

2. Dissecção muscular, homogeneização e isolamento mitocondrial

1. Coloque todos os materiais e tampões no gelo. Certifique-se de que todos os materiais são gelados durante todo o procedimento para proteger mitocôndrias de danos.
2. Coloque três béquers de 50 mL por amostra no gelo e adicione as seguintes soluções: 10 mL de PBS no béquer 1, 10 mL de 10 mM EDTA/PBS no béquer 2, e 4 mL de IB1 no béquer 3.
3. Eutanize o rato por luxação cervical. Evite a eutanásia de _CO2 , pois os músculos esqueléticos podem se tornar hipóxicos, interferindo nas análises respiratórias.
4. Pulverize a linha traseira direita com 70% de etanol para evitar que a pele se desça, e tape membro na placa de dissecção da rolha. Fita o membro dianteiro esquerdo também.
5. Faça uma incisão com um bisturi descartável estéril através da pele do joelho aos dedos dos dois.
6. Segure a pele com fórceps dentadas ao nível do tornozelo e corte-a com uma tesoura fina ao redor do tornozelo.
7. Alivie a pele da musculatura subjacente com pinças de ponta fina em uma mão enquanto puxa-a para cima com fórceps dentados na outra mão.
8. Disseque todos os músculos esqueléticos do tornozelo ao joelho (Figura 2).
   1. Remova todo o tecido conjuntivo sobre o músculo tibialis anterior (TA) para facilitar a extração muscular usando pinças finas e tesouras.
   2. Encontre os quatro tendões distais do músculo EDL e se estel-os perto de suas inserções nos dedos dos dedos. Localize o tendão distal do TA e corte-o perto de sua inserção, sempre abaixo do tornozelo.
   3. Puxe cuidadosamente os tendões TA e EDL acima do tornozelo para liberar as pontas soltas.
   4. Segure as pontas soltas dos tendões e alivie os músculos para longe do resto da musculatura e ossos puxando-os para cima. Use pinças finas ou tesouras para facilitar o processo. Prossiga com cuidado para evitar a contração da miofibra.
   5. Corte o tendão proximal do EDL e do músculo TA o mais próximo possível da rótula.
   6. Vire o mouse de cabeça para baixo para prosseguir com extração gastrocnemius (GA) e soleus muscular.
   7. Segure o bolso formado entre o bíceps femoral e o GA com fórceps dentados. Use uma tesoura fina para separar esses músculos e visualizar o tendão proximal do GA.
   8. Segure o tendão de Aquiles com fórceps finos e corte-o cuidadosamente com uma tesoura fina. Solte os músculos GA e soleus do osso subjacente puxando-os através de seus tendões. Corte o tendão proximal de GA liberando-o junto com o soleus subjacente.
   9. Disseca cuidadosamente os músculos restantes do tendão ao tendão após o mesmo procedimento até que apenas os ossos permaneçam.
   10. Recue o mouse na posição inicial para dissecar o músculo quadríceps.
   11. Descarte o tecido adiposo sobre o quadríceps no lado proximal usando fórceps dentados e tesoura fina.
   12. Insira pinças finas entre o quadríceps e o fêmur e mova-as em ambas as direções ao longo do eixo do fêmur para separar o músculo do osso.
   13. Segure os tendões musculares do quadríceps distal com fórceps dentados e corte o tendão com uma tesoura fina o mais próximo possível da rótula.
   14. Puxe o quadríceps para cima e liberte-o na inserção proximal com uma tesoura fina.
9. Repita as etapas 4-8 desta seção com o bloco traseiro esquerdo.
10. Enxágüe todos os músculos em Beaker 1 primeiro e depois em Beaker 2.
11. Transfira todos os músculos para Beaker 3 e pique finamente todos os músculos com uma tesoura afiada no gelo.
12. Transfira a suspensão para um tubo C (tampa roxa), mantendo-a sempre no gelo.
13. Feche bem o tubo C e coloque-o de cabeça para baixo na manga do homogeneizador. Certifique-se de que o material amostral está na área do rotador/estator. Selecione o programa de 1 min chamado m_mito_tissue_01.
14. Divida o homogeneizar em dois tubos de microcentrifuuge pré-2 mL e centrífugas a 700 × g por 10 min a 4 °C em uma centrífuga de mesa.
15. Transfira os supernantes para novos tubos pré-2 mL pré-edes, evitando cuidadosamente gordura e tecido não homogeneizado. Armazene as pelotas a -80 °C para determinação de pureza de fragmentação (fração N) (Figura 3).
16. Centrifugar os supernantes a 10.500 × g por 10 min a 4 °C.
17. Transfira os supernantes para novos tubos pré-2 mL e rotule-os como Supernatant Número 1 (SN1). Armazene-os a -80 °C para determinação de pureza de fragmentação (Figura 3).
18. Resuspend e combine ambas as pelotas em um volume total de 500 μL de IB2 no gelo.
19. Centrifugar a 10.500 × g por 10 min a 4°C.
20. Transfira o supernatante para um novo tubo pré-2 mL pré-2ml e rotule-o como Supernatant Número 2 (SN2). Armazene-o a -80 °C para determinação de pureza de fragmentação (Figura 3).
21. Resuspend a última pelota mitocondrial em 200 μL de RB. Reserve rapidamente 10 μL para quantificação de proteínas e adicione imediatamente 10 μL de 10% FFA BSA à suspensão mitocondrial restante para evitar danos.
22. Determine a concentração de proteínas usando o ensaio de Bradford.
    1. Para a curva padrão, prepare 30 μL de diluições seriais de concentração conhecida de uma proteína no tampão RB. Por exemplo, use 1 mg/mL, 0,5 mg/mL, 0,25 mg/mL, 0,125 mg/mL, 0,0625 mg/mL e 0 mg/mL de BSA.
    2. Prepare 1:3 e 1:6 diluições seriais das amostras mitocondriais em tampão RB.
    3. Em uma placa de fundo plano de 96 poços, primeira carga 2,5 μL de amostra/padrão por poço. Em seguida, adicione 10 μL de 1 M NaOH a cada amostra e, finalmente, 200 μL de reagente 1x Bradford. Misture bem, evitando bolhas de ar. Verifique visualmente se a cor das amostras está dentro da linha de calibração. Sempre realize a análise em triplicado.
    4. Incubar as placas por 5 min no RT no escuro, e ler a absorvância a 595 nm em um espectrômetro de microplato.
    5. Calcule a curva padrão plotando os valores de absorção (eixo y) versus a concentração proteica correspondente das diluições preparadas na etapa 22.1 nesta seção (eixo x).
    6. Calcule a quantidade total de proteína nas amostras mitocondriais por extrapolação com a curva padrão.

3. Preparação dos ensaios respirométricos à base de microplacar

1. Hidrate o sensor de ensaio respirométrico pelo menos 12 h antes do experimento com 1 mL de tampão de calibração por poço. Incubar a 37 °C (sem _CO2).
   NOTA: Os sensores hidratados podem ser usados por até 72 h. O cartucho deve ser manuseado cuidadosamente durante esta etapa: se alguma coisa tocar os sensores, a sensibilidade de medição pode ser afetada.
2. Prechill a centrífuga preparatória com o rotor de microplaca balançando e os adaptadores de microplaca correspondentes a 4 °C.
3. Ligue o computador, abra o software de análise e selecione o protocolo desejado.
   NOTA: Um clique é ouvido quando o software se conecta ao instrumento de medição do consumo de oxigênio. O sensor de aquecimento deve ser verde e a 37 °C antes do início do experimento.
4. Prepare as soluções inibidoras dos estoques indicados na seção 1, etapa 2 de acordo com o ensaio a ser realizado. Prepare volume suficiente para cada solução. Consulte a Tabela 1 e a Tabela 2 para referência.
5. Adicione o volume apropriado de cada inibidor em cada porta, insira o cartucho no instrumento de medição do consumo de oxigênio e inicie a calibração.
   NOTA: Adicionar inibidor ao cartucho e inserir o cartucho no instrumento leva de 15 a 20 minutos. Certifique-se de que os componentes corretos do cartucho sejam introduzidos. A tampa do cartucho e o reforço hidráulico podem ser descartados enquanto o cartucho do sensor e o local do utilitário são necessários.
6. Centrifugar a suspensão mitocondrial concentrada da seção 2, passo 21 a 10.500 × g para 10 min a 4 °C.
7. Resuspend a pelota mitocondrial em 100 μL de 1x CAM+BSA, 1x EFAM+BSA ou 1x BOXM+BSA, dependendo do protocolo a ser realizado.
8. Diluir ainda mais a amostra mitocondrial concentrada para uma concentração final de 0,2 μg/μL no meio de ensaio correspondente.
9. Semente 50 μL da suspensão (total de 10 μg de proteína) por poço em uma microplaca de 24 poços pré-24 poços no gelo. Não adicione mitocôndrias nos poços de correção de fundo; adicione apenas o meio de ensaio correspondente. Armazene a suspensão mitocondrial restante a -80 °C para determinação de pureza de fragmentação (Figura 3).
10. Gire a microplaca na centrífuga pré-lícploa preparatória a 2.000 × g por 20 min a 4 °C. Contrapeso para equilibrar em conformidade.
11. Aqueça o restante do ensaio a 37 °C durante a centrifugação de microplacos.
12. Após a centrifugação, deixe a microplacão no banco por 5 minutos para equilibrar. Adicione 450 μL de meio de ensaio quente para um volume final de 500 μL por poço em RT. Faça isso devagar e com cuidado, adicionando o meio à parede dos poços para evitar desprender mitocôndrias.
13. Coloque a microplacão imediatamente no instrumento de medição do consumo de oxigênio sem a tampa e inicie o protocolo (Tabela 3). Certifique-se de que o primeiro passo é uma incubação de 10 minutos para permitir que a microplacão aqueça.
14. Uma vez terminado o experimento, remova o cartucho e a microplacão, desligue o instrumento e inicie a análise.

4. Análise dos resultados

1. No caso dos ensaios CA e BOX, realize as seguintes análises:
   1. Registro de consumo nãomitocondrial _O2 , que corresponde à média dos valores obtidos após a injeção de antimicina A e rotenona.
      NOTA: Antimicina A e rotenona são inibidores complexos III e I, respectivamente.
   2. Calcule a respiração basal subtraindo o consumo nãomitocondrial de _O2 a partir de valores basais (pontos de medição 1 e 2).
   3. Subtrair o consumo nãomitocondrial _O2 dos valores após a injeção do complexo V substrato ADP (injeção A) para determinar o estado mitocondrial III.
   4. Subtrair o consumo nãomitocondrial _O2 dos valores de respiração pós-injeção do complexo oligomicina inibidora V (injeção B) para obter iVo de estado mitocondrial.
   5. Calcule o estado mitocondrial IIIu deduzindo o consumo nãomitocondrial de _O2 da injeção pós-FCCP (injeção C).
      NOTA: FCCP é um potente desconsfotrito de fosforilação mitocondrial. A síntese de ATP é contornada em sua presença, e o ETC atinge a atividade máxima.
   6. Subtrair valores de respiração basal do estado mitocondrial IIIu valores para obter capacidade de reposição mitocondrial, que é a capacidade de gerar ATP extra em caso de aumento da demanda de energia.
   7. Divida o estado mitocondrial IIIu por valores de IVo estaduais para obter a Relação de Controle Respiratório (RCR).
      NOTA: Os valores negativos ou nulos do RCR indicam que o acoplamento mitocondrial é afetado.
2. Em referência à EFA, realize os seguintes cálculos:
   1. Obtenha atividade residual calculando o valor médio pós rotenona e injeção de Antimicina A (injeções A e C).
   2. Calcular a atividade complexa I a IV (CI-CIV) subtraindo a atividade residual dos valores basais (pontos de medição 1 e 2).
   3. Subtrair a atividade residual dos valores pós-injeção do succinato do substrato CII (injeção B) para obter atividade CII-CIII-CIV.
   4. Calcule a atividade de CIV deduzindo a atividade residual dos valores obtidos após a injeção dos agentes c-redutores citocromo, ácido ascórbico e TMPD (injeção D).
3. Representar todos os resultados utilizando parcelas de barras, como na Figura 4, para extrair conclusões apropriadas.

Resultados

O protocolo aqui apresentado permite a análise in vivo da respiração mitocondrial através do isolamento das mitocôndrias do músculo esquelético do camundongo. Um esboço do método é mostrado na Figura 1. Após dissecar músculos esqueléticos das retalhos (Figura 2), os tecidos são homogeneizados e mitocôndrias purificadas, sob condições isotônicas, através de centrífugas em série. A pureza das diferentes frações obtidas durante o pro...

Discussão

Todos os métodos utilizados para estudar a respiração mitocondrial têm suas limitações; portanto, é crucial selecionar o método que melhor se adequa a uma questão experimental específica. Este trabalho fornece um protocolo atualizado e detalhado para isolar mitocôndrias do músculo esquelético do rato para realizar diferentes ensaios respiratórios para investigar a função mitocondrial. De fato, o estudo de bioenergésicos mitocondriais mitocôndicos em mitocôndrias isoladas usando tecnologias baseadas em ...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
ADP	Sigma	A5285	Stock at -20 °C
AKT antibody	Cell Signaling Technology	C67E7	Rabbit (Host species)
anti-Goat HRP	Sigma	401504	Rabbit (Host species)
anti-Mouse HRP	Cell Signaling	#7076	Horse (Host species)
Antimycin A	Sigma	A8674	Stock at -20 °C
anti-Rabbit HRP	Cell Signaling	#7074	Goat (Host species)
Ascorbic acid	Sigma	A5960	Stock at RT
Bactin antibody	Sigma	MBS4-48085	Goat (Host species)
Bio-Rad Protein Assay Kit II	Bio-Rad	5000002	It includes 5x Bradford reagent and BSA of known concentration for the standard curve
BSA, fraction V, Fatty Acid-Free	Calbiochem	126575	Stock at 4 °C
C tube	Miltenyi Biotec	130-093-237	Purple lid
Calnexin antibody	ThermoFisher	MA3-027	Mouse (Host species)
D-mannitol	Sigma	M4125	Stock at RT
EDTA	BDH	280254D	Stock at 4 °C
EGTA	Sigma	E-4378	Stock at RT
FCCP	Sigma	C2920	Stock at -20 °C
gentleMACS Dissociator	Miltenyi Biotec	130-093-235	Homogenizer
HEPES	Sigma	H3375	Stock at RT
HSP70 antibody	Proteintech	10995-1-AP	Rabbit (Host species)
LDH-A antibody	Santa Cruz Biotechnology	SC27230	Goat (Host species)
Magnesium chloride	ChemCruz	sc-255260A	Stock at RT
Malic acid	Sigma	P1645	Stock at RT
Microplate spectrophotometer	BMG LABTECH GmbH	POLARstar OMEGA S/N 415-0292	Stock at RT
Milli-Q water	Millipore system	F7HA17757A	Ultrapure water
mtTFA antibody	Santa Cruz Biotechnology	SC23588	Goat (Host species)
Na+/K+-ATPase α1 antibody	Novus Biologicals	NB300-14755	Mouse (Host species)
Oligomycin	Sigma	O4876	Stock at -20 °C
Palmitoyl-L-carnitine	Sigma	P1645	Stock at -20 °C
PBS tablets	Sigma	P4417-100TAB	1x stock at RT
Potassium dihydrogen phosphate	ChemCruz	sc-203211	Stock at RT
Potassium hydroxide	Sigma	60377	Stock at RT
Pyruvic acid	Sigma	107360	Stock at 4 °C
Rotenone	Sigma	R8875	Stock at -20 °C
Seahorse XF24 mitochondrial flux analyzer	Agilent Technologies	420179	XFe24 model
Seahorse XFe24 FluxPak mini	Agilent Technologies	102342-100	The kit includes cartridges, microplates, and calibrant solution
Succinate	Sigma	S7626	Stock at RT
Sucrose	Sigma	S9378	Stock at RT
TIMM23 antibody	Abcam	ab230253	Rabbit (Host species)
TMPD	Sigma	T7394	Stock at -20 °C
TOMM20 antibody	Abcam	ab56783	Mouse (Host species)
VDAC antibody	Abcam	ab15895	Rabbit (Host species)