Isolamento dei mitocondri dal muscolo scheletrico del topo per saggi respirometrici

Riepilogo

Qui, descriviamo un metodo dettagliato per l'isolamento dei mitocondri dal muscolo scheletrico del topo e la successiva analisi della respirazione mediante Oxygen Consumption Rate (OCR) utilizzando saggi respirometrici basati su micropiastre. Questa pipeline può essere applicata per studiare gli effetti di molteplici interventi ambientali o genetici sul metabolismo mitocondriale.

Abstract

La maggior parte dell'energia della cellula è ottenuta attraverso la degradazione di glucosio, acidi grassi e amminoacidi da diversi percorsi che convergono sul sistema di fosforilazione ossidativa mitocondriale (OXPHOS), che è regolato in risposta alle richieste cellulari. La molecola lipidica Coenzima Q (CoQ) è essenziale in questo processo trasferendo elettroni al complesso III nella catena di trasporto degli elettroni (ETC) attraverso cicli di ossidazione/riduzione costanti. Lo stato dei mitocondri e, in definitiva, la salute cellulare possono essere valutati misurando il consumo di ossigeno ETC utilizzando saggi respirometrici. Questi studi vengono in genere eseguiti in linee cellulari stabilite o primarie che sono state coltivate per diversi giorni. In entrambi i casi, i parametri respiratori ottenuti possono aver deviato dalle normali condizioni fisiologiche in un dato organo o tessuto.

Inoltre, le caratteristiche intrinseche delle singole fibre coltivate isolate dal muscolo scheletrico impediscono questo tipo di analisi. Questo documento presenta un protocollo aggiornato e dettagliato per l'analisi della respirazione nei mitocondri appena isolati dal muscolo scheletrico del topo. Forniamo anche soluzioni a potenziali problemi che potrebbero sorgere in qualsiasi fase del processo. Il metodo qui presentato potrebbe essere applicato per confrontare i tassi di consumo di ossigeno in diversi modelli murini transgenici e studiare la risposta mitocondriale ai trattamenti farmacologici o ad altri fattori come l'invecchiamento o il sesso. Questo è un metodo fattibile per rispondere a domande cruciali sul metabolismo e la regolazione della bioenergetica mitocondriale.

Introduzione

I mitocondri sono i principali organelli metabolici nella ^cellula1. Questi organelli specializzati racchiusi in membrana utilizzano molecole nutritive per produrre energia sotto forma di adenosina trifosfato (ATP) da OXPHOS. Questo processo si basa sul trasferimento di elettroni da molecole donatrici in una serie di reazioni redox nell'ETC2. Il CoQ è l'unico lipide redox-attivo prodotto endogenamente in tutte le membrane cellulari e nelle lipoproteine circolanti che mostra una funzione ^{antiossidante3}. È un componente essenziale dell'ETC, trasferendo elettroni dal complesso I dipendente dal NADH e dal complesso II _{FADH2-dipendente} al complesso III, sebbene molte altre reduttasi possano guidare la riduzione del CoQ mitocondriale all'ubichinolo come passaggio obbligatorio in più vie metaboliche ^cellulari4,5.

Durante tutto il processo, viene creato un gradiente protonico elettrochimico attraverso la membrana interna mitocondriale, che viene trasformata in energia biologicamente attiva dal complesso ATP sintasi ^V2. Di conseguenza, la disfunzione mitocondriale porta a una miriade di condizioni patologiche che colpiscono principalmente i tessuti con elevato fabbisogno energetico: cervello, cuore e muscolo ^{scheletrico6,7}. Pertanto, è fondamentale sviluppare metodi per analizzare accuratamente la bioenergetica mitocondriale per indagare il suo ruolo nella salute e nella malattia, in particolare nei tessuti altamente energetici come i muscoli scheletrici.

L'elettrodo di ossigeno di tipo Clark è stato utilizzato classicamente nello studio della respirazione mitocondriale8. Tuttavia, questo sistema è stato progressivamente sostituito da tecnologie ad alta risoluzione, con tecnologie di consumo di ossigeno basate su micropiastre come gli analizzatori Agilent Seahorse XF che sono particolarmente ^popolari9. Nel campo del muscolo scheletrico, questi studi sono tipicamente condotti in cellule in coltura, principalmente nella linea cellulare di mioblasti di topo immortalizzati C2C12 o in colture primarie derivate da cellule ^{satelliti10,11}. Tuttavia, questi studi non ricapitolano completamente la situazione in vivo, specialmente quando si indaga la biologia mitocondriale e la funzione a livello tissutale su insulti specifici, interventi non genetici o manipolazioni genetiche.

Inoltre, i saggi respiratori nelle cellule sono più complessi a causa di fattori aggiuntivi, tra cui la domanda extra-mitocondriale di ATP e substrati di analisi o eventi di segnalazione, che potrebbero fuorviare l'interpretazione dei risultati. In alternativa, è anche possibile utilizzare singoli o fasci di miofibre appena isolate dai muscoli. Tuttavia, il metodo di isolamento è tecnicamente impegnativo e fattibile solo per alcuni tipi di muscoli. In questo caso, i muscoli flessori digitorum brevis (FDB) ed estensori digitorum longus (EDL) sono principalmente ^{utilizzati10,12,13}, anche se alcuni rapporti descrivono l'uso di altri tipi di ^muscoli14,15.

È stato riportato anche il profilo bioenergetico delle sezioni del muscolo ^{scheletrico16}. Il principale vantaggio di questo metodo è che i muscoli intatti possono essere studiati (gli autori dimostrano che affettare le fibre non disturba i risultati rispetto alle miofibre isolate). Tuttavia, l'accesso mitocondriale ai substrati e agli inibitori del saggio è limitato e, pertanto, è possibile misurare solo pochi ^parametri16. Infine, possono essere impiegati anche mitocondri isolati9,17,18,19. In questo caso, i mitocondri perdono il loro ambiente citosolico, che potrebbe influenzare la loro funzione. Al contrario, questo metodo garantisce l'accesso a substrati e inibitori, consente l'analisi di una pletora di tipi di campioni e in genere richiede meno materiale.

Questo articolo descrive un metodo per eseguire il profilo bioenergetico di mitocondri isolati dal muscolo scheletrico del topo utilizzando saggi respirometrici basati su micropiastre (Figura 1). In particolare, vengono dettagliati tre protocolli: il Coupling Assay, CA per valutare il grado di accoppiamento tra l'ETC e il macchinario OXPHOS; l'Electron Flow Assay, EFA per misurare l'attività dei singoli complessi ETC; e il test BOX per determinare la capacità di β-ossidazione mitocondriale. In particolare, sono necessarie solo piccole quantità di campioni rispetto ai metodi di respirometria convenzionali. Il protocollo di isolamento qui utilizzato è stato modificato dal metodo pubblicato ^altrove18.

Protocollo

L'alloggiamento del topo e la raccolta dei tessuti sono stati eseguiti utilizzando protocolli approvati dal Comitato Etico dell'Universidad Pablo de Olavide (Siviglia, Spagna; protocolli 24/04/2018/056 e 12/03/2021/033) in conformità con il Regio Decreto Spagnolo 53/2013, la Direttiva Europea 2010/63/UE e altre linee guida pertinenti.

1. Preparazione delle scorte, dei tamponi e dei reagenti per i saggi respiratori

1. Preparare le seguenti soluzioni stock, che possono essere conservate alla temperatura indicata per mesi. Utilizzare _H2O ultrapuro in tutti i casi.
   1. Sciogliere le compresse saline tamponate con fosfato (PBS) in _H2O (1 compressa per 200 ml di _H2O) per preparare 1x PBS. Autoclave della soluzione e conservarla a temperatura ambiente (RT).
   2. Sciogliere 2 g di pellet NaOH in 50 mL di _H2O per preparare 1 M NaOH.
   3. Preparare scorte KOH da 0,1 M, 1 M, 5 M e 10 M per la calibrazione del pH.
   4. Aggiungere 14,612 g di EDTA a 70 ml di _H2O. Aggiungere pellet di NaOH fino a quando il pH raggiunge 8,0 in modo che l'EDTA si dissolva completamente. Aggiungere _H2O quantum satis (QS) a 100 mL. Autoclave della soluzione edTA (pH 8) risultante da 0,5 M e conservarla a RT.
   5. Aggiungere 19 g di EGTA a 70 mL di _H2O. Aggiungere pellet di NaOH fino a quando il pH raggiunge 8,0 per consentire all'EGTA di dissolversi completamente. Aggiungere _H2O QS a 100 ml. Autoclave della soluzione EGTA (pH 8) risultante da 0,5 M e conservarla a RT.
   6. Aggiungere 2 mL di 0,5 M EDTA a 98 mL di PBS. Conservare la soluzione EDTA/PBS da 10 mM risultante in RT.
   7. Sciogliere 5,958 g di HEPES in 40 mL _H2O. Regolare il pH a 7,2 con KOH e QS a 50 mL con _H2O. Filtrare il tampone HEPES da 0,5 M risultante attraverso una rete da 0,45 μm e conservarlo a RT.
   8. Sciogliere 3,402 g di _KH2PO4 in un massimo di 50 ml di _H2O. Filtrare la soluzione di _KH2PO4 da 0,5 M risultante attraverso una rete da 0,45 μm e conservarla a RT.
   9. Sciogliere 9,521 g di _MgCl2 anidro in un massimo di 100 ml di _H2O. Autoclave la soluzione risultante da 1 M _MgCl2 e conservarla a RT.
      NOTA: Poiché si tratta di una reazione esotermica, procedere con cautela e sciogliere _mgCl2 sul ghiaccio.
2. Preparare soluzioni stock di substrato e inibitori (vedere Tabella 1). Aliquotare e conservarli a -20 °C. Evitare cicli di congelamento-scongelamento. In via eccezionale, preparare sempre l'acido piruvico immediatamente prima dell'uso.
   1. Preparare in _H2O ultrapuro: 0,5 M succinato, 0,5 M acido piruvico, 0,5 M acido malico, 100 mM ADP, 1 M acido ascorbico e 50 mM N,N,N′,N′-tetrametil-para-fenilene-diammina (TMPD) (proteggere dalla luce).
   2. Preparare in 100% dimetilsolfossido (DMSO): 50 mM palmitoil-L-carnitina, 4 mM rotenone, 20 mM carbonile cianuro-p-trifluorometiossifenilidrozone (FCCP), 4 mM oligomicina e 5 mM Antimicina A.
      NOTA: non superare la concentrazione finale di DMSO dello 0,1% nei pozzetti micropiastre. Pertanto, preparare soluzioni stock altamente concentrate per rimanere al di sotto di questo limite.
3. Preparare i tamponi per l'isolamento dei mitocondri e la quantificazione delle proteine appena il giorno dell'esperimento. Utilizzare _H2O ultrapuro in tutti i casi e mantenere tutti i tamponi sul ghiaccio se non diversamente specificato.
   NOTA: Per risparmiare tempo, tutti i reagenti possono essere pesati e conservati negli appositi contenitori (ad esempio, tubi da 15 ml) alla giusta temperatura del giorno precedente.
   1. Per preparare il 10% di acidi grassi liberi (FFA) BSA, sciogliere completamente 150 mg di FFA BSA in 1,5 ml di _H2O mediante ruota di inversione/rotazione. Non vortice per evitare la formazione di schiuma.
   2. Per preparare 1x reagente Bradford, diluire la soluzione stock commerciale 5x con _H2O e tenerla al buio a RT.
   3. Per preparare 8x Mitochondria Buffer (MB), sciogliere 4,112 g di saccarosio e 763 mg di HEPES in 15 mL di _H2O. Regolare il pH a 7,2, aggiungere 1,6 mL di 10% FFA BSA e QS a 20 mL con _H2O.
   4. Per preparare 20 mL di Tampone di Isolamento 1 (IB1) (4 mL utilizzati per campione), sciogliere 400 μL di 0,5 M EDTA, 784 mg di D-mannitolo e 2,5 mL di 8x MB in 15 mL di _H2O. Regolare il pH a 7,2 e QS con _H2O.
   5. Per preparare 5 mL di tampone di isolamento 2 (IB2) (500 μL utilizzati per campione), sciogliere 30 μL di 0,5 M EGTA, 196 mg di D-mannitolo e 625 μL di 8x MB in 4 mL di _H2O. Regolare il pH a 7,2 e QS con _H2O.
   6. Per preparare 5 mL di tampone di risospensione (RB) (200 μL utilizzati per campione), sciogliere 120 mg di saccarosio, 191,3 mg di D-mannitolo, 50 μL di 0,5 M HEPES e 10 μL di 0,5 M EGTA in 4 mL di _H2O. Regolare il pH a 7,2 e QS con _H2O.
   7. Per preparare 2x Mitochondrial Assay Solution-1 (MAS-1), sciogliere 1,199 g di saccarosio, 2,8 g di mannitolo, 1 mL di 0,5 M _KH2PO4, 250 μL di 1 M _MgCl2, 200 μL di 0,5 M HEPES e 100 μL di 0,5 M EGTA in 20 mL di _H2O. Regolare il pH a 7,2 e QS a 25 mL con _H2O. Tenere in ghiaccio per brevi periodi. Per periodi più lunghi, tenerlo a 4 °C per evitare precipitazioni.
   8. Per preparare 1x Coupling Assay medium (CAM), preparare due diversi buffer basati su MAS-1: 1) CAM+BSA per il test CA vero e proprio e 2) CAM-BSA per la preparazione degli inibitori del saggio. Mantenere sempre il rapporto piruvato/malato a 10:1.
      NOTA: Poiché BSA può ostruire le porte di iniezione, diluire gli inibitori in CAM senza BSA.
      1. Per preparare CAM+BSA, diluire 300 μL di acido piruvico 0,5 M, 30 μL di acido malico 0,5 M e 7,5 mL di 2x MAS-1 in 6 mL di _H2O. Regolare il pH a 7,2. Aggiungere 300 μL di 10% FFA BSA e QS a 15 mL con _H2O.
      2. Per preparare CAM-BSA, diluire 120 μL di acido piruvico 0,5 M, 12 μL di acido malico 0,5 M e 3 mL di 2x MAS-1 in 2 mL di _H2O. Regolare il pH a 7,2 e QS a 6 mL con _H2O.
   9. Per preparare 1x Electron Flow Assay medium (EFAM), preparare sia tamponi EFAM contenenti BSA che BSA-free.
      1. Per preparare EFAM+BSA, diluire 300 μL di acido piruvico 0,5 M, 60 μL di acido malico 0,5 M, 3 μL di 20 mM FCCP e 7,5 mL di 2x MAS-1 in 6 mL di _H2O. Regolare il pH a 7,2. Aggiungere 300 μL di 10% FFA BSA e QS a 15 mL con _H2O.
      2. Per preparare EFAM-BSA, diluire 120 μL di acido piruvico 0,5 M, 24 μL di acido malico 0,5 M, 1,2 μL di 20 mM FCCP e 3 mL di 2x MAS-1 in 2 mL di _H2O. Regolare il pH a 7,2 e QS a 6 mL con _H2O.
   10. Per preparare 1x β-oxidation medium (BOXM), preparare soluzioni BOXM contenenti BSA e prive di BSA.
       1. Per preparare BOXM+BSA, diluire 12 μL di 50 mM di palmitoil-L-carnitina, 30 μL di acido malico 0,5 M e 7,5 mL di 2x MAS-1 in 7 mL di _H2O. Regolare il pH a 7,2. Aggiungere 300 μL di 10% FFA BSA e QS a 15 mL con _H2O.
       2. Per preparare BOXM-BSA, diluire 4,8 μL di 50 mM palmitoil-L-carnitina, 12 μL di acido malico 0,5 M e 3 mL di 2x MAS-1 in 2 mL di _H2O. Regolare il pH a 7,2 e QS a 6 mL con _H2O.

2. Dissezione muscolare, omogeneizzazione e isolamento mitocondriale

1. Posizionare tutti i materiali e i tamponi sul ghiaccio. Assicurarsi che tutti i materiali siano ghiacciati durante l'intera procedura per proteggere i mitocondri dai danni.
2. Posizionare tre becher da 50 mL per campione sul ghiaccio e aggiungere le seguenti soluzioni: 10 mL di PBS nel becher 1, 10 mL di 10 mM EDTA/PBS nel becher 2 e 4 mL di IB1 nel becher 3.
3. Eutanasia del topo per lussazione cervicale. Evitare l'eutanasia con _CO2 poiché i muscoli scheletrici potrebbero diventare ipossici, interferendo con le analisi della respirazione.
4. Spruzzare l'arto posteriore destro con etanolo al 70% per evitare che la pelliccia si spargi e nastro adesivo sul pannello di dissezione del sughero. Nastro adesivo anche sull'arto anteriore sinistro.
5. Fai un'incisione con un bisturi monouso sterile attraverso la pelle dal ginocchio ai piedi.
6. Afferrare la pelle con una pinza dentata all'altezza della caviglia e tagliarla con forbici sottili intorno alla caviglia.
7. Allontana la pelle dalla muscolatura sottostante con una pinzetta a punta fine in una mano mentre la tiri su con una pinza dentata nell'altra mano.
8. Sezionare tutti i muscoli scheletrici dalla caviglia al ginocchio (Figura 2).
   1. Rimuovere tutto il tessuto connettivo sopra il muscolo tibiale anteriore (TA) per facilitare l'estrazione muscolare utilizzando pinzette sottili e forbici.
   2. Trova i quattro tendini distali del muscolo EDL e sezionali vicino ai loro inserimenti nelle dita dei piedi. Individuare il tendine distale TA e tagliarlo vicino al suo inserimento, sempre sotto la caviglia.
   3. Tirare con attenzione i tendini TA ed EDL sopra la caviglia per liberare le estremità allentate.
   4. Afferrare le estremità sciolte dei tendini e facilitare i muscoli lontano dal resto della muscolatura e delle ossa tirandoli su. Utilizzare pinzette o forbici fini per facilitare il processo. Procedere con cautela per evitare la contrazione della miofibra.
   5. Tagliare il tendine prossimale dell'EDL e il muscolo TA il più vicino possibile alla rotula.
   6. Capovolgere il mouse per procedere con l'estrazione del muscolo gastrocnemio (GA) e del soleo.
   7. Afferrare la tasca formata tra il bicipite femorale e il GA con pinza dentata. Usa forbici fini per separare questi muscoli e visualizzare il tendine GA prossimale.
   8. Afferrare il tendine di Achille con una pinza fine e tagliarlo con cura con forbici fini. Rilascia i muscoli GA e soleus dall'osso sottostante tirandoli verso l'alto attraverso i loro tendini. Tagliare il tendine GA prossimale liberandolo insieme al soleo sottostante.
   9. Sezionare attentamente i muscoli rimanenti dal tendine al tendine seguendo la stessa procedura fino a quando rimangono solo le ossa.
   10. Ri-pin il mouse nella posizione iniziale per sezionare il muscolo quadricipite.
   11. Scartare il tessuto adiposo sopra il quadricipite sul lato prossimale usando pinze dentate e forbici fini.
   12. Inserire pinzette sottili tra il quadricipite e il femore e spostarle in entrambe le direzioni lungo l'asse del femore per separare il muscolo dall'osso.
   13. Afferrare i tendini muscolari del quadricipite distale con una pinza dentata e tagliare il tendine con forbici sottili il più vicino possibile alla rotula.
   14. Tirare il quadricipite verso l'alto e liberarlo all'inserzione prossimale con forbici fini.
9. Ripetere i passaggi da 4 a 8 di questa sezione con l'arto posteriore sinistro.
10. Risciacquare tutti i muscoli prima in Beaker 1 e poi in Beaker 2.
11. Trasferire tutti i muscoli a Beaker 3 e tritare finemente tutti i muscoli con forbici affilate sul ghiaccio.
12. Trasferire la sospensione su un tubo C (coperchio viola), mantenendola sempre in ghiaccio.
13. Chiudere ermeticamente il tubo C e fissarlo a testa in giù sul manicotto dell'omogeneizzatore. Assicurarsi che il materiale campione si trovi nell'area del rotatore/statore. Selezionare il programma di 1 minuto chiamato m_mito_tissue_01.
14. Dividere l'omogeneizzato in due tubi microcentrifuga prechilled da 2 mL e centrifugare a 700 × g per 10 minuti a 4 °C in una centrifuga da tavolo.
15. Trasferire i supernatanti in nuovi tubi prechilled da 2 ml, evitando accuratamente il tessuto grasso e non omogeneizzato. Conservare il pellet a -80 °C per la determinazione della purezza della frammentazione (frazione N) (Figura 3).
16. Centrifugare i supernatanti a 10.500 × g per 10 min a 4 °C.
17. Trasferire i supernatanti in nuovi tubi prechilled da 2 mL ed etichettarli come Supernatant Number 1 (SN1). Conservarli a -80 °C per la determinazione della purezza della frammentazione (Figura 3).
18. Sospendere e combinare entrambi i pellet in un volume totale di 500 μL di IB2 in ghiaccio.
19. Centrifugare a 10.500 × g per 10 min a 4°C.
20. Trasferire il surnatante in un nuovo tubo prechilled da 2 ml ed etichettarlo come Supernatant Number 2 (SN2). Conservare a -80 °C per la determinazione della purezza della frammentazione (Figura 3).
21. Risospendere il pellet mitocondriale finale in 200 μL di RB. Mettere rapidamente da parte 10 μL per la quantificazione delle proteine e aggiungere immediatamente 10 μL di FFA BSA al 10% alla sospensione mitocondriale rimanente per prevenire danni.
22. Determinare la concentrazione proteica utilizzando il test di Bradford.
    1. Per la curva standard, preparare 30 μL di diluizioni seriali di concentrazione nota di una proteina nel tampone RB. Ad esempio, utilizzare 1 mg / mL, 0,5 mg / mL, 0,25 mg / mL, 0,125 mg / mL, 0,0625 mg / mL e 0 mg / mL di BSA.
    2. Preparare le diluizioni seriali 1:3 e 1:6 dei campioni mitocondriali nel tampone RB.
    3. In una piastra a fondo piatto da 96 pozzetti, prima caricare 2,5 μL di campione/standard per pozzetto. Quindi, aggiungere 10 μL di 1 M NaOH a ciascun campione e, infine, 200 μL di 1x reagente Bradford. Mescolare bene, evitando bolle d'aria. Controllare visivamente che il colore dei campioni sia all'interno della linea di calibrazione. Eseguire sempre l'analisi in triplice copia.
    4. Incubare le piastre per 5 minuti a RT al buio e leggere l'assorbanza a 595 nm in uno spettrofotometro a micropiastre.
    5. Calcolare la curva standard tracciando i valori di assorbanza (asse y) rispetto alla corrispondente concentrazione proteica delle diluizioni preparate nel passaggio 22.1 di questa sezione (asse x).
    6. Calcola la quantità totale di proteine nei campioni mitocondriali estrapolando con la curva standard.

3. Preparazione dei saggi respirometrici basati su micropiastre

1. Idratare il sensore del saggio respirometrico almeno 12 ore prima dell'esperimento con 1 mL di tampone di calibrazione per pozzetto. Incubare a 37 °C (senza _CO2).
   NOTA: i sensori idratati possono essere utilizzati fino a 72 ore. La cartuccia deve essere maneggiata con attenzione durante questa fase: se qualcosa tocca i sensori, la sensibilità di misurazione potrebbe essere influenzata.
2. Prechill la centrifuga preparativa con il rotore a micropiastra a benna oscillante e i corrispondenti adattatori per micropiastre a 4 °C.
3. Accendere il computer, aprire il software di analisi e selezionare il protocollo desiderato.
   NOTA: quando il software si collega allo strumento di misurazione del consumo di ossigeno si sente un clic. Il sensore di riscaldamento deve essere verde e a 37 °C prima dell'inizio dell'esperimento.
4. Preparare le soluzioni inibitorie dalle scorte indicate nella sezione 1, fase 2 in base al saggio da eseguire. Preparare un volume sufficiente per ogni soluzione. Cfr . tabella 1 e tabella 2 per riferimento.
5. Aggiungere il volume appropriato di ciascun inibitore in ciascuna porta, inserire la cartuccia nello strumento di misurazione del consumo di ossigeno e avviare la calibrazione.
   NOTA: l'aggiunta di un inibitore alla cartuccia e l'inserimento della cartuccia nello strumento richiedono 15-20 minuti. Assicurarsi che siano stati introdotti i componenti della cartuccia corretti. Il coperchio della cartuccia e il booster idroelettrico potrebbero essere scartati mentre sono necessari la cartuccia del sensore e il posto di utilità.
6. Centrifugare la sospensione mitocondriale concentrata del tratto 2, fase 21 a 10.500 × g per 10 minuti a 4 °C.
7. Sospendere il pellet mitocondriale in 100 μL di 1x CAM+BSA, 1x EFAM+BSA o 1x BOXM+BSA, a seconda del protocollo da eseguire.
8. Diluire ulteriormente il campione mitocondriale concentrato a una concentrazione finale di 0,2 μg/μL nel mezzo di saggio corrispondente.
9. Seminare 50 μL della sospensione (totale 10 μg di proteine) per pozzetto in una micropiastra prechilled a 24 pozzetti su ghiaccio. Non aggiungere mitocondri nei pozzetti di correzione dello sfondo; aggiungere solo il mezzo di analisi corrispondente. Conservare la restante sospensione mitocondriale a -80 °C per la determinazione della purezza della frammentazione (Figura 3).
10. Ruotare la micropiastra nella centrifuga preparativa prechilled a 2.000 × g per 20 minuti a 4 °C. Contrappeso per bilanciare di conseguenza.
11. Riscaldare il mezzo di saggio rimanente a 37 °C durante la centrifugazione su micropiastre.
12. Dopo la centrifugazione, lasciare la micropiastra sul banco per 5 minuti per equilibrare. Aggiungere 450 μL di mezzo di saggio caldo per un volume finale di 500 μL per pozzetto a RT. Fallo lentamente e con attenzione, aggiungendo il mezzo alla parete dei pozzetti per evitare di staccare i mitocondri.
13. Posizionare immediatamente la micropiastra nello strumento di misurazione del consumo di ossigeno senza coperchio e avviare il protocollo (Tabella 3). Assicurarsi che il primo passo sia un'incubazione di 10 minuti per consentire alla micropiastra di riscaldarsi.
14. Una volta terminato l'esperimento, rimuovere la cartuccia e la micropiastra, spegnere lo strumento e avviare l'analisi.

4. Analisi dei risultati

1. Nel caso dei saggi CA e BOX, eseguire le seguenti analisi:
   1. Registrare il consumo nonmitocondriale di _O2 , che corrisponde alla media dei valori ottenuti dopo l'iniezione di antimicina A e rotenone.
      NOTA: Antimicina A e rotenone sono inibitori del complesso III e I, rispettivamente.
   2. Calcola la respirazione basale sottraendo il consumo di _O2 nonmitocondriale dai valori basali (punti di misurazione 1 e 2).
   3. Sottrarre il consumo nonmitocondriale di _O2 dai valori dopo l'iniezione del substrato V complesso ADP (iniezione A) per determinare lo stato mitocondriale III.
   4. Sottrarre il consumo nonmitocondriale di _O2 dai valori respiratori post iniezione dell'oligomicina inibitore del complesso V (iniezione B) per ottenere lo stato mitocondriale IVo.
   5. Calcolare lo stato mitocondriale IIIu deducendo il consumo nonmitocondriale di _O2 dalla respirazione dopo l'iniezione di FCCP (iniezione C).
      NOTA: FCCP è un potente disaccoppiatore di fosforilazione ossidativa mitocondriale. La sintesi di ATP viene bypassata in sua presenza e l'ETC raggiunge la massima attività.
   6. Sottrarre i valori di respirazione basale dai valori dello stato mitocondriale IIIu per ottenere la capacità di riserva mitocondriale, che è la capacità di generare ATP extra in caso di aumento della domanda di energia.
   7. Dividere lo stato mitocondriale IIIu per i valori di IVo di stato per ottenere il Respiratory Control Ratio (RCR).
      NOTA: valori RCR negativi o nulli indicano che l'accoppiamento mitocondriale è interessato.
2. In riferimento all'EFA, eseguire i seguenti calcoli:
   1. Ottenere l'attività residua calcolando il valore medio dopo l'iniezione di rotenone e antimicina A (iniezioni A e C).
   2. Calcolare l'attività del complesso da I a IV (CI-CIV) sottraendo l'attività residua dai valori basali (punti di misura 1 e 2).
   3. Sottrarre l'attività residua dai valori post iniezione del substrato CII succinato (iniezione B) per ottenere l'attività CII-CIII-CIV.
   4. Calcolare l'attività ciV deducendo l'attività residua dai valori ottenuti dopo l'iniezione degli agenti riducenti del citocromo c, dell'acido ascorbico e del TMPD (iniezione D).
3. Rappresentare tutti i risultati utilizzando grafici a barre, come nella Figura 4, per trarre conclusioni appropriate.

Risultati

Il protocollo qui presentato consente l'analisi in vivo della respirazione mitocondriale attraverso l'isolamento dei mitocondri dal muscolo scheletrico del topo. Una descrizione del metodo è illustrata nella Figura 1. Dopo aver sezionato i muscoli scheletrici dagli arti posteriori (Figura 2), i tessuti vengono omogeneizzati e i mitocondri purificati, in condizioni isotoniche, attraverso centrifugazioni seriali. La purezza delle diverse frazioni ottenut...

Discussione

Tutti i metodi utilizzati per studiare la respirazione mitocondriale hanno i loro limiti; quindi, è fondamentale selezionare il metodo che meglio si adatta a una specifica domanda sperimentale. Questo lavoro fornisce un protocollo aggiornato e dettagliato per isolare i mitocondri dal muscolo scheletrico del topo per eseguire diversi saggi respiratori per studiare la funzione mitocondriale. In effetti, lo studio della bioenergetica mitocondriale nei mitocondri isolati utilizzando tecnologie basate su micropiastre è prez...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
ADP	Sigma	A5285	Stock at -20 °C
AKT antibody	Cell Signaling Technology	C67E7	Rabbit (Host species)
anti-Goat HRP	Sigma	401504	Rabbit (Host species)
anti-Mouse HRP	Cell Signaling	#7076	Horse (Host species)
Antimycin A	Sigma	A8674	Stock at -20 °C
anti-Rabbit HRP	Cell Signaling	#7074	Goat (Host species)
Ascorbic acid	Sigma	A5960	Stock at RT
Bactin antibody	Sigma	MBS4-48085	Goat (Host species)
Bio-Rad Protein Assay Kit II	Bio-Rad	5000002	It includes 5x Bradford reagent and BSA of known concentration for the standard curve
BSA, fraction V, Fatty Acid-Free	Calbiochem	126575	Stock at 4 °C
C tube	Miltenyi Biotec	130-093-237	Purple lid
Calnexin antibody	ThermoFisher	MA3-027	Mouse (Host species)
D-mannitol	Sigma	M4125	Stock at RT
EDTA	BDH	280254D	Stock at 4 °C
EGTA	Sigma	E-4378	Stock at RT
FCCP	Sigma	C2920	Stock at -20 °C
gentleMACS Dissociator	Miltenyi Biotec	130-093-235	Homogenizer
HEPES	Sigma	H3375	Stock at RT
HSP70 antibody	Proteintech	10995-1-AP	Rabbit (Host species)
LDH-A antibody	Santa Cruz Biotechnology	SC27230	Goat (Host species)
Magnesium chloride	ChemCruz	sc-255260A	Stock at RT
Malic acid	Sigma	P1645	Stock at RT
Microplate spectrophotometer	BMG LABTECH GmbH	POLARstar OMEGA S/N 415-0292	Stock at RT
Milli-Q water	Millipore system	F7HA17757A	Ultrapure water
mtTFA antibody	Santa Cruz Biotechnology	SC23588	Goat (Host species)
Na+/K+-ATPase α1 antibody	Novus Biologicals	NB300-14755	Mouse (Host species)
Oligomycin	Sigma	O4876	Stock at -20 °C
Palmitoyl-L-carnitine	Sigma	P1645	Stock at -20 °C
PBS tablets	Sigma	P4417-100TAB	1x stock at RT
Potassium dihydrogen phosphate	ChemCruz	sc-203211	Stock at RT
Potassium hydroxide	Sigma	60377	Stock at RT
Pyruvic acid	Sigma	107360	Stock at 4 °C
Rotenone	Sigma	R8875	Stock at -20 °C
Seahorse XF24 mitochondrial flux analyzer	Agilent Technologies	420179	XFe24 model
Seahorse XFe24 FluxPak mini	Agilent Technologies	102342-100	The kit includes cartridges, microplates, and calibrant solution
Succinate	Sigma	S7626	Stock at RT
Sucrose	Sigma	S9378	Stock at RT
TIMM23 antibody	Abcam	ab230253	Rabbit (Host species)
TMPD	Sigma	T7394	Stock at -20 °C
TOMM20 antibody	Abcam	ab56783	Mouse (Host species)
VDAC antibody	Abcam	ab15895	Rabbit (Host species)