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  • 参考文献
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摘要

在这里，我们描述了从小鼠骨骼肌中分离线粒体的详细方法，以及随后使用基于微孔板的呼吸测定通过耗氧率（OCR）分析呼吸。该管道可用于研究多种环境或遗传干预措施对线粒体代谢的影响。

摘要

细胞的大部分能量是通过葡萄糖，脂肪酸和氨基酸的降解获得的，这些途径通过收敛于线粒体氧化磷酸化（OXPHOS）系统的不同途径获得，该系统响应细胞需求而调节。脂质分子辅酶Q（CoQ）通过恒定的氧化/还原循环将电子转移到电子传递链（ETC）中的复合物III，在此过程中是必不可少的。线粒体状态以及最终的细胞健康可以通过使用呼吸测定法测量ETC耗氧量来评估。这些研究通常在已培养数天的已建立或原代细胞系中进行。在这两种情况下，获得的呼吸参数可能偏离了任何给定器官或组织中的正常生理条件。

此外，从骨骼肌分离的培养单纤维的内在特性阻碍了这种类型的分析。本文提出了一种更新和详细的方案，用于分析从小鼠骨骼肌中新鲜分离的线粒体中的呼吸。我们还为流程任何阶段可能出现的潜在问题提供解决方案。这里介绍的方法可用于比较不同转基因小鼠模型中的耗氧率，并研究线粒体对药物治疗或其他因素（如衰老或性别）的反应。这是一种可行的方法来回答有关线粒体生物能量代谢和调节的关键问题。

引言

线粒体是细胞中的主要代谢细胞器1。这些专门的膜封闭细胞器使用营养分子通过OXPHOS以三磷酸腺苷（ATP）的形式产生能量。该过程依赖于ETC2中一系列氧化还原反应中供体分子的电子转移。辅酶Q是唯一一种在所有细胞膜和循环脂蛋白中内源性产生的氧化还原活性脂质，具有抗氧化功能3。它是ETC的重要组成部分，将电子从NADH依赖性复合物I和FADH2依赖性复合物II转移到复合物III，尽管许多其他还原酶可以驱动线粒体CoQ还原为泛醇，作为多个细胞代谢途径中的强制性步骤4，5。

在整个过程中，在线粒体内膜上产生电化学质子梯度，由ATP合酶复合物V2转化为生物活性能量。因此，线粒体功能障碍导致无数的病理状况，主要影响具有高能量需求的组织 - 大脑，心脏和骨骼肌6，7。因此，开发准确分析线粒体生物能量学的方法以研究其在健康和疾病中的作用至关重要，特别是在骨骼肌等高能组织中。

克拉克型氧电极已被经典地用于线粒体呼吸的研究8。然而，该系统已逐渐被更高分辨率的技术所取代，基于微孔板的耗氧技术（如安捷伦海马 XF 分析仪）尤其受欢迎9。在骨骼肌领域，这些研究通常在培养细胞中进行，主要在C2C12永生化小鼠肌母细胞系或来自卫星细胞的原代培养物中进行10，11。然而，这些研究并不能完全概括 体内的情况，特别是在研究线粒体生物学和特定损伤，非遗传干预或遗传操作的组织水平功能时。

此外，由于其他因素，细胞中的呼吸测定更加复杂，包括ATP的线粒体外需求和测定底物或信号传导事件，这可能会误导对结果的解释。或者，也可以使用从肌肉中新鲜分离的单个或一束肌。然而，分离方法在技术上具有挑战性，仅适用于少数肌肉类型。在这种情况下，主要使用短指屈肌（FDB）和长指伸肌（EDL）10，12，13，尽管一些报告也描述了其他肌肉类型的使用14，15。

还报道了骨骼肌切片的生物能量分析16。这种方法的主要优点是可以研究完整的肌肉（作者表明，与分离的肌纤维相比，通过纤维切片不会干扰结果）。然而，线粒体对底物和测定抑制剂的访问是有限的，因此，只能测量几个参数16。最后，分离的线粒体也可以同样使用9，17，18，19。在这种情况下，线粒体会失去其胞质环境，这可能会影响其功能。相比之下，这种方法保证了对底物和抑制剂的访问，能够分析过多的样品类型，并且通常需要更少的材料。

本文描述了一种使用基于微孔板的呼吸测定对小鼠骨骼肌分离的线粒体进行生物能量分析的方法（图1）。特别是，详细列出了三种方案:偶联测定，CA，用于评估ETC和OXPHOS机器之间的偶联程度;电子流测定，EFA测量单个ETC配合物的活性;和BOX测定法测定线粒体β氧化能力。值得注意的是，与传统的呼吸法相比，只需要少量的样品。此处使用的隔离协议已从其他地方发布的方法进行了修改18。

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研究方案

根据西班牙皇家法令53/2013，欧洲指令2010/63 / EU和其他相关指南，使用巴勃罗·德·奥拉维德大学伦理委员会（西班牙塞维利亚;协议24/04/2018/056和12/03/2021/033）批准的协议进行小鼠外壳和组织收集。

1. 为呼吸测定制备储备液、缓冲液和试剂

  1. 准备以下储备溶液，可以在指定温度下储存数月。在所有情况下使用超纯 H2O。
    1. 将磷酸盐缓冲盐水（PBS）片剂溶解在H2 O中（每200毫升H2O 1片）以制备1x PBS。高压灭菌溶液并将其储存在室温（RT）下。
    2. 将2克NaOH颗粒溶解在50 mL H 2 O中，以制备1 M NaOH。
    3. 准备 0.1 M、1 M、5 M 和 10 M KOH 储液以进行 pH 校准。
    4. 向70毫升H 2 O中加入14.612克EDTA，加入NaOH沉淀，直到pH值达到8.0，使EDTA完全溶解。将 H2O 量子饱和 度 （QS） 加入 100 mL。高压灭菌所得的0.5M EDTA（pH 8）溶液并将其储存在室温下。
    5. 加入19 g EGTA至70 mL H 2 O中，加入NaOH沉淀至pH值达到8.0，使EGTA完全溶解。将 H2O QS 加入 100 mL 中。高压灭菌所得的0.5M EGTA（pH 8）溶液并将其储存在室温下。
    6. 加入 2 mL 0.5 M EDTA 到 98 mL PBS 中。将得到的 10 mM EDTA/PBS 溶液储存在 RT 中。
    7. 将 5.958 g HEPES 溶解在 40 mL H2O 中。用 KOH 将 pH 调节至 7.2，用 H2O 将 QS 调节至 50 mL。通过 0.45 μm 目玻片过滤生成的 0.5 M HEPES 缓冲液，并将其储存在室温下。
    8. 将3.402 g KH2PO4溶解在高达50 mL的H 2 O中，通过0.45μm的目过滤得到的0.5 M KH2PO4溶液并将其储存在室温下。
    9. 将9.521克无水MgCl2 溶解在高达100毫升的H 2O中，高压灭菌所得的1 M MgCl2 溶液并将其储存在室温下。
      注意:由于这是一种放热反应，因此请谨慎行事并将MgCl2 溶解在冰上。
  2. 制备底物和抑制剂储备溶液（见 表1）。等分试样并储存在-20°C。 避免冻融循环。作为例外，在使用前始终立即准备丙酮酸。
    1. 在超纯H2O中制备:0.5M琥珀酸盐，0.5M丙酮酸，0.5M苹果酸，100mM ADP，1M抗坏血酸和50mM N，N，N′，N′-四甲基对苯二胺（TMPD）（避光）。
    2. 在100%二甲基亚砜（DMSO）中制备:50mM棕榈酰-L-肉碱，4mM鱼藤酮，20mM羰基氰化物-对三氟甲氧基苯腙（FCCP），4mM寡霉素和5mM抗霉素A。
      注意:微孔板孔中的最终DMSO浓度不超过0.1%。因此，准备高度浓缩的储备溶液以保持在此限制以下。
  3. 在实验当天新鲜制备用于线粒体分离和蛋白质定量的缓冲液。除非另有说明，否则在所有情况下均使用超纯H2O，并将所有缓冲液保持在冰上。
    注意:为了节省时间，所有试剂都可以称量并保存在前一天的适当温度下放在适当的容器（例如，15 mL管）中。
    1. 为了制备10%游离脂肪酸（FFA）BSA，通过反转/旋转轮将150mg FFA BSA彻底溶解在1.5mL H2O中。不要涡旋以避免起泡。
    2. 要制备1x Bradford试剂，请用H 2 O稀释5x商业储备溶液，并将其置于室温的黑暗中。
    3. 要制备8x线粒体缓冲液（MB），将4.112g蔗糖和763mgHEPES溶解在15mL H2O中。将pH值调节至7.2，加入1.6mL的10%FFA BSA和QS至20 mL与H2O。
    4. 为了制备20 mL分离缓冲液1（IB1）（每个样品使用4 mL），在15 mL H 2 O中溶解400μL0.5 M EDTA，784mgD-甘露醇和2.5mL8x MB。
    5. 为了制备5 mL分离缓冲液2（IB2）（每个样品使用500μL），将30μL0.5M EGTA，196mgD-甘露醇和625μL8x MB溶解在4mL H2 O中。
    6. 为了制备5mL重悬缓冲液（RB）（每个样品使用200μL），溶解120mg蔗糖，191.3mgD-甘露醇，50μL0.5M HEPES和10μL0.5M EGTA在4mL H2O中。
    7. 为了制备2x线粒体测定溶液-1（MAS-1），将1.199克蔗糖，2.8克甘露醇，1毫升0.5M KH2PO4，250μL1 M MgCl2，200μL0.5M HEPES和100μL0.5M EGTA溶解在20 mL H2O中。用H2O调节pH值至7.2，QS至25 mL。保持短时间在冰中。对于较长时间，将其保持在4°C以避免沉淀。
    8. 要制备1x偶联测定培养基（CAM），请制备两种不同的基于MAS-1的缓冲液:1）CAM + BSA用于CA测定，以及2）CAM-BSA用于制备测定抑制剂。始终将丙酮酸:苹果酸盐的比例保持在10:1。
      注意:由于BSA会堵塞注射口，因此请稀释不含BSA的CAM中的抑制剂。
      1. 要制备CAM + BSA，将300μL丙酮酸，30μL0.5M苹果酸和7.5m2x MAS-1稀释在6mL H2O中。调节pH值至7.2。加入 300 μL 10% FFA BSA 和 QS 至 15 mL 含 H2O。
      2. 要制备CAM-BSA，在2 mL H2O中稀释120μL0.5M丙酮酸，12μL0.5M苹果酸和3mL2x MAS-1。
    9. 要制备1x电子流测定培养基（EFAM），请制备含BSA和不含BSA的EFAM缓冲液。
      1. 为了制备EFAM + BSA，在6 mL H 2O中稀释300μL0.5M丙酮酸，60μL0.5M苹果酸，3μL20mM FCCP和7.5mL 2x MAS-1。加入 300 μL 10% FFA BSA 和 QS 至 15 mL 含 H2O。
      2. 要制备EFAM-BSA，在2 mL H2O中稀释120μL0.5M丙酮酸，24μL0.5M苹果酸，1.2μL20mM FCCP和3mL 2x MAS-1。
    10. 要制备1x β氧化培养基（BOXM），请制备含BSA和不含BSA的BOXM溶液。
      1. 要制备BOXM + BSA，在7 mL H2O中稀释12μL50mM棕榈酰-L-肉碱，30μL0.5M苹果酸和7.5mL2x MAS-1。加入 300 μL 10% FFA BSA 和 QS 至 15 mL 含 H2O。
      2. 要制备BOXM-BSA，将4.8μL50mM棕榈酰左旋肉碱，12μL0.5M苹果酸和3mL2x MAS-1稀释在2mL H2O中。

2. 肌肉解剖、均质化和线粒体分离

  1. 将所有材料和缓冲液放在冰上。确保所有材料在整个过程中都是冰冷的，以保护线粒体免受损坏。
  2. 将每个样品三个50 mL烧杯放在冰上，并加入以下溶液:10 mL PBS在烧杯1中，10 mL 10 mM EDTA / PBS在烧杯2中，4 mL IB1在烧杯3中。
  3. 通过颈椎脱位对小鼠实施安乐死。避免CO2 安乐死，因为骨骼肌可能会变得缺氧，干扰呼吸分析。
  4. 用70%乙醇喷洒右后肢以防止皮毛脱落，并用胶带将肢体绑在软木塞解剖板上。用胶带粘住左前肢。
  5. 用无菌的一次性手术刀从膝盖到脚趾穿过皮肤做一个切口。
  6. 用齿镊子在脚踝水平夹住皮肤，并在脚踝周围用细剪刀剪开。
  7. 用细尖镊子一手将皮肤从下面的肌肉组织中移开，另一只手用齿镊子将其拉起。
  8. 从脚踝到膝盖解剖所有骨骼肌（图2）。
    1. 去除胫骨前肌（TA）上的所有结缔组织，以使用细镊子和剪刀促进肌肉提取。
    2. 找到EDL肌肉的四个远端肌腱，并将它们切除在靠近脚趾插入处的地方。找到TA远端肌腱并将其切入靠近其插入处，始终在脚踝下方。
    3. 小心地将TA和EDL肌腱拉到脚踝上方，以释放松动的末端。
    4. 抓住肌腱松弛的末端，通过向上拉动肌肉和骨骼来缓解肌肉远离其他部位和骨骼。使用精细的镊子或剪刀来促进这个过程。小心行事，避免肌纤维收缩。
    5. 切除EDL的近端肌腱和TA肌，使其尽可能靠近膝盖骨。
    6. 将鼠标倒置以继续进行腓肠肌（GA）和比目鱼肌肉提取。
    7. 用齿镊子抓住股二头肌和GA之间形成的口袋。使用细剪刀分离这些肌肉，并可视化近端GA肌腱。
    8. 用细镊子抓住跟腱，并用细剪刀小心地切割。通过将GA和比目鱼肌肉从下面的骨骼中释放出来，将它们拉到肌腱上。切开近端GA肌腱，将其与下面的比目镜一起释放。
    9. 按照相同的程序，小心地将剩余的肌肉从肌腱解剖到肌腱，直到只剩下骨骼。
    10. 将鼠标重新固定在初始位置以解剖股四头肌。
    11. 用齿镊子和细剪刀将脂肪组织丢弃在近端侧的股四头肌上。
    12. 在股四头肌和股骨之间插入细镊子，并沿股骨轴向两个方向移动，以将肌肉与骨骼分开。
    13. 用齿镊子抓住股四头肌远端肌腱，并用细剪刀尽可能靠近膝盖骨切割肌腱。
    14. 将股四头肌向上拉，用细剪刀将其释放在近端插入处。
  9. 用左后肢重复此部分的步骤4-8。
  10. 首先冲洗烧杯1中的所有肌肉，然后冲洗烧杯2中的所有肌肉。
  11. 将所有肌肉转移到烧杯3上，并在冰上用锋利的剪刀将所有肌肉切碎。
  12. 将悬浮液转移到C管（紫色盖子）中，始终将其保持在冰中。
  13. 紧紧关闭C管并将其倒置到均质机的套筒上。确保样品材料位于旋转器/定子区域。选择名为 "m_mito_tissue_01"的 1 分钟程序。
  14. 将匀浆分成两个2mL预冷微量离心管，并在台式离心机中以700× g 在4°C下离心10分钟。
  15. 将上清液转移到新的2 mL预冷管中，小心避免脂肪和非匀浆组织。将颗粒储存在-80°C下以测定碎裂纯度（馏分N）（图3）。
  16. 在4°C下以10，500× g 离心上清液10分钟。
  17. 将上清液转移到新的2 mL预冷管中，并将其标记为1号上清液（SN1）。将它们储存在-80°C下以测定碎裂纯度（图3）。
  18. 在冰中以总体积为500μL的IB2重悬并混合两种沉淀。
  19. 在4°C下以10，500× g 离心10分钟。
  20. 将上清液转移到新的2 mL预冷管中，并将其标记为2号上清液（SN2）。将其储存在-80°C下以测定碎裂纯度（图3）。
  21. 将最终的线粒体沉淀重悬于200μLRB中。快速留出10μL用于蛋白质定量，并立即向剩余的线粒体悬浮液中加入10μL10%FFA BSA以防止损伤。
  22. 使用布拉德福德测定法测定蛋白质浓度。
    1. 对于标准曲线，在RB缓冲液中制备30μL已知浓度蛋白质的连续稀释液。例如，使用 1 毫克/毫升、0.5 毫克/毫升、0.25 毫克/毫升、0.125 毫克/毫升、0.0625 毫克/毫升和 0 毫克/毫升的生物安全脂蛋白。
    2. 在RB缓冲液中制备线粒体样品的1:3和1:6连续稀释液。
    3. 在96孔平底板中，首先每孔上样2.5μL样品/标准品。接下来，向每个样品中加入10μL1 M NaOH，最后向200μL1x Bradford试剂中加入。混合均匀，避免气泡。目视检查样品的颜色是否在校准线内。始终一式三份执行分析。
    4. 在黑暗中的室温下孵育板5分钟，并在微孔板分光光度计中读取595nm处的吸光度。
    5. 通过绘制本节（x轴）中步骤22.1中制备的稀释液的吸光度值（y轴）与相应的蛋白质浓度来计算标准曲线。
    6. 通过用标准曲线外推计算线粒体样品中蛋白质的总量。

3. 基于微孔板的呼吸测定法的制备

  1. 在实验前至少12小时用每孔1mL校准缓冲液水合呼吸测定传感器。在37°C（无CO2）下孵育。
    注:水合传感器最长可使用72小时。在此步骤中，应小心处理墨盒:如果有任何东西接触到传感器，则可能会影响测量灵敏度。
  2. 在4°C下用摆动桶微孔板转子和相应的微孔板适配器预冷制备离心机。
  3. 打开计算机，打开分析软件，然后选择所需的协议。
    注:当软件连接到耗氧量测量仪时，会听到咔嗒声。在实验开始之前，加热传感器应为绿色且温度为37°C。
  4. 根据要进行的测定，从第1节，步骤2中指示的储备中制备抑制剂溶液。为每个解决方案准备足够的卷。参考 见表1 和 表2 。
  5. 在每个端口中加入每个抑制剂的适当体积，将滤芯插入耗氧量测量仪器，然后开始校准。
    注:将抑制剂添加到墨盒中并将卡夹插入仪器需要15-20分钟。确保引入了正确的墨盒组件。当需要传感器盒和实用程序时，可以丢弃墨盒盖和水力助推器。
  6. 在4°C下以10，500× g 离心步骤2，步骤21的浓缩线粒体悬浮液10分钟。
  7. 将线粒体沉淀重悬于100μL1x CAM + BSA，1x EFAM + BSA或1x BOXM + BSA中，具体取决于要执行的方案。
  8. 在相应的测定培养基中进一步稀释浓缩的线粒体样品至最终的0.2μg/ μL浓度。
  9. 将50μL悬浮液（总10μg蛋白质）接种在冰上的预冷24孔微孔板中。不要在背景校正孔中添加线粒体;仅加入相应的测定培养基。将剩余的线粒体悬浮液储存在-80°C下以测定碎裂纯度（图3）。
  10. 在预冷的制备离心机中以2，000× g 在4°C下旋转微孔板20分钟。 配重以相应地平衡。
  11. 在微孔板离心过程中将剩余的测定介质在37°C下加热。
  12. 离心后，将微孔板放在工作台上5分钟以平衡。在室温下加入450μL温测定培养基，最终体积为每孔500μL。缓慢而小心地这样做，将培养基添加到孔壁上以避免线粒体分离。
  13. 立即将微孔板放入不带盖子的耗氧量测量仪中，然后开始实验方案（表3）。确保第一步是孵育10分钟，以使微孔板变暖。
  14. 实验完成后，取出墨盒和微孔板，关闭仪器，然后开始分析。

4. 结果分析

  1. 对于 CA 和 BOX 检测，请执行以下分析:
    1. 记录非线粒体O2 消耗量，其对应于抗霉素A和鱼藤酮注射后获得的值的平均值。
      注意:抗霉素A和鱼藤酮分别是复合物III和I抑制剂。
    2. 通过从基础值（测量点 1 和 2）中减去非线粒体 O2 消耗量来计算基础呼吸。
    3. 从注射复合物V底物ADP（注射液A）后的值中减去非线粒体O2 消耗量，以确定线粒体状态III。
    4. 从复合物V抑制剂寡霉素（注射液B）注射后的呼吸值中减去非线粒体O2 消耗量，以获得线粒体状态IVo。
    5. 通过从FCCP注射（注射C）后的呼吸中扣除非线粒体O2 消耗量来计算线粒体状态IIIu。
      注:FCCP是一种有效的线粒体氧化磷酸化解奕剂。ATP合成在其存在下被绕过，ETC达到最大活性。
    6. 从线粒体状态IIIu值中减去基础呼吸值以获得线粒体备用容量，这是在能量需求增加的情况下产生额外ATP的能力。
    7. 将线粒体状态IIIu除以状态IVo值，得到呼吸控制比（RCR）。
      注意:负或零 RCR 值表示线粒体耦合受到影响。
  2. 参照 EFA，请执行以下计算:
    1. 通过计算鱼藤酮和抗霉素A注射（注射液A和C）后的平均值获得残留活性。
    2. 通过从基础值（测量点 1 和 2）中减去残差活性来计算复合物 I 至 IV （CI-CIV） 活性。
    3. 从注射CII底物琥珀酸盐（注射液B）后的值中减去残余活性，得到CII-CIII-CIV活性。
    4. 通过从注射细胞色素c还原剂，抗坏血酸和TMPD（注射剂D）后获得的值中扣除残留活性来计算CIV活性。
  3. 使用条形图表示所有结果，如图 4 所示，以提取适当的结论。

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结果

这里提出的方案允许通过从小鼠骨骼肌中分离线粒体来对线粒体呼吸进行 体内 分析。该方法的概述如图 1 所示。从后肢解剖骨骼肌后（图2），在等渗条件下，通过连续离心使组织均质化和线粒体纯化。分离过程中获得的不同级分的纯度可以通过使用针对不同细胞器标记物的抗体进行蛋白质印迹分析。 图3A 显示了来自不同...

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讨论

用于研究线粒体呼吸的所有方法都有其局限性;因此，选择最适合特定实验问题的方法至关重要。这项工作提供了一个更新和详细的方案，从小鼠骨骼肌中分离线粒体，以执行不同的呼吸测定以研究线粒体功能。事实上，使用基于微孔板的技术研究孤立线粒体中的线粒体生物能量对于研究组织特异性呼吸的可重复性，可靠性和复杂性是有价值的。此外，使用分离的线粒体可以控制底物的可用性，从...

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披露声明

作者声明他们没有利益冲突要披露。

致谢

我们要感谢Juan J. Tena使用均质机和CABD蛋白质组学和畜牧业设施提供技术支持。这项工作得到了西班牙教育，文化和体育部通过奖学金FPU16 / 03264到J.D.H.C，法国协会通过奖学金#22450向C.V.-G.，机构资助MDM-2016-0687（Maria de Maeztu卓越单位，CABD基因调节和形态发生系）和BFU2017-83150-P到J.J.C。Junta de Andalucía拨款P18-RT-4572，欧盟的FEDER资助计划以及西班牙科学，创新和大学部向P.N.授予RED2018-102576-T。

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材料

NameCompanyCatalog NumberComments
ADPSigmaA5285Stock at -20 °C
AKT antibodyCell Signaling TechnologyC67E7Rabbit (Host species)
anti-Goat HRPSigma401504Rabbit (Host species)
anti-Mouse HRPCell Signaling#7076Horse (Host species)
Antimycin ASigmaA8674Stock at -20 °C
anti-Rabbit HRPCell Signaling#7074Goat (Host species)
Ascorbic acidSigmaA5960Stock at RT
Bactin antibodySigmaMBS4-48085Goat (Host species)
Bio-Rad Protein Assay Kit IIBio-Rad5000002It includes 5x Bradford reagent and BSA of known concentration for the standard curve
BSA, fraction V, Fatty Acid-FreeCalbiochem126575Stock at 4 °C
C tubeMiltenyi Biotec130-093-237Purple lid
Calnexin antibodyThermoFisherMA3-027Mouse (Host species)
D-mannitolSigmaM4125Stock at RT
EDTABDH280254DStock at 4 °C
EGTASigmaE-4378Stock at RT
FCCPSigmaC2920Stock at -20 °C
gentleMACS DissociatorMiltenyi Biotec130-093-235Homogenizer
HEPESSigmaH3375Stock at RT
HSP70 antibodyProteintech10995-1-APRabbit (Host species)
LDH-A antibodySanta Cruz BiotechnologySC27230Goat (Host species)
Magnesium chlorideChemCruzsc-255260AStock at RT
Malic acidSigmaP1645Stock at RT
Microplate spectrophotometerBMG LABTECH GmbHPOLARstar OMEGA S/N 415-0292Stock at RT
Milli-Q waterMillipore systemF7HA17757AUltrapure water
mtTFA antibodySanta Cruz BiotechnologySC23588Goat (Host species)
Na+/K+-ATPase α1 antibodyNovus BiologicalsNB300-14755Mouse (Host species)
OligomycinSigmaO4876Stock at -20 °C
Palmitoyl-L-carnitineSigmaP1645Stock at -20 °C
PBS tabletsSigmaP4417-100TAB1x stock at RT
Potassium dihydrogen phosphateChemCruzsc-203211Stock at RT
Potassium hydroxideSigma60377Stock at RT
Pyruvic acidSigma107360Stock at 4 °C
RotenoneSigmaR8875Stock at -20 °C
Seahorse XF24 mitochondrial flux analyzerAgilent Technologies420179XFe24 model
Seahorse XFe24 FluxPak miniAgilent Technologies102342-100The kit includes cartridges, microplates, and calibrant solution
SuccinateSigmaS7626Stock at RT
SucroseSigmaS9378Stock at RT
TIMM23 antibodyAbcamab230253Rabbit (Host species)
TMPDSigmaT7394Stock at -20 °C
TOMM20 antibodyAbcamab56783Mouse (Host species)
VDAC antibodyAbcamab15895Rabbit (Host species)

参考文献

  1. Spinelli, J. B., Haigis, M. C. The multifaceted contributions of mitochondria to cellular metabolism. Nature Cell Biology. 20 (7), 745-754 (2018).
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