Aislamiento de mitocondrias del músculo esquelético de ratón para ensayos respirométricos

Resumen

Aquí, describimos un método detallado para el aislamiento de mitocondrias del músculo esquelético de ratón y el posterior análisis de la respiración por tasa de consumo de oxígeno (OCR) utilizando ensayos respirométricos basados en microplacas. Esta tubería se puede aplicar para estudiar los efectos de múltiples intervenciones ambientales o genéticas en el metabolismo mitocondrial.

Resumen

La mayor parte de la energía de la célula se obtiene a través de la degradación de glucosa, ácidos grasos y aminoácidos por diferentes vías que convergen en el sistema de fosforilación oxidativa mitocondrial (OXPHOS), que se regula en respuesta a las demandas celulares. La molécula lipídica Coenzima Q (CoQ) es esencial en este proceso mediante la transferencia de electrones al complejo III en la cadena de transporte de electrones (ETC) a través de ciclos constantes de oxidación/reducción. El estado de las mitocondrias y, en última instancia, la salud celular se pueden evaluar midiendo el consumo de oxígeno ETC utilizando ensayos respirométricos. Estos estudios se realizan típicamente en líneas celulares establecidas o primarias que se han cultivado durante varios días. En ambos casos, los parámetros respiratorios obtenidos pueden haberse desviado de las condiciones fisiológicas normales en cualquier órgano o tejido dado.

Además, las características intrínsecas de las fibras individuales cultivadas aisladas del músculo esquelético impiden este tipo de análisis. Este artículo presenta un protocolo actualizado y detallado para el análisis de la respiración en mitocondrias recién aisladas del músculo esquelético de ratón. También proporcionamos soluciones a posibles problemas que podrían surgir en cualquier etapa del proceso. El método aquí presentado podría aplicarse para comparar las tasas de consumo de oxígeno en diversos modelos de ratones transgénicos y estudiar la respuesta mitocondrial a los tratamientos farmacológicos u otros factores como el envejecimiento o el sexo. Este es un método factible para responder a preguntas cruciales sobre el metabolismo y la regulación de la bioenergética mitocondrial.

Introducción

Las mitocondrias son los principales orgánulos metabólicos de la ^célula1. Estos orgánulos especializados encerrados en membrana utilizan moléculas de nutrientes para producir energía en forma de trifosfato de adenosina (ATP) por OXPHOS. Este proceso se basa en la transferencia de electrones de moléculas donantes en una serie de reacciones redox en el ^ETC2. La CoQ es el único lípido redox-activo que se produce endógenamente en todas las membranas celulares y lipoproteínas circulantes que muestra función ^{antioxidante3}. Es un componente esencial de la ETC, transfiriendo electrones del complejo I dependiente de NADH y del complejo II dependiente de _FADH2 al complejo III, aunque muchas otras reductasas pueden impulsar la reducción de la CoQ mitocondrial a ubiquinol como paso obligatorio en múltiples vías metabólicas ^celulares4,5.

A lo largo del proceso, se crea un gradiente electroquímico de protones a través de la membrana interna mitocondrial, que se transforma en energía biológicamente activa por el complejo ATP sintasa ^V2. En consecuencia, la disfunción mitocondrial conduce a una miríada de condiciones patológicas que afectan principalmente a los tejidos con altos requerimientos de energía: el cerebro, el corazón y el músculo ^{esquelético6,7}. Por lo tanto, es fundamental desarrollar métodos para analizar con precisión la bioenergética mitocondrial para investigar su papel en la salud y la enfermedad, particularmente en tejidos altamente energéticos como los músculos esqueléticos.

El electrodo de oxígeno tipo Clark se ha utilizado clásicamente en el estudio de la respiración ^{mitocondrial8}. Sin embargo, este sistema ha sido desplazado progresivamente por tecnologías de mayor resolución, siendo especialmente populares las tecnologías de consumo de oxígeno basadas en microplacas como los analizadores Agilent Seahorse ^XF9. En el campo del músculo esquelético, estos estudios se realizan típicamente en células cultivadas, principalmente en la línea celular de mioblastos de ratón inmortalizada C2C12 o cultivos primarios derivados de células ^{satélite10,11}. Sin embargo, estos estudios no recapitulan completamente la situación in vivo, especialmente cuando se investiga la biología mitocondrial y la función a nivel tisular sobre insultos específicos, intervenciones no genéticas o manipulaciones genéticas.

Además, los ensayos de respiración en las células son más complejos debido a factores adicionales, incluida la demanda extramitocondrial de ATP y sustratos de ensayo o eventos de señalización, que podrían inducir a error la interpretación de los resultados. Alternativamente, también es posible usar miofibras individuales o haces de miofibras recién aisladas de los músculos. Sin embargo, el método de aislamiento es técnicamente desafiante y solo factible para unos pocos tipos de músculo. En este caso, los músculos flexor digitorum brevis (FDB) y extensor digitorum longus (EDL) se utilizan principalmente10,12,13, aunque algunos informes describen el uso de otros tipos de músculos ^{también14,15}.

También se ha reportado perfil bioenergético de secciones del músculo ^{esquelético16}. La principal ventaja de este método es que se pueden estudiar los músculos intactos (los autores muestran que cortar a través de las fibras no altera los resultados en comparación con las miofibras aisladas). Sin embargo, el acceso mitocondrial a sustratos e inhibidores de ensayos es limitado y, por lo tanto, solo se pueden medir unos pocos ^{parámetros16}. Finalmente, las mitocondrias aisladas también pueden ser empleadas9,17,18,19. En este caso, las mitocondrias pierden su entorno citosólico, lo que podría afectar su función. Por el contrario, este método garantiza el acceso a sustratos e inhibidores, permite el análisis de una gran cantidad de tipos de muestras y, por lo general, requiere menos material.

Este artículo describe un método para realizar el perfil bioenergético de mitocondrias aisladas del músculo esquelético de ratón utilizando ensayos respirométricos basados en microplacas (Figura 1). En particular, se detallan tres protocolos: el Ensayo de Acoplamiento, CA para evaluar el grado de acoplamiento entre el ETC y la maquinaria OXPHOS; el ensayo de flujo de electrones, EFA para medir la actividad de los complejos ETC individuales; y el ensayo BOX para determinar la capacidad de β-oxidación mitocondrial. En particular, solo se requieren pequeñas cantidades de muestras en comparación con los métodos de respirometría convencionales. El protocolo de aislamiento utilizado aquí ha sido modificado a partir del método publicado en otra ^parte18.

Protocolo

El alojamiento del ratón y la recolección de tejidos se realizaron utilizando protocolos aprobados por el Comité de Ética de la Universidad Pablo de Olavide (Sevilla, España; protocolos 24/04/2018/056 y 12/03/2021/033) de acuerdo con el Real Decreto 53/2013, la Directiva Europea 2010/63/UE y otras directrices relevantes.

1. Preparación de existencias, tampones y reactivos para los ensayos de respiración

1. Prepare las siguientes soluciones de stock, que se pueden almacenar a la temperatura indicada durante meses. Use _H2O ultrapuro en todos los casos.
   1. Disuelva las tabletas de solución salina tamponada con fosfato (PBS) en _H2O (1 tableta por 200 ml de _H2O) para preparar 1x PBS. Autoclave la solución y guárdela a temperatura ambiente (RT).
   2. Disolver 2 g de gránulos de NaOH en 50 mL de _H2O para preparar 1 M de NaOH.
   3. Prepare existencias de 0,1 M, 1 M, 5 M y 10 M KOH para la calibración del pH.
   4. Agregue 14.612 g de EDTA a 70 ml de _H2O. Agregue gránulos de NaOH hasta que el pH alcance 8.0 para que el EDTA se disuelva por completo. Agregue _H2O quantum satis (QS) a 100 ml. Autoclave la solución resultante de EDTA de 0,5 M (pH 8) y guárdela en RT.
   5. Agregue 19 g de EGTA a 70 ml de _H2O. Agregue gránulos de NaOH hasta que el pH alcance 8.0 para permitir que el EGTA se disuelva por completo. Agregue _H2O QS a 100 ml. Autoclave la solución resultante de EGTA (pH 8) de 0,5 M y guárdela en RT.
   6. Agregue 2 ml de 0,5 m de EDTA a 98 ml de PBS. Almacene la solución EDTA/PBS de 10 mM resultante en RT.
   7. Disuelva 5.958 g de HEPES en 40 mL _H2O. Ajuste el pH a 7.2 con KOH y QS a 50 mL con _H2O. Filtre el búfer HEPES resultante de 0.5 M a través de una malla de 0.45 μm y guárdelo en RT.
   8. Disuelva 3.402 g de _KH2PO4 en hasta 50 mL de _H2O. Filtre la solución _KH2PO4 de 0.5 M resultante a través de una malla de 0.45 μm y guárdela en RT.
   9. Disolver 9.521 g de _MgCl2 anhidro en hasta 100 mL de _H2O. Autoclave la solución resultante de 1 M _MgCl2 y guárdela en RT.
      NOTA: Como se trata de una reacción exotérmica, proceda con precaución y disuelva el _MgCl2 en hielo.
2. Preparar soluciones madre de sustrato e inhibidores (ver Tabla 1). Alícuota y guárdalos a -20 °C. Evite los ciclos de congelación-descongelación. Como excepción, siempre prepare ácido pirúvico inmediatamente antes de su uso.
   1. Preparar en _H2O ultrapuro: 0.5 M de succinato, 0.5 M de ácido pirúvico, 0.5 M de ácido málico, 100 mM de ADP, 1 M de ácido ascórbico y 50 mM de N,N,N′,N′-tetrametil-para-fenileno-diamina (TMPD) (proteger de la luz).
   2. Preparar en 100% dimetilsulfóxido (DMSO): 50 mM palmitoil-L-carnitina, 4 mM de rotenona, 20 mM de cianuro de carbonilo-p-trifluorometoxifenilhidrazona (FCCP), 4 mM de oligomicina y 5 mM de antimicina A.
      NOTA: No exceda la concentración final de DMSO del 0,1% en los pozos de microplacas. Por lo tanto, prepare soluciones de stock altamente concentradas para mantenerse por debajo de este límite.
3. Prepare los tampones para el aislamiento de mitocondrias y la cuantificación de proteínas recién el día del experimento. Use _H2O ultrapuro en todos los casos y mantenga todos los tampones en hielo a menos que se indique lo contrario.
   NOTA: Para ahorrar tiempo, todos los reactivos se pueden pesar y mantener en los recipientes apropiados (por ejemplo, tubos de 15 ml) a la temperatura adecuada el día anterior.
   1. Para preparar 10% de ácidos grasos libres (FFA) BSA, disuelva completamente 150 mg de FFA BSA en 1.5 ml de _H2O por inversión / rueda giratoria. No vórtice para evitar la formación de espuma.
   2. Para preparar 1x reactivo Bradford, diluya la solución de stock comercial 5x con _H2O y manténgala en la oscuridad en RT.
   3. Para preparar 8x Mitochondria Buffer (MB), disuelva 4.112 g de sacarosa y 763 mg de HEPES en 15 mL de _H2O. Ajuste el pH a 7.2, agregue 1.6 mL de 10% FFA BSA y QS a 20 mL con _H2O.
   4. Para preparar 20 ml de tampón de aislamiento 1 (IB1) (4 ml utilizados por muestra), disuelva 400 μL de 0,5 M de EDTA, 784 mg de D-manitol y 2,5 ml de 8x MB en 15 ml de _H2O. Ajuste el pH a 7,2 y QS con _H2O.
   5. Para preparar 5 ml de isolation buffer 2 (IB2) (500 μL utilizados por muestra), disuelva 30 μL de 0,5 M de EGTA, 196 mg de D-manitol y 625 μL de 8x MB en 4 mL de _H2O. Ajuste el pH a 7,2 y QS con _H2O.
   6. Para preparar 5 ml de tampón de resuspensión (RB) (200 μL utilizados por muestra), disuelva 120 mg de sacarosa, 191,3 mg de D-manitol, 50 μL de 0,5 M HEPES y 10 μL de 0,5 M de EGTA en 4 ml de _H2O. Ajuste el pH a 7,2 y QS con _H2O.
   7. Para preparar 2x Solución de Ensayo Mitocondrial-1 (MAS-1), disolver 1.199 g de sacarosa, 2.8 g de manitol, 1 mL de 0.5 M _KH2PO4, 250 μL de 1 M _MgCl2, 200 μL de 0.5 M HEPES y 100 μL de 0.5 M EGTA en 20 mL de _H2O. Ajuste el pH a 7.2 y QS a 25 mL con _H2O. Mantener en hielo por períodos cortos. Durante períodos más largos, manténgalo a 4 ° C para evitar precipitaciones.
   8. Para preparar 1x medio de ensayo de acoplamiento (CAM), prepare dos tampones diferentes basados en MAS-1: 1) CAM + BSA para el ensayo de CA propiamente dicho, y 2) CAM-BSA para preparar los inhibidores del ensayo. Mantenga siempre la proporción piruvato:malato en 10:1.
      NOTA: Como BSA puede obstruir los puertos de inyección, diluya los inhibidores en CAM libre de BSA.
      1. Para preparar CAM+BSA, diluya 300 μL de ácido pirúvico 0,5 M, 30 μL de ácido málico 0,5 M y 7,5 ml de 2x MAS-1 en 6 mL de _H2O. Ajuste el pH a 7,2. Añadir 300 μL de FFA BSA y QS al 10% a 15 mL con _H2O.
      2. Para preparar CAM-BSA, diluya 120 μL de ácido pirúvico 0.5 M, 12 μL de ácido málico 0.5 M y 3 mL de 2x MAS-1 en 2 mL de _H2O. Ajuste el pH a 7.2 y QS a 6 mL con _H2O.
   9. Para preparar 1x medio de ensayo de flujo de electrones (EFAM), prepare búferes EFAM que contengan BSA y que no contengan BSA.
      1. Para preparar EFAM+BSA, diluya 300 μL de ácido pirúvico 0,5 M, 60 μL de ácido málico 0,5 M, 3 μL de 20 mM FCCP y 7,5 mL de 2x MAS-1 en 6 mL de _H2O. Ajuste el pH a 7,2. Añadir 300 μL de FFA BSA y QS al 10% a 15 mL con _H2O.
      2. Para preparar EFAM-BSA, diluya 120 μL de ácido pirúvico 0,5 M, 24 μL de ácido málico 0,5 M, 1,2 μL de 20 mM FCCP y 3 mL de 2x MAS-1 en 2 mL de _H2O. Ajuste el pH a 7,2 y QS a 6 mL con _H2O.
   10. Para preparar 1x medio de β oxidación (BOXM), prepare soluciones BOXM que contengan BSA y no contengan BSA.
       1. Para preparar BOXM+BSA, diluya 12 μL de 50 mM de palmitoil-L-carnitina, 30 μL de ácido málico 0,5 M y 7,5 mL de 2x MAS-1 en 7 mL de _H2O. Ajuste el pH a 7,2. Añadir 300 μL de FFA BSA y QS al 10% a 15 mL con _H2O.
       2. Para preparar BOXM-BSA, diluya 4.8 μL de 50 mM de palmitoil-L-carnitina, 12 μL de ácido málico 0.5 M y 3 mL de 2x MAS-1 en 2 mL de _H2O. Ajuste el pH a 7.2 y QS a 6 mL con _H2O.

2. Disección muscular, homogeneización y aislamiento mitocondrial

1. Coloque todos los materiales y amortiguadores sobre hielo. Asegúrese de que todos los materiales estén helados durante todo el procedimiento para proteger las mitocondrias del daño.
2. Coloque tres vasos de precipitados de 50 ml por muestra en hielo y agregue las siguientes soluciones: 10 ml de PBS en el vaso de precipitados 1, 10 ml de 10 mM de EDTA/PBS en el vaso de precipitados 2 y 4 ml de IB1 en el vaso de precipitados 3.
3. Eutanasiar al ratón por luxación cervical. Evite la eutanasia de _CO2 , ya que los músculos esqueléticos podrían volverse hipóxicos, lo que interfiere con los análisis de respiración.
4. Rocíe la extremidad posterior derecha con etanol al 70% para evitar que la piel se desprenda, y tape la extremidad a la tabla de disección de corcho. Pegue con cinta adhesiva la extremidad anterior izquierda también.
5. Haga una incisión con un bisturí desechable estéril a través de la piel desde la rodilla hasta los pies.
6. Agarre la piel con pinzas dentadas a la altura del tobillo y córtela con tijeras finas alrededor del tobillo.
7. Alivie la piel de la musculatura subyacente con pinzas de punta fina en una mano mientras la levanta con pinzas dentadas en la otra mano.
8. Diseccionar todos los músculos esqueléticos desde el tobillo hasta la rodilla (Figura 2).
   1. Retire todo el tejido conectivo sobre el músculo tibial anterior (TA) para facilitar la extracción muscular con pinzas finas y tijeras.
   2. Encuentre los cuatro tendones distales del músculo EDL y seccionarlos cerca de sus inserciones en los dedos de los pies. Localiza el tendón distal TA y córtalo cerca de su inserción, siempre por debajo del tobillo.
   3. Tire con cuidado de los tendones TA y EDL por encima del tobillo para liberar los cabos sueltos.
   4. Agarre los extremos sueltos de los tendones y alivie los músculos del resto de la musculatura y los huesos tirando de ellos hacia arriba. Use pinzas finas o tijeras para facilitar el proceso. Proceda con cuidado para evitar la contracción de miofibra.
   5. Cortar el tendón proximal de la EDL y el músculo TA lo más cerca posible de la rótula.
   6. Gire el ratón boca abajo para proceder con la extracción del músculo gastrocnemio (GA) y sóleo.
   7. Agarre el bolsillo formado entre el bíceps femoral y el GA con pinzas dentadas. Use tijeras finas para separar estos músculos y visualizar el tendón GA proximal.
   8. Agarre el tendón de Aquiles con fórceps finos y córtelo cuidadosamente con tijeras finas. Libere los músculos GA y sóleo del hueso subyacente tirando de ellos hacia arriba a través de sus tendones. Cortar el tendón GA proximal liberándolo junto con el sóleo subyacente.
   9. Diseccione cuidadosamente los músculos restantes de tendón a tendón siguiendo el mismo procedimiento hasta que solo queden huesos.
   10. Vuelva a fijar el ratón en la posición inicial para diseccionar el músculo cuádriceps.
   11. Deseche el tejido adiposo sobre los cuádriceps en el lado proximal usando pinzas dentadas y tijeras finas.
   12. Inserte pinzas finas entre los cuádriceps y el fémur y muévalos en ambas direcciones a lo largo del eje del fémur para separar el músculo del hueso.
   13. Agarre los tendones musculares distales del cuádriceps con pinzas dentadas y corte el tendón con tijeras finas lo más cerca posible de la rótula.
   14. Tire del cuádriceps hacia arriba y suéltelo en la inserción proximal con tijeras finas.
9. Repita los pasos 4-8 de esta sección con la extremidad posterior izquierda.
10. Enjuague todos los músculos en Beaker 1 primero y luego en Beaker 2.
11. Transfiera todos los músculos a Beaker 3 y pice finamente todos los músculos con tijeras afiladas en hielo.
12. Transfiera la suspensión a un tubo C (tapa púrpura), manteniéndola siempre en hielo.
13. Cierre firmemente el tubo C y colóquelo boca abajo en la manga del homogeneizador. Asegúrese de que el material de la muestra esté en el área del rotador/estator. Seleccione el programa de 1 minuto llamado m_mito_tissue_01.
14. Divida el homogeneizado en dos tubos de microcentrífuga preclasificados de 2 ml y centrífuga a 700 × g durante 10 min a 4 °C en una centrífuga de mesa.
15. Transfiera los sobrenadantes a nuevos tubos preenrollados de 2 ml, evitando cuidadosamente la grasa y el tejido no homogeneizado. Almacene los gránulos a -80 °C para la determinación de la pureza de la fragmentación (fracción N) (Figura 3).
16. Centrifugar los sobrenadantes a 10.500 × g durante 10 min a 4 °C.
17. Transfiera los sobrenadantes a nuevos tubos preenrollados de 2 ml y etiquételos como Sobrenadante número 1 (SN1). Guárdelos a -80 °C para determinar la pureza de la fragmentación (Figura 3).
18. Resuspendir y combinar ambos pellets en un volumen total de 500 μL de IB2 en hielo.
19. Centrifugadora a 10.500 × g durante 10 min a 4°C.
20. Transfiera el sobrenadante a un nuevo tubo prehilado de 2 ml y etiquételo como Sobrenadante número 2 (SN2). Guárdelo a -80 °C para la determinación de la pureza de la fragmentación (Figura 3).
21. Resuspend el pellet mitocondrial final en 200 μL de RB. Reserve rápidamente 10 μL para la cuantificación de proteínas e inmediatamente agregue 10 μL de FFA BSA al 10% a la suspensión mitocondrial restante para evitar daños.
22. Determinar la concentración de proteínas utilizando el ensayo de Bradford.
    1. Para la curva estándar, prepare 30 μL de diluciones en serie de concentración conocida de una proteína en tampón RB. Por ejemplo, use 1 mg/ml, 0.5 mg/ml, 0.25 mg/ml, 0.125 mg/ml, 0.0625 mg/ml y 0 mg/ml de BSA.
    2. Preparar diluciones seriadas 1:3 y 1:6 de las muestras mitocondriales en tampón RB.
    3. En una placa de fondo plano de 96 pocillos, primero cargue 2,5 μL de muestra/estándar por pozo. A continuación, agregue 10 μL de 1 M de NaOH a cada muestra y, finalmente, 200 μL de 1x reactivo bradford. Mezclar bien, evitando burbujas de aire. Compruebe visualmente que el color de las muestras está dentro de la línea de calibración. Realizar siempre el análisis por triplicado.
    4. Incubar las placas durante 5 min a RT en la oscuridad y leer la absorbancia a 595 nm en un espectrofotómetro de microplacas.
    5. Calcule la curva estándar trazando los valores de absorbancia (eje y) frente a la concentración de proteína correspondiente de las diluciones preparadas en el paso 22.1 de esta sección (eje x).
    6. Calcular la cantidad total de proteína en las muestras mitocondriales por extrapolación con la curva estándar.

3. Preparación de los ensayos respirométricos basados en microplacas

1. Hidratar el sensor de ensayo respirométrico al menos 12 h antes del experimento con 1 ml de tampón de calibración por pozo. Incubar a 37 °C (sin _CO2).
   NOTA: Los sensores hidratados se pueden utilizar hasta 72 h. El cartucho debe manipularse con cuidado durante este paso: si algo toca los sensores, la sensibilidad de medición podría verse afectada.
2. Prechill la centrífuga preparativa con el rotor de microplaca de cucharón oscilante y los adaptadores de microplaca correspondientes a 4 °C.
3. Encienda la computadora, abra el software de análisis y seleccione el protocolo deseado.
   NOTA: Se escucha un clic cuando el software se conecta al instrumento de medición del consumo de oxígeno. El sensor de calentamiento debe estar verde y a 37 °C antes de que comience el experimento.
4. Preparar las soluciones inhibidoras a partir de las cepas indicadas en la sección 1, paso 2 según el ensayo a realizar. Prepare suficiente volumen para cada solución. Véanse la Tabla 1 y la Tabla 2 para referencia.
5. Agregue el volumen apropiado de cada inhibidor en cada puerto, inserte el cartucho en el instrumento de medición del consumo de oxígeno e inicie la calibración.
   NOTA: La adición del inhibidor al cartucho y la inserción del cartucho en el instrumento tarda entre 15 y 20 minutos. Asegúrese de que se introducen los componentes correctos del cartucho. La tapa del cartucho y el refuerzo hidráulico podrían desecharse mientras se necesitan el cartucho del sensor y el lugar de utilidad.
6. Centrifugar la suspensión mitocondrial concentrada de la sección 2, paso 21 a 10.500 × g durante 10 min a 4 °C.
7. Resuspender el pellet mitocondrial en 100 μL de 1x CAM+BSA, 1x EFAM+BSA, o 1x BOXM+BSA, dependiendo del protocolo a realizar.
8. Diluir aún más la muestra mitocondrial concentrada a una concentración final de 0,2 μg/μL en el medio de ensayo correspondiente.
9. Sembrar 50 μL de la suspensión (total 10 μg de proteína) por pocillo en una microplaca precultada de 24 pocillos sobre hielo. No agregue mitocondrias en los pozos de corrección de fondo; sólo agregue el medio de ensayo correspondiente. Almacene la suspensión mitocondrial restante a -80 °C para la determinación de la pureza de la fragmentación (Figura 3).
10. Girar la microplaca en la centrífuga preparativa prechilled a 2.000 × g durante 20 min a 4 °C. Contrapeso para equilibrar en consecuencia.
11. Caliente el medio de ensayo restante a 37 °C durante la centrifugación de microplacas.
12. Después de la centrifugación, deje la microplaca en el banco durante 5 minutos para equilibrar. Añadir 450 μL de medio de ensayo caliente para un volumen final de 500 μL por pocillo en RT. Haga esto lenta y cuidadosamente, agregando el medio a la pared de los pozos para evitar desprenderse de las mitocondrias.
13. Coloque la microplaca inmediatamente en el instrumento de medición del consumo de oxígeno sin la tapa e inicie el protocolo (Tabla 3). Asegúrese de que el primer paso sea una incubación de 10 minutos para permitir que la microplaca se caliente.
14. Una vez finalizado el experimento, retire el cartucho y la microplaca, apague el instrumento y comience el análisis.

4. Análisis de los resultados

1. En el caso de los ensayos CA y BOX, realice los siguientes análisis:
   1. Registrar el consumo de _O2 no mitocondrial, que corresponde a la media de los valores obtenidos tras la inyección de Antimicina A y rotenona.
      NOTA: La antimicina A y la rotenona son inhibidores del complejo III e I, respectivamente.
   2. Calcular la respiración basal restando el consumo de _O2 no mitocondrial de los valores basales (puntos de medición 1 y 2).
   3. Reste el consumo de _O2 no mitocondrial de los valores posteriores a la inyección del sustrato complejo V ADP (inyección A) para determinar el estado mitocondrial III.
   4. Reste el consumo de _O2 no mitocondrial de los valores de respiración después de la inyección del inhibidor del complejo V oligomicina (inyección B) para obtener el estado mitocondrial IVo.
   5. Calcular el estado mitocondrial IIIu deduciendo el consumo de _O2 no mitocondrial de la respiración después de la inyección de FCCP (inyección C).
      NOTA: FCCP es un potente desacoplador de fosforilación oxidativa mitocondrial. La síntesis de ATP se omite en su presencia, y el ETC alcanza la máxima actividad.
   6. Reste los valores de respiración basal de los valores de IIIu del estado mitocondrial para obtener la capacidad excedentaria mitocondrial, que es la capacidad de generar ATP adicional en caso de aumento de la demanda de energía.
   7. Dividir el estado mitocondrial IIIu por valores de IVo de estado para obtener la Relación de Control Respiratorio (RCR).
      NOTA: Los valores negativos o nulos de RCR indican que el acoplamiento mitocondrial está afectado.
2. En referencia a la EPT, realice los siguientes cálculos:
   1. Obtener actividad residual calculando el valor medio después de la inyección de rotenona y antimicina A (inyecciones A y C).
   2. Calcular la actividad del complejo I al IV (CI-CIV) restando la actividad residual de los valores basales (puntos de medición 1 y 2).
   3. Reste la actividad residual de los valores posteriores a la inyección del sustrato CII succinato (inyección B) para obtener la actividad CII-CIII-CIV.
   4. Calcular la actividad CIV deduciendo la actividad residual de los valores obtenidos tras la inyección de los agentes reductores del citocromo c, ácido ascórbico y TMPD (inyección D).
3. Representar todos los resultados utilizando gráficos de barras, como en la Figura 4, para extraer las conclusiones apropiadas.

Resultados

El protocolo aquí presentado permite el análisis in vivo de la respiración mitocondrial a través del aislamiento de mitocondrias del músculo esquelético de ratón. En la Figura 1 se muestra un esquema del método. Después de diseccionar los músculos esqueléticos de las extremidades posteriores (Figura 2), los tejidos se homogeneizan y las mitocondrias se purifican, en condiciones isotónicas, a través de centrifugaciones en serie. La pureza de...

Discusión

Todos los métodos utilizados para estudiar la respiración mitocondrial tienen sus limitaciones; por lo tanto, es crucial seleccionar el método que mejor se adapte a una pregunta experimental específica. Este trabajo proporciona un protocolo actualizado y detallado para aislar las mitocondrias del músculo esquelético del ratón para realizar diferentes ensayos respiratorios para investigar la función mitocondrial. De hecho, el estudio de la bioenergética mitocondrial en mitocondrias aisladas utilizando tecnología...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
ADP	Sigma	A5285	Stock at -20 °C
AKT antibody	Cell Signaling Technology	C67E7	Rabbit (Host species)
anti-Goat HRP	Sigma	401504	Rabbit (Host species)
anti-Mouse HRP	Cell Signaling	#7076	Horse (Host species)
Antimycin A	Sigma	A8674	Stock at -20 °C
anti-Rabbit HRP	Cell Signaling	#7074	Goat (Host species)
Ascorbic acid	Sigma	A5960	Stock at RT
Bactin antibody	Sigma	MBS4-48085	Goat (Host species)
Bio-Rad Protein Assay Kit II	Bio-Rad	5000002	It includes 5x Bradford reagent and BSA of known concentration for the standard curve
BSA, fraction V, Fatty Acid-Free	Calbiochem	126575	Stock at 4 °C
C tube	Miltenyi Biotec	130-093-237	Purple lid
Calnexin antibody	ThermoFisher	MA3-027	Mouse (Host species)
D-mannitol	Sigma	M4125	Stock at RT
EDTA	BDH	280254D	Stock at 4 °C
EGTA	Sigma	E-4378	Stock at RT
FCCP	Sigma	C2920	Stock at -20 °C
gentleMACS Dissociator	Miltenyi Biotec	130-093-235	Homogenizer
HEPES	Sigma	H3375	Stock at RT
HSP70 antibody	Proteintech	10995-1-AP	Rabbit (Host species)
LDH-A antibody	Santa Cruz Biotechnology	SC27230	Goat (Host species)
Magnesium chloride	ChemCruz	sc-255260A	Stock at RT
Malic acid	Sigma	P1645	Stock at RT
Microplate spectrophotometer	BMG LABTECH GmbH	POLARstar OMEGA S/N 415-0292	Stock at RT
Milli-Q water	Millipore system	F7HA17757A	Ultrapure water
mtTFA antibody	Santa Cruz Biotechnology	SC23588	Goat (Host species)
Na+/K+-ATPase α1 antibody	Novus Biologicals	NB300-14755	Mouse (Host species)
Oligomycin	Sigma	O4876	Stock at -20 °C
Palmitoyl-L-carnitine	Sigma	P1645	Stock at -20 °C
PBS tablets	Sigma	P4417-100TAB	1x stock at RT
Potassium dihydrogen phosphate	ChemCruz	sc-203211	Stock at RT
Potassium hydroxide	Sigma	60377	Stock at RT
Pyruvic acid	Sigma	107360	Stock at 4 °C
Rotenone	Sigma	R8875	Stock at -20 °C
Seahorse XF24 mitochondrial flux analyzer	Agilent Technologies	420179	XFe24 model
Seahorse XFe24 FluxPak mini	Agilent Technologies	102342-100	The kit includes cartridges, microplates, and calibrant solution
Succinate	Sigma	S7626	Stock at RT
Sucrose	Sigma	S9378	Stock at RT
TIMM23 antibody	Abcam	ab230253	Rabbit (Host species)
TMPD	Sigma	T7394	Stock at -20 °C
TOMM20 antibody	Abcam	ab56783	Mouse (Host species)
VDAC antibody	Abcam	ab15895	Rabbit (Host species)